專利名稱：一種用于結(jié)核分枝桿菌疫苗制備的核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和免疫學(xué)結(jié)合領(lǐng)域，更具體地是涉及利用人偏愛密碼子優(yōu)化結(jié)核分枝桿菌MPT64基因的核苷酸序列，及其在制備結(jié)核分枝桿菌疫苗上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis, MTB)引起的一種慢性傳染病，是世界上最嚴(yán)重的傳染病之一，世界近三分之一的人口感染過結(jié)核菌，其中每年有 800萬(wàn)新感染的結(jié)核患者，有200萬(wàn)人死亡?？ń槊?bacille calemette guerin，BCG)是當(dāng)前唯一可用的結(jié)核疫苗，但其免疫保護(hù)作用差異很大，并且存在較大副作用，因此，卡介苗不是一種令人滿意的疫苗，尋找一種比卡介苗免疫保護(hù)作用更好的人結(jié)核分枝桿菌疫苗已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。結(jié)核分枝桿菌結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其菌體表面覆蓋一層由長(zhǎng)鏈脂肪酸、糖脂和其他成分組成的蠟樣細(xì)胞壁。其基因組DNA總長(zhǎng)約4. 41Mb，蛋白編碼基因3959個(gè)(占編碼基因90% )， 假基因6個(gè)(不含插入序列)，明確功能的基因M41個(gè)，有606個(gè)基因目前尚不知其功能。 利用基因組總DNA芯片技術(shù)比較分枝桿菌屬基因組成特點(diǎn)，已鑒定出1 個(gè)結(jié)核桿菌特異性讀碼框(ORF)。其中，MPT64蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)的結(jié)核桿菌特異性抗原(Thomas et al, 1994)，可被大多數(shù)結(jié)核患者和結(jié)核感染者的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，它既能刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)， 又能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，因此MPT64基因成為研制結(jié)核分枝桿菌新型疫苗的主要候選基因之一。目前試驗(yàn)研究表明，利用天然的結(jié)核分枝桿菌MPT64基因構(gòu)建的DNA疫苗免疫BALB/ c小鼠能產(chǎn)生一定水平的體液免疫和細(xì)胞免疫，但普遍存在免疫水平較低等問題，究其原因可能是由于密碼子偏好性不同，導(dǎo)致天然MPT64基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的蛋白表達(dá)量不高， 進(jìn)而造成免疫效果不佳。本發(fā)明采用人偏愛密碼子優(yōu)化結(jié)核分枝桿菌MPT64基因的核苷酸序列，并構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌疫苗，以提高其免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于結(jié)核分枝桿菌疫苗制備的核苷酸序列，該核苷酸序列如SEQ ID No 1或者是SEQ ID No 1經(jīng)過1個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加而不改變其編碼蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明的另一目的在于將所述的核苷酸序列應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌疫苗的制備，具體包括以下步驟將所述的核苷酸序列克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)中，構(gòu)建 pcDNA3. 1 (+) -MPT64A DNA疫苗，或者克隆到腺病毒載體中，構(gòu)建pAd_MPT64A重組腺病毒疫苗。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，發(fā)明人在編碼蛋白不變的前提下，將天然結(jié)核分枝桿菌 MPT64基因采用人偏愛密碼子將其核苷酸序列優(yōu)化并采用基因合成儀合成優(yōu)化后的序列 (MPT64A)。再將優(yōu)化的MPT64A基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)，或者克隆到腺病毒載體pAd。用構(gòu)建的pcDNA3. l(+)-MPT64A DNA疫苗或者pAd_MPT64A重組腺病毒疫苗免疫BALB/c小鼠。通過間接ELISA實(shí)驗(yàn)及淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其免疫效果。本發(fā)明采用簡(jiǎn)單、快捷的方法將結(jié)核分枝桿菌MPT64基因改造為在人體內(nèi)具有更強(qiáng)免疫效果的優(yōu)化基因，并證實(shí)在BALB/c小鼠體內(nèi)其具有優(yōu)良的免疫原性，從而為研制結(jié)核分枝桿菌疫苗提供了更好的抗原基因。有益效果與常規(guī)結(jié)核分枝桿菌疫苗采用天然基因不同，本發(fā)明基于所研發(fā)的疫苗將最終用于人體內(nèi)，故在保證氨基酸序列不變的前提下，用人偏愛密碼子取代結(jié)核分枝桿菌MPT64基因的天然密碼子，再以優(yōu)化后的結(jié)核分枝桿菌MPT64基因研制DNA疫苗及重組腺病毒疫苗，這樣可以使結(jié)核分枝桿菌MPT64基因的蛋白表達(dá)量增加從而增強(qiáng)其疫苗在人體內(nèi)的免疫效果以達(dá)到良好的預(yù)防效果。


