專利名稱：獸醫(yī)微生物制劑的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種獸醫(yī)微生物制劑的制備方法及用途，涉及醫(yī)藥制品技術(shù)領(lǐng)域。
在現(xiàn)有技術(shù)中，對畜禽，尤其是幼齡畜禽，如仔豬患黃、白痢，羔羊及牛犢下痢，雛雞白痢，雛鴨下痢等的預(yù)防和治療方法，常采用抗菌素，不僅防治效果不好，有時還會產(chǎn)生藥物的毒副作用?！督K農(nóng)學(xué)院學(xué)報》1983年4(1)，方定一對“正常仔豬腸道菌群的初步研究”一文中，提出了仔豬白痢可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)，并用大腸桿菌NY-10制劑口飼新生仔豬，防止黃痢的探討，但均未制備出具有實用價值的微生物制劑。
本發(fā)明的目的是為了避免上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種對畜禽尤其對幼齡畜禽下痢具有明顯防治效果、無毒副作用、制備容易，使用方便的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施來達到將蠟樣芽孢桿菌(BacillusCereus)SA38原種菌株接種于PH為7-7.2的普通瓊脂斜面上，在35℃-38℃，最好在37℃溫度下，培養(yǎng)18-24小時，經(jīng)鏡檢鑒定合格后作為生產(chǎn)用菌種。再將生產(chǎn)用菌種接種于PH為7-7，2。含有0.25%的葡萄糖的種子大瓶或種子罐肉湯培養(yǎng)基中，在35℃-38℃，最好在37℃溫度下，培養(yǎng)18-24小時，經(jīng)檢驗證明純粹，即可作為種子菌液，并可保存于0℃-4℃下，限三天內(nèi)使用。將每毫升中含有蠟樣芽孢桿菌活菌10-15億個的種子菌液接種于大罐培養(yǎng)基中，按每100毫升培養(yǎng)基中加入80-100億個活菌的菌液比例接種，培養(yǎng)基是由在凈化的自來水或蒸餾水中加入2%的蛋白胨、0.5%的牛肉膏。0.3%的葡萄糖和0.5%的食用鹽(按重量%計)組成，PH為7-7.2。在常溫下，最好在30℃-32℃溫度下，采用大罐深層通氣和連續(xù)攪拌，罐內(nèi)通氣壓力為0.2-0.4公斤，攪拌的速度為每分80-130轉(zhuǎn)，以滿足蠟樣芽孢桿菌生長繁殖過程中對氧的需要。連續(xù)培養(yǎng)36-48小時，當(dāng)菌液中蠟樣芽孢桿菌的芽孢形成數(shù)量達到9%以上時，進行每分鐘達15000轉(zhuǎn)以上的高速離心5-10分鐘，去其上層澄清液，留存下層灰白色菌體，然后按菌體與無水淀粉1∶4的比例(按重量比計)向菌體中加入淀粉，經(jīng)75℃-85℃干燥、粉碎、過80目篩，即獲得每克混合物中含有蠟樣芽孢桿菌活菌數(shù)至少40億個的菌粉。再將葡萄糖、菌粉與淀粉按1∶3∶6的比例(按重量比計)混合均勻，即得每克中含有蠟樣芽孢桿菌活菌10-15億個的粉劑。在粉劑中加入適量的水分，壓制，即得片劑。每片重量為0.3克，每克含活菌10億個以上。
按上述方法制備的片劑或粉劑，用于畜禽，尤其是對幼齡畜禽因需氧或兼氧微生物引起的下痢，包括仔豬黃、白痢、羔羊及牛犢下痢，雛雞白痢，雛鴨下痢等的預(yù)防和治療的微生物制劑。
蠟樣芽孢桿菌(BacillusCereus)SA38菌株，是一種已知的可以通過商業(yè)渠道獲得的菌種，其商品目錄見《中國菌種目錄》(中國微生物菌種保藏管理委員會編著，輕工業(yè)出版社出版，1993年10月)。
一.細菌學(xué)特征1.形態(tài)與染色為革蘭氏染色陽性，桿狀，單個或呈短鏈狀排列，大小0.9×2.0u，芽孢居中，胞內(nèi)β-羥基丁酸鹽。用蘇丹黑染色，呈黑色顆粒。有鞭毛能運動，無莢膜。
2.培養(yǎng)特性普通肉湯培養(yǎng)24小時，呈混濁生長，菌膜較薄。在普通瓊脂平皿上培養(yǎng)18-24小時，菌落園形，邊緣整齊，表面低，呈乳脂樣不透明，大小為4-5mm。在鮮血營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24-48小時，不產(chǎn)生β溶血。
3.生化反應(yīng)對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖產(chǎn)酸，對乳糖、木糖、甘露醇、阿拉伯膠糖不產(chǎn)酸，硝酸鹽還原試驗(+)，枸椽酸試驗(-)，明膠液化(-)，氧化酶試驗(-)，淀粉水解(+)，接觸酶試驗(+)。
4.血清學(xué)鑒定用SA38蠟樣芽孢桿菌標準菌株免疫家兔，制成效價達640-1280的高免血清，用此血清與SA38菌種試驗應(yīng)產(chǎn)生特異性凝集反應(yīng)。
5.純粹試驗用普通瓊脂斜面、沙門氏斜面、厭氣肉肝湯各2支，每支接種0.2毫升，培養(yǎng)3-5天，作革蘭氏染色鏡檢，觀察結(jié)果應(yīng)純粹。
二.產(chǎn)品質(zhì)量檢驗1.成品指標
外觀呈白色或淺褐色的粉劑或片劑，無特殊氣味;水份＜5%;
