蟲草素在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了蟲草素在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用，利用蟲草素能夠抑制破骨細胞增殖、多核成熟破骨細胞形成、破骨細胞噬骨能力、破骨細胞分化基因表達和清除破骨細胞內(nèi)活性氧(ROS)，穩(wěn)定骨生理穩(wěn)態(tài)，防止骨流失，保持骨密度，為骨質(zhì)疏松的防治提供了新的藥物。
【專利說明】蟲草素在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及蟲草素在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP)是由全身骨量減少，骨密度降低為標志的全身 性、進行性骨病。在OP患者中，骨礦密度（BMD)降低，骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白量及種類均 發(fā)生改變，容易導致骨折。在絕經(jīng)后婦女和75歲以上老年人中極為常見，是威脅老年人健 康和降低生活質(zhì)量的重要因素。
[0003] 破骨細胞（Osteoclast，0C)由造血干細胞系髓系單核細胞分化而來，是人體骨骼 系統(tǒng)中唯一具有吸收和重塑骨骼形態(tài)的生理性多核巨細胞。破骨細胞的活性與數(shù)量與人體 正常生理穩(wěn)態(tài)電解質(zhì)平衡中的鈣磷平衡以及諸多內(nèi)分泌疾病包括骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)。OP 患者中破骨細胞活性明顯提高，噬骨活動增加，破骨細胞與成骨細胞偶聯(lián)作用下降，最終導 致骨吸收大于骨形成，骨生理穩(wěn)態(tài)遭到破壞，骨密度下降。
[0004] 氧化應(yīng)激（oxidative stress)是指機體內(nèi)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，R0S)或者其他高活性氧化物的的速率大于機體清除能力和修復(fù)能力導致失衡的 狀態(tài)。ROS在正常生理狀態(tài)下起著調(diào)控細胞凋亡、分化等作用。然而當機體處于氧化應(yīng)激狀 態(tài)時，過多的ROS會導致細胞中的重要成分受損，包括蛋白質(zhì)，核酸以及脂類。同時，正常的 細胞信號通路會受到干擾是多類病理變化的基礎(chǔ)。ROS在破骨細胞分化、成熟的過程中發(fā)揮 了重要作用。破骨細胞線粒體內(nèi)的過氧化氫參與其分化和融合的重要信號通路，促進破骨 細胞活化，發(fā)揮噬骨功能。
[0005] 蟲草素 （cordycepin or 3'-deoxyadenosine)是一種核苷類腺苷的衍生物，是冬 蟲夏草（Cordyceps)中的有效活性物質(zhì)。由于其化學結(jié)構(gòu)與腺苷的類似性，生物酶有時難 以將其兩者區(qū)分，因此其在生物體內(nèi)可以發(fā)揮重要的生物學作用。蟲草素目前已被證實具 有抗炎、抗氧化、清除自由基以及促進腫瘤細胞凋亡等功能。另外，蟲草素被證實具有神經(jīng) 保護作用，改善大鼠心肌缺血再灌注損傷，通過抑制integrin/FAK通路阻止肝細胞肝癌表 皮間細胞轉(zhuǎn)移，并參與促進腫瘤細胞的自噬。近來有文獻報道蟲草素能夠影響小鼠的學習 認知功能，可一定程度的阻止基因毒性導致的老化?？傊x草素因其獨特的生物學活性在 生物體各個系統(tǒng)中均有可能起到一定的藥理學作用，而在骨骼系統(tǒng)中未見蟲草素有相關(guān)報 道或應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供蟲草素在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用， 提供了蟲草素的新用途，也為骨質(zhì)疏松的防治提供了新的藥物。
[0007] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] 蟲草素在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 進一步，所述蟲草素在制備抑制破骨細胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 進一步，所述蟲草素在制備抑制多核成熟破骨細胞形成的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 進一步，所述蟲草素在制備抑制破骨細胞噬骨能力的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 進一步，所述蟲草素在制備清除破骨細胞內(nèi)活性氧的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 進一步，所述蟲草素在制備抑制破骨細胞分化基因表達的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 進一步，所述破骨細胞分化基因為c-fos、MAPK、NFATcl或NFKB基因。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了蟲草素在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng) 用，有效劑量內(nèi)能夠抑制RANKL誘導的RAW264. 