圖1顯示的是DNA疫苗免疫小鼠后，MPT64抗體的檢測(cè)結(jié)果；圖2顯示的是重組腺病毒疫苗免疫小鼠后，MPT64抗體的檢測(cè)結(jié)果；圖3顯示的是DNA疫苗免疫小鼠后，MPT64抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果；圖4顯示的是重組腺病毒疫苗免疫小鼠后，MPT64抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明是如何實(shí)現(xiàn)的，以下說明不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.優(yōu)化結(jié)核分枝桿菌MPT64基因序列的合成。在結(jié)核分枝桿菌MPT64蛋白氨基酸序列不變的前提下，采用人偏愛密碼子將結(jié)核分枝桿菌MPT64基因序列(Gene bank可查)優(yōu)化，并利用基因合成儀合成優(yōu)化后的序列， 命名為MPT64A(如序列表SEQ ID No:l所示)。序列優(yōu)化由本實(shí)驗(yàn)組人員完成。優(yōu)化序列的合成工作委托杭州賢至生物科技有限公司完成，并最終將合成的MPT64A基因連接質(zhì)粒載體PMD19-T (寶生物工程大連有限公司)。實(shí)施例2. pcDNA3. 1 (+) -MPT64A、pcDNA3. 1 (+) -MPT64 重組質(zhì)粒的構(gòu)建1) MPT64A 的 PCR 擴(kuò)增以MPT64A基因序列為模板序列，設(shè)計(jì)合成上游引物MPT64A-F和下游引物 MPT64A-R，并分別添加酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI，具體序列如下(其中劃線部分為酶切位
占)·
SEQ ID No :2MPT64A_F :5，-CGGGATCCGCCACCATGGCCCCCAAGACCTACT-3，SEQ ID No :3MPT64A_R :5，-CGGAATTCTTAGGCCAGCATGCTGTCGA-3‘以MPT64A-F和MPT64A-R分別為上下游引物，以合成的MPT64A基因?yàn)槟０暹M(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，58°C退火15秒，72°C延伸45 秒，總共30個(gè)循環(huán)，最后再72°C延伸3分鐘。PCR產(chǎn)物行1 %瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收 MPT64A PCR 產(chǎn)物。2) pcDNA3. 1 (+) -MPT64A 的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI (寶生物工程大連有限公司)于37°C分別雙酶切 MPT64APCR產(chǎn)物和pcDNA3. 1 (+)載體(美國(guó)hvitrogen公司)12小時(shí)，酶切產(chǎn)物分別行1 % 瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收MPT64A酶切產(chǎn)物和pcDNA3. 1 (+)載體。使用T4連接酶(寶生物工程大連有限公司)將回收MPT64A酶切產(chǎn)物和pcDNA3. 1⑴載體于4°C過夜連接后， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(杭州賢至生物科技有限公司)，并涂布于含氨芐青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板，于37°C過夜培養(yǎng)。第二日，挑取平板上單克隆菌株至含氨芐青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)12小時(shí)后，堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng) BamHI和EcoRI雙酶切鑒定后得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3. 1 (+)_MPT64A。pcDNA3. 1 (+)-MPT64(其中的MPT64基因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌天然序列)制備過程和 pcDNA3. 1 (+)-MPT64A類似，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該熟知，在此不再贅述。實(shí)施例3. pAd_MPT64A、pAd_MPT64重組腺病毒疫苗的構(gòu)建1)重組穿梭質(zhì)粒pMIDA-MPT64A的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI于37°C酶切pMIDA穿梭質(zhì)粒(杭州賢至生物科技有限公司)12小時(shí)，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收。使用T4連接酶將回收的 pMIDA載體和實(shí)施例2中的MPT64A酶切產(chǎn)物于4°C過夜連接后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板，于37°C過夜培養(yǎng)。第二日，挑取平板上單克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)12小時(shí)后，堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切鑒定后得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為 pMIDA-MPT64A。2)重組腺病毒質(zhì)粒pAd_MPT64A的構(gòu)建根據(jù)hvitrogen公司腺病毒操作手冊(cè)，將重組穿梭質(zhì)粒pMIDA_MPT64A與腺病毒骨架質(zhì)粒pAd/PL-DEST (美國(guó) hvitrogen 公司)在重組酶LR Clonase II (美國(guó) hvitrogen 公司)作用下，于25°C體外重組反應(yīng)1小時(shí)之后，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞(美國(guó)hvitrogen公司)，涂布于含氨芐青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)12小時(shí)之后，于平板上挑取單克隆菌株至含氨芐青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)12小時(shí)后，采用質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定及PCR鑒定后得到正確的重組腺病毒質(zhì)粒，命名為pAd-MPT64A。