專利名稱：芒果苷元對ptp1b的抑制活性及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及芒果苷元對蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)的抑制活性、改善胰島素抵抗作用，及在制備治療II型糖尿病、肥胖等代謝綜合 征、腫瘤和其他PTPlB相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白酪氨酸的磷酸化水平是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因素，它由蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase, PTK)和蛋白酪氨酸憐酸酶(Protein tyrosinephosphatase, PTP)共同調(diào)控,PTPlB (Protein tyrosine phosphatase IB, PTP1B)屬于 PTP家族，是胰島素信號通路中重要的負調(diào)控因子并參與瘦素、多種生長因子、催乳素、整合素、血小板凝集素等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，與糖尿病、肥胖的胰島素抵抗和瘦素抵抗均有密切關(guān)系，與胰島素抵抗、肥胖、血脂代謝紊亂和高血壓等4個代謝綜合征主要危險因素顯著相關(guān)，在代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。PTPlB基因敲除小鼠胰島素敏感性顯著提高，而且能維持很好的糖穩(wěn)態(tài)。另外，PTPlB還能夠抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，與腫瘤細胞凋亡、血管生成有關(guān)，在乳腺和上皮細胞中催乳激素-泌乳刺激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起負調(diào)控作用。PTPlB已成為治療II型糖尿病、肥胖癥、乳腺癌等多種疾病新型、重要的藥物靶點，在防治代謝綜合征、腫瘤等疾病中起重要作用，對其抑制劑的研究也已經(jīng)成為目前的研究熱點。芒果苷兀(norathyriol,NL),全稱 1,3,6,7-四輕基口山酮(1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
0OH
Η 丫、.Z 夏丫,S
HO"" ''C、、,入、、#. " '、Η現(xiàn)代藥理研究表明，芒果苷元具有多種生理作用，如抗抑郁、抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、抗氧化及抑制結(jié)核桿菌生長等作用，其中抗炎作用的研究較為深入。但目前尚未見其抑制PTPIB、提高胰島素敏感性方面的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是致力于研究芒果苷元對蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制活性，為人們提供一種新的蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制劑，并通過研究芒果苷元對蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制活性，進一步擴展芒果苷元的藥物用途。為實現(xiàn)上述目的，申請人從以下幾個方面進行了研究I、建立蛋白酪氨酸磷酸酶抑制活性檢測的反應(yīng)體系，根據(jù)PTPlB水解pNPP的磷酸基團而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來檢測化學(xué)小分子對PTPlB的抑制活性，并用來測定芒果苷元抑制活性包括IC5tl值和抑制劑類型。通過上述體外試驗，申請人發(fā)現(xiàn)芒果苷元可顯著抑制PTPlB活性，是一種新型PTPlB抑制劑，其抑制類型為競爭性抑制；2、通過小鼠的體內(nèi)試驗，申請人發(fā)現(xiàn)芒果苷元可顯著改善C57BL/6正常小鼠和以胰島素抵抗為特征的ob/ob糖尿病肥胖模型小鼠的胰島素敏感性，降低實驗動物血糖。基于上述研究和試驗，申請人首次證實了芒果苷元是活性較好的新型PTPlB競爭性抑制劑，在體內(nèi)可增加胰島素敏感性，改善實驗動物的高血糖癥狀，可以用于制備提高胰 島素敏感性、降血糖的藥物，能成為潛在的治療II型糖尿病、肥胖等代謝綜合征、乳腺癌藥的物，并可作為潛在的先導(dǎo)化合物進行抗糖尿病、肥胖等代謝綜合征、腫瘤和其他與PTPlB相關(guān)疾病的藥物進行開發(fā)，并可以借助芯片技術(shù)等進一步研究代謝相關(guān)的信號通路。


圖I :偏礬酸鈉對PTPlB抑制率曲線圖。測定不同濃度的陽性對照物偏礬酸鈉(NaVO3)對重組人源蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制率，相對濃度作圖，得到NaVO3的IC5tl為O. 32 μ Μ。圖2 :芒果苷元對PTPlB抑制率曲線圖。測定不同濃度芒果苷元對重組人源蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制率曲線，相對濃度作圖，其IC5tl為9.2 μ M。圖3 :芒果苷元對PTPlB抑制的雙倒數(shù)圖。在酶存在的條件下，固定抑制劑的濃度，改變底物的濃度，用Lineweaver-Burk法，以Ι/s為橫坐標(biāo)、1/V為縱坐標(biāo)作圖得到五條回歸直線，這五條直線交于Y軸，從而判斷芒果苷元對PTPlB的抑制類型為競爭性抑制。圖4 :芒果苷元對正常小鼠ip.胰島素的血糖變化圖。數(shù)據(jù)用ANOVA法進行統(tǒng)計學(xué)處理(η = 11)，其中各組血糖水平與對照組相比，NL(5、40mg/kg)在30、60、90、120 min四個時間點有顯著性差異*p < O. 05。圖5 :芒果苷元對ob/ob小鼠ip.胰島素的血糖變化圖。數(shù)據(jù)用ANOVA法進行統(tǒng)計學(xué)處理(η = 5)，其中各組血糖水平與對照組相比，NL(40mg/kg)在60、90、120 min三個時間點有顯著性差異*p < O. 05。