7向破骨細胞的分化成熟、抑制RANKL誘導 的RAW264. 7分化成熟的破骨細胞的噬骨能力、清除RANKL刺激產(chǎn)生的細胞內(nèi)ROS存積、顯 著降低NFATCl、c-f 〇S、p38\MAPK及NF κ B等破骨細胞分化特異基因的表達，抑制骨吸收，促 進骨形成，最終起到防治骨質(zhì)疏松的作用；并且蟲草素為純天然物質(zhì)，用藥較安全，毒副作 用小，可用于骨質(zhì)疏松的防治。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0017] 圖1為蟲草素對RNAKL和M-CSF誘導下RAW264. 7細胞增殖作用的影響（A :蟲草 素的化學式；B :培養(yǎng)24h不同濃度蟲草素對RAW264. 7細胞增殖的影響；C :培養(yǎng)72小時不 同濃度蟲草素對RAW264. 7細胞增殖的影響，其中橫坐標為不同濃度的蟲草素給藥劑量，縱 坐標為以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值比較百分數(shù)表述的細胞活力值）。
[0018] 圖2為不同濃度蟲草素對RANKL誘導的破骨細胞形成的TRAP染色和不同細胞核 數(shù)量破骨細胞計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果（A :TRAP染色；B :TRAP陽性總細胞數(shù)；C :TRAP陽性單個核細胞 數(shù)量；D :TRAP陽性2-3核細胞數(shù)量；E :TRAP陽性3核以上細胞數(shù)量）。
[0019] 圖3為不同濃度蟲草素對RANKL誘導的破骨細胞形成的影響（A :FAK免疫熒光染 色；B :破骨細胞數(shù)量；C :多核破骨細胞數(shù)量）。
[0020] 圖4為不同濃度蟲草素對破骨細胞噬骨能力的影響和骨表面吸收統(tǒng)計（A :不同濃 度蟲草素對破骨細胞噬骨能力的影響；B :骨表面吸收統(tǒng)計）。
[0021] 圖5為不同濃度蟲草素在RANKL刺激下清除自由基的能力和細胞內(nèi)ROS熒光強 度分析（A :不同濃度蟲草素在RANKL刺激下清除自由基的能力；B :細胞內(nèi)ROS熒光強度分 析）。
[0022] 圖6為不同濃度蟲草素對RANKL誘導的破骨細胞分化的基因表達的影響（A :TRAP 基因 ；B :Ctsk 基因 ；C :c-fos 基因 ；D :MAPK 基因 ；E :NFATcl 基因 ；F :NF κ B 基因）。
[0023] 圖7為蟲草素對OVX小鼠骨質(zhì)疏松的影響（A :骨密度；B :骨體積分數(shù)；C :骨代謝 標志物S-PINP)。

【具體實施方式】
[0024] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] RAW264. 7是小鼠單核巨噬細胞系，在核因子κ B受體活化因子配體（RANKL)以及 人巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)的刺激誘導下可以向破骨細胞分化，是研宄破骨細胞分 化、融合、成熟、噬骨等生物學行為的常用的細胞模型。同時破骨細胞與成骨細胞、骨細胞、 基質(zhì)細胞等都有密切的關(guān)聯(lián)和耦合作用，是體內(nèi)骨穩(wěn)態(tài)及電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控元素。骨 質(zhì)疏松往往由過多的骨吸收導致，是破骨細胞過度活化的結(jié)果。故選擇RAW264. 7作為細胞 模型，研宄蟲草素對RANKL誘導的破骨細胞生成的影響十分適宜。觀察蟲草素清除ROS的 能力，是否抑制破骨細胞特異相關(guān)基因的表達及其對破骨細胞噬骨能力的影響，從而闡述 蟲草素在制備用于防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用及機制。
[0026] -、蟲草素對破骨細胞前體增殖的影響
[0027] 將RAW264. 7細胞以IX IO3個/well接種于96孔板，待細胞長滿后棄掉培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基成分為：DMEM高糖培養(yǎng)液+10% (v/v)胎牛血清+1 % (wt)雙抗（青霉素和鏈霉素 各0. 5% )，分別以終濃度為0 (空白對照組）、0. 01 μ g/mL、0. 05 μ g/mL、0. 1 μ g/mL、0. 5 μ g/ mL、l μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL將蟲草素加入各新鮮培養(yǎng)基中，然后加入96孔板中，同時 以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)誘導RAW264. 7細胞向破骨細胞分化。分別培養(yǎng)24h 和72h，利用CCK-8法對細胞活性進行檢測，觀察蟲草素對RNAKL和M-CSF誘導下RAW264. 7 細胞增殖作用的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在培養(yǎng)24h和72h組中，低濃度的蟲草 素（小于1 μ g/mL)對破骨細胞分化過程中的細胞增殖無明顯影響，高濃度的蟲草素（大于 5 μ g/mL)對破骨細胞分化過程中的細胞增殖具有明顯的抑制效應(yīng)，*P < 0. 05, #P < 0. 05， *為組內(nèi)比較，#為組間比較。