3)重組腺病毒疫苗pAd_MPT64A的構(gòu)建在37°C條件下，用限制性內(nèi)切酶I^cI (美國(guó)新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)公司)單酶切Iy g 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-MPT64A，5小時(shí)后純化并回收。使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國(guó)hvitrogen公司)將回收的酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)染HEK 293A細(xì)胞(美國(guó)hvitrogen公司)，并于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，并且大于70%的HEK 細(xì)胞脫壁時(shí)，即可收集細(xì)胞，經(jīng)裂解后提取并純化重組腺病毒疫苗pAd-MPT64A。pAd-MPT64(其中的 MPT64基因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌天然序列)制備過程和pAd-MPT64A類似，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該熟知，在此不再贅述。實(shí)施例4. pcDNA3. 1 (+) -MPT64A、pcDNA3. 1 (+) -MPT64 重組質(zhì)粒免疫 BALB/c 小鼠分別將5 6周齡左右的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成pcDNA3. 1⑴-MPT64A、 pcDNA3. l(+)-MPT64、pcDNA3. 1(+)三個(gè)免疫組及一個(gè)空白對(duì)照組，每組10只。免疫組以每次每只ΙΟΟμ g(100y L體積質(zhì)粒的量經(jīng)后腿肌肉注射免疫小鼠，空白對(duì)照組改為ΙΟΟμ L生理鹽水經(jīng)后腿肌肉注射小鼠，在第O周和第4周免疫2次，并于第5周尾靜脈負(fù)壓采血后分離血清。實(shí)施例5. pAd-MPT64A、pAd_MPT64重組腺病毒疫苗免疫BALB/c小鼠分別將5 6周齡左右的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成pAd-MPT64A、pAd_MPT64、pAd 三個(gè)免疫組及一個(gè)空白對(duì)照組，每組10只。免疫組以每只IO7TCID5tl/次的量經(jīng)單側(cè)脛前肌內(nèi)注射免疫小鼠，空白對(duì)照組改為100 μ L生理鹽水，在第0周和第4周免疫2次，并于第5 周尾靜脈負(fù)壓采血后分離血清。實(shí)施例6.體液免疫水平的檢測(cè)用ELISA方法檢測(cè)免疫小鼠血清中ΜΡΤ64蛋白特異性抗體。將原核表達(dá)并純化的結(jié)核分枝桿菌ΜΡΤ64抗原(杭州賢至生物科技有限公司)以一定比例用包被液稀釋， 100 μ L/孔加入酶標(biāo)板(深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司)，4°C包被12小時(shí)后用洗滌液洗滌三次并拍干，150 μ L/孔加入封閉液，37°C封閉2小時(shí)，棄孔內(nèi)液體，拍干。100 μ L/孔加待檢血清及對(duì)照血清，37°C孵育1小時(shí)后，洗滌液洗滌五次并拍干。再100 μ L/孔加HRP (辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育30分鐘后，洗滌液洗滌五次并拍干，每孔加顯色液A 和顯色液B各50 μ L，37°C避光顯色10分鐘，再50 μ L/孔加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm 波長(zhǎng)空白孔校零后讀取OD值。以MPT64抗原免疫的小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，先用棋盤滴定法確定最佳的抗原包被濃度(1 μ g/mL)和血清稀釋倍數(shù)(1 100稀釋)。然后用建立的標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測(cè)免疫組小鼠的ELISA抗體。相關(guān)溶液配方如下包被液=Na2CO31. 5g，NaHCO3 2. 9g，加雙蒸水定容至 IOOOmL (ρΗ9· 6)。封閉液=Na2HPO4· 12Η20 2. 68g, NaH2PO4 · 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g, 20g 牛血清白蛋白，加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。洗滌液=Na2HPO4· 12H20 2. 68g, NaH2PO4 · 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g, Tween-20 0. 5mL，加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。顯色液A :200mg TMB溶于IOOmL無水乙醇，加雙蒸水定容至1000mL。顯色液B 檸檬酸2. lg, Na2HPO4 · 12H20 71g，加雙蒸水定容至1000mL。使用時(shí)ImL顯色液 A+lmL 顯色液 B+0. 4 μ L 30% H2O2終止液2M H2SO4, 21. 7mL濃H2SO4加雙蒸水定容至1000mL。兩實(shí)驗(yàn)組間采用非配對(duì)t檢驗(yàn)方法分別進(jìn)行分析，P值均設(shè)為0. 05。檢測(cè)結(jié)果顯示(見圖1)，與pcDNA3. 1 (+)_MPT64相比較，利用人偏愛密碼子優(yōu)化后的結(jié)核分枝桿菌MPT64基因所構(gòu)建的pcDNA3. 1 (+)_MPT64A DNA疫苗能更有效的刺激BALB/ c小鼠體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更高滴度的MPT64蛋白抗體，兩者差異顯著(P < 0. 