具體實施例方式通過以下實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但應(yīng)注意本發(fā)明的范圍并不受這些實施例的任何限制。材料與來源試劑芒果苷元；重組人源PTPlB(Merck);對硝基苯磷酸二鈉pNPP(Sigma);偏帆酸鈉(Sigma) ；M0PS(Sigma) ；DTT(Sigma);胰島素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司);C57BL/6小鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)，ob/ob小鼠(Jackson Lab)。器材XFL0UR4酶標(biāo)儀；恒溫培養(yǎng)箱；強生穩(wěn)豪血糖儀實施例I芒果苷元對PTPlB的抑制活性測定(IC5tl值的測定)芒果苷元用少量DMSO溶解后用MOPS緩沖液稀釋，取10 μ I加入至100 μ I反應(yīng)體系中(pH7. 0,25mM mops, ImM EDTA, 2mM DTT，0. IM NaCl)，使其終濃度分別為 1500、150、15,1. 5,0. 15“] ，加入底物？咿？至16mM，加入重組人PTPlB 5ng后置于37°C反應(yīng)30min。加10 μ I IM NaOH終止反應(yīng)，置酶標(biāo)儀上測定405nm波長條件下的吸收值A(chǔ)，以偏礬酸鈉(NaVO3)作為陽性對照，以不加PTPlB為空白對照，計算抑制率。用抑制率對濃度做圖，得到芒果苷元IC50為9. 2 μ M，偏礬酸鈉IC50為O. 32 μ Μ。實施例2芒果苷元對PTPlB的抑制動力學(xué)測定
分別配制不同濃度的pNPP(32、16、8、4、2mM)和不同濃度的NL溶液(I. 25,2. 5、5、10、20 μ M)。每個NL濃度對應(yīng)5組pNPP濃度做抑制活性測定，根據(jù)0D405的變化求出V，對應(yīng)的底物濃度為S，根據(jù)L-B方程分別作圖。結(jié)果表明，各條直線交于Y軸，故可判斷NL為PTPlB的競爭型抑制劑。實施例3芒果苷元在改善正常小鼠胰島素敏感性方面的作用C57BL/6小鼠隨機分為5組，每組11只，分別為對照組、NL不同劑量給藥組(100、60、40、15 mg/kg)。給藥組分別灌胃給予不同濃度的NL (用O. 5 % CMC-Na水溶液混懸)，對照組灌胃給予O. 5% CMC-Na水溶液。連續(xù)給藥7天，末次給藥后禁食12h，按lU/kg腹腔注射胰島素，分別于0、15、30、60、90、120min取血測量血糖值。胰島素耐量實驗(InsulinTolerance Test, ITT)實驗顯示，NL(5、40mg/kg)可顯著改善C57BL/6小鼠胰島素敏感性，降低其血糖，在后四個時間點有顯著性差異(P
<0. 05)。實施例4芒果苷元在改善ob/ob小鼠胰島素敏感性方面的作用ob/ob小鼠隨機分為2組，每組5只，分別為對照組和給藥組，給藥組灌胃給予40mg/kg NL溶液(用0. 5% CMC-Na水溶液混懸)，對照組灌胃給予0. 5% CMC-Na水溶液。連續(xù)灌胃7天，末次給藥后禁食12h，按lU/kg腹腔注射胰島素，分別在0、15、30、60、90、120min取血測量血糖值。ITT實驗顯示,40 mg/kg劑量NL可顯著改善ob/ob小鼠胰島素敏感性，降低其高血糖癥狀，在后三個時間點有顯著性差異(P < 0. 05)。
權(quán)利要求
1.一種芒果苷元的用途，其特征在于，用于制備提高胰島素敏感性的藥物的用途。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述芒果苷元還用于制備蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑為競爭型抑制劑。
4.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述芒果苷元還用于治療肥胖癥，或用作治療肥胖癥的藥物。
5.一種芒果苷元的用途，其特征在于，用于制備通過抑制PTPlB從而治療肥胖癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種四羥基酮芒果苷元(norathyriol)，對蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制活性測定、改善胰島素抵抗作用及在治療PTP1B相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。通過體外酶抑實驗證明，本發(fā)明證實芒果苷元是重組人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B的競爭型抑制劑，IC50值為9.2μM；芒果苷元可使C57BL/6正常小鼠、ob/ob糖尿病模型小鼠對胰島素的敏感性明顯改善，降低實驗動物血糖。說明芒果苷元是PTP1B的新型抑制劑，可作為潛在的先導(dǎo)化合物，在制備治療胰島素抵抗相關(guān)抗糖尿病和肥胖癥等代謝綜合征、腫瘤和其他與PTP1B相關(guān)疾病的藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61K31/352GK102657640SQ20121010408
公開日2012年9月12日 申請日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者何鳳霞, 吳冬冬, 周平, 張昊, 張艷, 張辰宇, 徐琛, 李佳, 李金波, 鄧小達 申請人:南京大學(xué)