[0028] 二、蟲草素對RANKL誘導的TRAP陽性細胞（破骨細胞）產(chǎn)生的影響
[0029] 將RAW264. 7細胞以IX IO3個/well接種于96孔板，待細胞長滿后棄掉培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基成分為：DMEM高糖培養(yǎng)液+10% (v/v)胎牛血清+1 % (wt)雙抗（青霉素和鏈霉素 各0. 5% )，然后按以下分組誘導培養(yǎng)：
[0030] 組I :RANKL(50ng/mL)誘導，無蟲草素對照組；
[0031] 組 2 :RANKL(50ng/mL)誘導，0· 01 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0032] 組 3 :RANKL (50ng/mL)誘導，0. 05 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0033] 組 4 :RANKL (50ng/mL)誘導，0· 1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0034] 組 5 :RANKL (50ng/mL)誘導，0· 5 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0035] 組 6 :RANKL(50ng/mL)誘導，1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0036] 組 7 :RANKL (50ng/mL)誘導，5 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0037] 組 8 :RANKL(50ng/mL)誘導，10 μ g/mL 蟲草素實驗組。
[0038] 誘導培養(yǎng)72h后，進行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP)染色，具體為：棄置培養(yǎng)基后用 PBS清洗3次，每次3min，然后用質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定20min，再用PBS清洗3次， 每次3min，接著用抗酒石酸酸性磷酸酶染液（0.1mg/ml of naphthol AS-MX phosphate， 0.3mg/ml of Fast Red Violet LB復(fù)染）避光染色lh，棄置染液。PBS漂洗3次后每孔加 入100 μ L PBS觀察，結(jié)果如圖2所示。圖2中A從光鏡下可見TRAP陽性細胞被染成紫紅 色；然后根據(jù)細胞核統(tǒng)計TRAP陽性細胞數(shù)，其中B為TRAP陽性總細胞數(shù)，C為TRAP陽性單 個核細胞數(shù)量，D為TRAP陽性2-3核細胞數(shù)量，E為TRAP陽性3核以上（成熟破骨細胞） 細胞數(shù)量。從統(tǒng)計結(jié)果可以看出，TRAP陽性總細胞數(shù)量在毒性濃度范圍內(nèi)隨著蟲草素給藥 劑量的增加而降低，單核、2-3核、3核以上成熟破骨細胞的數(shù)量具有相同的變化趨勢。證明 蟲草素具有濃度依賴性抑制破骨細胞的生成。并且，當蟲草素給藥劑量濃度為臨界毒性濃 度1 μ g/mL時，抑制效果最明顯（#P < 0. 01)。
[0039] 三、蟲草素對RANKL誘導的多核成熟破骨細胞形成的影響
[0040] 將RAW264. 7細胞以IX IO3個/well接種于96孔板，待細胞長滿后棄掉培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基成分為：DMEM高糖培養(yǎng)液+10% (v/v)胎牛血清+1 % (wt)雙抗（青霉素和鏈霉素 各0. 5% )，然后按以下分組誘導培養(yǎng)：
[0041] 組I :RANKL(50ng/mL)誘導，無蟲草素對照組；
[0042] 組 2 :RANKL(50ng/mL)誘導，0· 01 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0043] 組 3 :RANKL (50ng/mL)誘導，0· 05 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0044] 組 4 :RANKL (50ng/mL)誘導，0. 1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0045] 組 5 :RANKL (50ng/mL)誘導，0· 5 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0046] 組 6 :RANKL(50ng/mL)誘導，1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0047] 組 7 :RANKL (50ng/mL)誘導，5 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0048] 組 8 :RANKL(50ng/mL)誘導，10 μ g/mL 蟲草素實驗組。