05)。檢測(cè)結(jié)果同時(shí)顯示(見圖2)，與pAd_MPT64相比較，利用人偏愛密碼子優(yōu)化后的結(jié)核分枝桿菌MPT64基因所構(gòu)建的pAd-MPT64A重組腺病毒疫苗能更有效的刺激BALB/c小鼠體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更高滴度的MPT64蛋白抗體，兩者差異顯著(P < 0. 05)。實(shí)施例7.細(xì)胞免疫水平的檢測(cè)頸椎脫位法處死小鼠，無菌取脾，按照常規(guī)方法分離淋巴細(xì)胞，用完全RMPI-1640 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、終濃度為100U/mL的青、鏈霉素)制備淋巴細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106f/mL。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加以上淋巴細(xì)胞懸液100 μ L后，實(shí)驗(yàn)孔加100 μ L濃度為100ug/mL的結(jié)核分枝桿菌MPT64抗原，對(duì)照孔不加MPT64抗原，只加100 μ L完全培養(yǎng)液，空白孔只加完全培養(yǎng)液200 μ L，各設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中，37°C、5% CO2 及飽和濕度條件下培養(yǎng)68h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加5mg/mL MTT (噻唑蘭)溶液20 μ L， 微型震蕩器上震蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄上清培養(yǎng)液，每孔加 DMSO ( 二甲基亞砜)100 μ L，微型震蕩器上震蕩混勻5min，待沉淀完全溶解，選擇490nm波長(zhǎng)，于自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)OD49tlnm值。以刺激指數(shù)(StimyLation Index, Si)判斷淋巴細(xì)胞的增值效價(jià)，SI =實(shí)驗(yàn)組OD49tlnm均值/對(duì)照組OD49tlnm均值。兩實(shí)驗(yàn)組間采用非配對(duì)t檢驗(yàn)方法分別進(jìn)行分析，P值均設(shè)為0. 05。檢測(cè)結(jié)果顯示(見圖3)，與pcDNA3. 1 (+)_MPT64相比較，利用人偏愛密碼子優(yōu)化后的結(jié)核分枝桿菌MPT64基因所構(gòu)建的pcDNA3. 1 (+)_MPT64A DNA疫苗能更有效的刺激BALB/ c小鼠MPT64抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖，兩者差異顯著(P < 0. 05)。檢測(cè)結(jié)果同時(shí)顯示(見圖4)，與pAd_MPT64相比較，利用人偏愛密碼子優(yōu)化后的結(jié)核分枝桿菌MPT64基因所構(gòu)建的pAd-MPT64A重組腺病毒疫苗能更有效的刺激BALB/c小鼠 MPT64抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖，兩者差異顯著(P < 0. 05)。盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說明，但不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。
權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)核分枝桿菌疫苗制備的核苷酸序列，其特征在于，序列如SEQ ID No=I 或者是SEQ ID No 1經(jīng)過1個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加而不改變其編碼蛋白的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的核苷酸序列應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌疫苗的制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，包括以下步驟將所述的核苷酸序列克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)中，構(gòu)建pcDNA3. 1(+)-ΜΡΤ64Α DNA疫苗，或者克隆到腺病毒載體中，構(gòu)建pAd-MPT64A重組腺病毒疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于結(jié)核分枝桿菌疫苗制備的核苷酸序列及其應(yīng)用。將天然結(jié)核分枝桿菌MPT64基因采用人偏愛密碼子將其核苷酸序列優(yōu)化并采用基因合成儀合成優(yōu)化后的序列(MPT64A)。將優(yōu)化后的MPT64A基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，或者克隆到腺病毒載體pAd。用構(gòu)建的pcDNA3.1(+)-MPT64A DNA疫苗或者pAd-MPT64A重組腺病毒疫苗免疫BALB/c小鼠。通過間接ELISA實(shí)驗(yàn)及淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其免疫效果，證實(shí)在BALB/c小鼠體內(nèi)其具有優(yōu)良的免疫原性。本發(fā)明采用簡(jiǎn)單、快捷的方法將結(jié)核分枝桿菌MPT64基因改造為在人體內(nèi)具有更強(qiáng)免疫效果的優(yōu)化基因，從而為研制結(jié)核分枝桿菌疫苗提供了更好的抗原基因。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102199612SQ201110142008
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者余銘恩, 馮俊濤, 吳瓊杉, 李曉照, 胡成平 申請(qǐng)人:中南大學(xué)