[0049] 誘導培養(yǎng) 72h 后行 FAK (Actin Cytoskeleton and Focal Adhesion Staining)免 疫熒光染色，具體為：細胞取出后棄置培養(yǎng)基，IXPBS洗兩遍，然后用質(zhì)量分數(shù)為4%的多 聚甲醛室溫（18?25°C )下固定20min，再用IXPBS洗兩遍，接著用質(zhì)量分數(shù)為0. 1%的 Triton X-100穿透細胞5min，再用IXPBS洗兩遍，用含質(zhì)量分數(shù)1 % BSA的IXPBS封閉 緩沖液固定30min ;然后用封閉緩沖液稀釋一抗（Anti-Vinculin)至工作濃度（1 :300)，室 溫孵育細胞Ih ;1X沖洗緩沖液（含質(zhì)量分數(shù)0. 05% Tween-20的1XPBS)洗三遍，每次 5-lOmin，再將二抗（Alexa Fluor 488Goat Anti-Mouse IgG (H+L)抗體，Invitrogen)稀釋 至工作濃度（I :500)，同時加入TRITC標記的鬼筆環(huán)肽（TRITC標記的鬼筆環(huán)肽與IXPBS 的質(zhì)量體積比為1:500)。室溫（18?25°C )下共同孵育lh，IX沖洗緩沖液洗三遍，每次 5-10min，室溫（18?25°C )下用DAPI復(fù)染核5min，IX沖洗緩沖液洗三遍，每次5-10min。 熒光顯微鏡觀察細胞，統(tǒng)計視野下破骨細胞數(shù)量，以及破骨細胞平均核數(shù)，結(jié)果如圖3所 示。結(jié)果顯示，當蟲草素劑量濃度超過0. 1 μ g/mL時，破骨細胞的形成收到了明顯的抑制， ***P < 0. 001 (圖3中B)。當蟲草素劑量濃度超過0. 1 μ g/mL時，多核破骨細胞（核數(shù)量 大于3)的形成顯著降低，林*P < 0· 001 (圖3中C)。
[0050] 四、蟲草素抑制破骨細胞骨吸收能力
[0051] 將RAW264. 7細胞以4X IO3個/well接種于鋪200 μm小牛骨片的48孔板，待細 胞長滿后棄掉培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為：DMEM高糖培養(yǎng)液+10% (v/v)胎牛血清+1 % (wt)雙 抗（青霉素和鏈霉素各〇. 5% )，然后按以下分組誘導培養(yǎng)：
[0052] 組1 :無 RANKL誘導，無蟲草素空白對照組；
[0053] 組2 :RANKL (50ng/mL)誘導，無蟲草素對照組；
[0054] 組 3 :RANKL (50ng/mL)誘導，0. 1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0055] 組 4 :RANKL (50ng/mL)誘導，0· 5 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0056] 組 5 :RANKL(50ng/mL)誘導，1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0057] 組 6 :RANKL (50ng/mL)誘導，5 μ g/mL 蟲草素實驗組。
[0058] 培養(yǎng)96小時后取出含小牛骨片的48孔板，棄置培養(yǎng)基，用含質(zhì)量分數(shù)10%漂白劑 (HC10)室溫（18?25°C)漂白5min，雙蒸水清洗3遍，每次5min。室溫（18?25°C)下放置 至干燥（3-5小時），最后用甲苯胺藍染液染色5min，染色后雙蒸水漂洗3-5遍，每次5min。 每孔加入200 μ 1雙蒸水或I X PBS，光鏡下觀察，結(jié)果如圖4所不。結(jié)果顯不，骨表面經(jīng)破 骨細胞吸收后可被甲苯胺藍染成藍色，因此可以根據(jù)藍色噬骨面積的大小和占總骨面的百 分比評價破骨細胞的噬骨能力。結(jié)果可見未加入RANKL誘導的空白對照組無骨吸收；加入 RANKL(50ng/mL)誘導，無蟲草素對照組骨吸收表面比例與實驗組相比最大（**P〈0.01);各 實驗組隨著蟲草素給藥劑量濃度的提高，破骨細胞骨吸收能力顯著下降，毒性劑量內(nèi)最明 顯的蟲草素劑量濃度為1 μ g/mL(*#P〈0. 001)。
[0059] 五、蟲草素清除破骨細胞內(nèi)ROS累積抑制破骨細胞形成
[0060] 將RAW264. 7細胞以IX IO3個/well接種于96孔板，待細胞長滿后棄掉培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基成分為：DMEM高糖培養(yǎng)液+10% (v/v)胎牛血清+1 % (wt)雙抗（青霉素和鏈霉素 各0. 5% )，然后按以下分組誘導培養(yǎng)：
[0061] 組I :RANKL(50ng/mL)誘導，無蟲草素，ROS陽性對照組；
[0062] 組2 :RANKL (50ng/mL)誘導，無蟲草素對照組；
[0063] 組 3 :RANKL(50ng/mL)誘導，0· 1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0064] 組 4 :RANKL (50ng/mL)誘導，0· 5 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0065] 組 5 :RANKL(50ng/mL)誘導，1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0066] 組 6 :RANKL(50ng/mL)誘導，5 μ g/mL 蟲草素實驗組。
[0067] 誘導培養(yǎng)72h后取出，棄置培養(yǎng)基，加入熒光探針DCFH-DA對細胞內(nèi)的活性氧進行 檢測，組1加入ROS陽性對照solution，孵育20min，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗3遍，充分去 除未進入細胞的探針，熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)熒光強度及熒光陽性細胞數(shù)量，結(jié)果如圖 5所示。結(jié)果顯示，ROS陽性對照組熒光陽性細胞數(shù)量遠大于其余各組（#*P〈0. 001)。同 時，RANKL誘導無蟲草素對照組可見細胞內(nèi)ROS活性較加入蟲草素各組相比ROS活性較強 (*P〈0. 05)。隨著蟲草素給藥濃度劑量的增加，細胞內(nèi)ROS活性隨之下降，體現(xiàn)出蟲草素具 有濃度依賴性清除細胞內(nèi)ROS及自由基的能力。
[0068] 6、蟲草素抑制破骨細胞分化特異基因的表達
[0069] 將RAW264. 7細胞以IX IO3個/well接種于96孔板，待細胞長滿后棄掉培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基成分為：DMEM高糖培養(yǎng)液+10% (v/v)胎牛血清+1 % (wt)雙抗（青霉素和鏈霉素 各0. 5% )，然后按以下分組進行誘導培養(yǎng)：
[0070] 組I :RANKL(50ng/mL)誘導，無蟲草素對照組；
[0071] 組 2 :RANKL(50ng/mL)誘導，0· 01 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0072] 組 3 :RANKL (50ng/mL)誘導，0. 05 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0073] 組 4 :RANKL (50ng/mL)誘導，0· 1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0074] 組 5 :RANKL (50ng/mL)誘導，0· 5 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0075] 組 6 :RANKL(50ng/mL)誘導，1 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0076] 組 7 :RANKL (50ng/mL)誘導，5 μ g/mL 蟲草素實驗組；
[0077] 組 8 :RANKL(50ng/mL)誘導，10 μ g/mL 蟲草素實驗組。
[0078] 誘導培養(yǎng)72h后取出，棄置培養(yǎng)基，用Trizol裂解細胞，提取細胞內(nèi)的總RNA，實時 定量RT-PCR對目的基因 TRAP、Ctsk、c-fos、MAPK、NFATcl、NFKB進行定量檢測。定量檢測 引物如下：
[0079] Ctsk :正向引物：5'-gcggcattaccaacat-3'（SEQ ID NO. 1);反向引物： 5' -ctggaagcaccaacga-3，（SEQ ID NO. 2);
[0080] TRAP :正向引物：5' -ttgcacattcagtgtttttgg-3'（SEQ ID NO. 3);反向引物： 5'-tgcaagtgtcgtgccaag-3'（SEQ ID NO. 4);
[0081] c-fos :正向引物：5 '-aggcagaaccctttga-3'（SEQ ID NO. 5);反向引物： 5' -ggtgaccacgggagta-3 '（SEQ ID NO. 6);
[0082] Nfkb2 :正向引物：5'-agcctcagggccttacaga-3'（SEQ ID NO. 7);反向引物： 5'-ccgtacaatgctcagatcca-3'（SEQ ID NO. 8);
[0083] NFATcl :正向引物：5'-gaggagttggctcagtg-3'（SEQ ID NO. 9);反向引物： 5'-tagcgttccgttcgtt-3'（SEQ ID NO. 10);
[0084] MAPK :正向引物：5'-gacagagtacgtagccacacgtt-3'（SEQ ID NO. 11);反向引物： 5' -agcccacagaccaaatatcaa-3'（SEQ ID NO. 12)，每組做獨立實驗 5 復(fù)孔，并以 GAPDH 和 actin為雙內(nèi)參，具體引物為：
[0085] GAPDH:正向引物：5'-agatggagatttct-3'（SEQ ID NO. 13);反向引物： 5'-cttgcttagtttcttgtctggtg t_3'（SEQ ID NO. 14);
[0086] Actin :正向引物：5'-tccctgtatgcctctg-3'（SEQ ID NO. 15);反向引物： 5'-atgtcacgcacgattt-3'（SEQ ID NO. 16)〇
[0087] 定量檢測結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，蟲草素濃度為0. 1 μ g/mL時能夠抑制破骨 細胞標志物Ctsk和TRAP的表達（***P〈0. 001)，并且呈濃度依賴性，當蟲草素劑量濃度升高 至1 μ g/mL時抑制作用進一步加強（#P〈0. 01);同時，破骨細胞分化特異相關(guān)基因 c-fos、 MAPK、NFATcl、NFKB表達呈顯著變化，其中，NFKB，c-fos、MAPK、NFATcl基因均在蟲草素濃度 劑量為0. 1 μ g/mL時表達顯著降低（**P〈0. 01)。NFKB基因在蟲草素濃度劑量為0. 5 μ g/ mL時表達顯著降低（***P〈0. 001)。可得出結(jié)論蟲草素通過抑制破骨細胞分化特異性基因 c-fos、MAPK、NFATcl、NFKB的表達進而抑制破骨細胞的分化，形成，成熟和骨吸收能力。
[0088] 七、蟲草素明顯改善OVX小鼠骨質(zhì)疏松
[0089] I、OVX骨質(zhì)疏松小鼠模型建立
[0090] 取48只8周齡C57BL/6J雌性小鼠，體重為18-22g。戊巴比妥鈉（50mg/kg)麻醉， 手術(shù)組（OVX)背側(cè)入路切除小鼠雙側(cè)卵巢，對照組（Sham)進行假手術(shù)，暴露卵巢后縫合關(guān) 閉切口。術(shù)后一周開始給藥，給藥持續(xù)8周，每周2次，給藥方法為將蟲草素溶解于無菌生 理鹽水中腹腔注射給藥，按照l〇mg/kg的劑量濃度給藥，對照組則給予同等劑量的生理鹽 水。小鼠被隨機分為四組，手術(shù)組+給藥（η = 12)，手術(shù)組+對照（η = 12)，對照組+給藥 (η = 12)，對照組+對照（η = 12)。
[0091] 2、平均骨密度檢測與骨代謝標志物檢測
[0092] 完成8周給藥后每只小鼠分離左側(cè)股骨，去除多余軟組織，固定。心臟采血獲得血 液樣本。通過小動物microCT檢測骨微結(jié)構(gòu)進行分析。管電壓為50kV，管電流為0. 1mA，分 辨率為8mm。股骨掃描區(qū)域限定為遠端干垢端，向近端的初級松質(zhì)近末端區(qū)域延伸2mm。選 定的感興趣區(qū)（ROI)的3D參數(shù)用于數(shù)據(jù)分析，包括：骨礦物質(zhì)密度、連接密度、結(jié)構(gòu)模型指 數(shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分離度和相對骨體積分數(shù)。血液樣本用于分析骨代謝 產(chǎn)物包括：PINP，CTX-I和TRACP 5b，分析結(jié)果如圖7所示。
[0093] 結(jié)果顯示，相對于假手術(shù)組（Sham)，OVX小鼠的骨密度和骨體積分數(shù)明顯下降，同 時連接密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度也有所降低。然而，通過蟲草素給藥后，OVX組小鼠的 骨密度、骨體積分數(shù)、連接密度、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度相對OVX組都顯著提高，結(jié)果具 有統(tǒng)計學差異（P〈〇. 05)。因此得出結(jié)論蟲草素能夠?qū)Υ萍に厝狈е碌墓琴|(zhì)疏松起到保護 作用。
[0094] 綜上所述，蟲草素對破骨細胞的分化、形成、成熟以及骨吸收能力均有顯著的抑制 作用。基于該功能，蟲草素可應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的防治，尤其是破骨細胞活躍相關(guān)的骨質(zhì)疏松 癥中。
[0095] 最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以在 形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 蟲草素在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蟲草素在制備抑制破骨細胞增殖的 藥物中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蟲草素在制備抑制多核成熟破骨細 胞形成的藥物中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蟲草素在制備抑制破骨細胞噬骨能 力的藥物中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蟲草素在制備清除破骨細胞內(nèi)活性 氧的藥物中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蟲草素在制備抑制破骨細胞分化基 因表達的藥物中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述破骨細胞分化基因為c-fos、MAPK、 NFATcl 或 NFKB 基因。
【文檔編號】A61P19/10GK104490916SQ201510000960
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月4日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月4日
【發(fā)明者】竇策, 董世武, 曹震, 許建中 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學