均勻度變異系數(shù)＜7%;
雜菌數(shù)每克產(chǎn)品含雜菌數(shù)不超過10，000個;
芽孢數(shù)每克產(chǎn)品中含活菌芽孢10億個以上。
2.存活期在室溫條件下，菌粉中活菌數(shù)在6個月內(nèi)無變化，7-12個月含活菌90%以上，1-1.5年含活菌80%以上，粉劑或片劑的保存期為1-1.5年。
3.芽孢計數(shù)每批(組)隨機抽樣3個樣品，各次1克，用生理鹽水稀釋100倍，然后10倍遞進稀釋至10-8，接種鮮血馬丁瓊脂平皿2個，各0.1毫升，培養(yǎng)計算平均菌數(shù)，以3個樣品中最低芽孢數(shù)為該批(組)制劑的菌數(shù)，每克制劑含活芽孢數(shù)不得少于10億個。
4.安全性檢驗用5-10日齡雛雞10羽，每天每羽投服制劑1克(不少于2億個活菌)，連服3天。另取同樣條件雛雞10羽，作為對照。飼養(yǎng)觀察10天，應(yīng)健活;或試驗組與對照組合計死亡數(shù)不超過3羽，且試驗組不超過對照組的死亡數(shù)為合格。
用18-22克小白鼠10只。每只腹注制劑0.1克，觀察10天，應(yīng)健活。
三.用法及用量治療量豬、牛、羊、兔、按每公斤體重0.1-0.15克，雛雞與雛鴨每只30-50毫克，口服，每日一次，連服3日。預(yù)防量減半，連服7日。本品不得與抗菌藥或抗菌藥物添加劑同時使用。
本發(fā)明的工藝流程是菌種培養(yǎng)→一級種子罐培養(yǎng)→生產(chǎn)大罐培養(yǎng)→通氣、攪拌→離心→干燥→檢驗→粉劑或片劑。
本發(fā)明下面將結(jié)合實施例作進一步詳述例一將存活的蠟樣芽孢桿菌(BacillusCereus)SA38原種菌株接種于普通瓊脂斜面上，在37℃溫度，PH為7，培養(yǎng)18小時;再接種于PH為7，含有0.25%葡萄糖的種子罐肉湯培養(yǎng)基中，在37℃溫度，培養(yǎng)18小時，成為種子菌液;將種子菌液接種于大罐培養(yǎng)基中，按每100毫升培養(yǎng)基中加入含有90億個活菌的種子菌液的比例接種，培養(yǎng)基是在凈化的自來水中加入2%的蛋白胨、0.5%的牛肉膏、0.3%的葡萄糖和0.5%的食用鹽(按重量%計)組成，PH為7，在30℃溫度下，采用大罐深層通氣和連續(xù)攪拌，罐內(nèi)通氣壓力為0.2公斤，攪拌每分鐘80轉(zhuǎn)培養(yǎng)36小時，當(dāng)菌液中蠟樣芽孢桿菌的芽孢形成數(shù)量達到90%以上時，高速離心5分鐘，轉(zhuǎn)速每分鐘15000轉(zhuǎn)，去其上層沉清液，留存下層灰白色菌體，然后按菌體與無水淀粉1∶4的比例(重量比)向菌體中加入淀粉，75℃干燥后，粉碎、過80目篩余，得每克混合物中含有蠟樣芽孢桿菌活菌至少40億個的菌粉，再將葡萄糖、菌粉與淀粉按1∶3∶6的比例(重量比)，均勻混合，即得每克混合物中含有存活蠟樣芽孢桿菌約15億個的粉劑。
例二重復(fù)例1的微生物粉劑的制備方法，將獲得的粉劑加入適量的水份，壓制，得片劑，每片重量為0.3克，每片含活菌數(shù)約3億個。
例三上述粉劑(或片劑)口服，用于治療豬、牛、羊、兔下痢每公斤體重0.15克;治療雛雞下痢，每只50毫克，每天一次，連服3天。預(yù)防量減半，連服7天。禁止抗菌藥物同時使用。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點是1.療效好。治療仔豬黃、白痢99，588例，治愈率達94.50%，高于氯霉素等7種抗菌藥物平均77.20%的療效;治療牛犢下痢56頭，治愈率達96.6%，高于用抗生素治療86.7%的療效;治療雛雞白痢263，196只，治愈率達92.2%，治療雛鴨下痢106，076只，治愈率為91%，均高于抗菌藥物療效。
2.安全性好。試驗6批，用1.5-1.8公斤重的健康家兔作安全試驗，結(jié)果無不良反應(yīng)。對人、畜、禽均安全。
3.費用低。易于制造，生產(chǎn)成本低。
4.使用方便。對畜禽可口服，也可飼用。
權(quán)利要求
1.一種獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于將存活的蠟樣芽孢桿菌(BacillusCereus)SA38原種菌株接種于普通瓊脂斜面上，在PH為7-7.2，35℃-38℃溫度下，培養(yǎng)18-24小時，成為生產(chǎn)用菌種；再將生產(chǎn)用菌種接種于含有0.25%葡萄糖的種子大瓶或罐內(nèi)肉湯培養(yǎng)基中，在PH為7-7.2，35℃-38℃溫度下，培養(yǎng)18-24小時，成為每毫升含有蠟樣芽孢桿菌活菌10-15億個的種子菌液；將種子菌液接種在大罐培養(yǎng)基中，按每100毫升培養(yǎng)基中加入80-100億個活菌的種子液比例接種，培養(yǎng)基是由在凈化的自來水或蒸餾水中，加入2%的蛋白胨、0.5%的牛肉膏、0.3%葡萄糖和0.5%的食鹽(重量%)組成，PH為7-7.2，在常溫下，采用大罐深層通氣和連續(xù)攪拌，培養(yǎng)36-48小時；當(dāng)菌液中蠟樣芽孢桿菌的芽孢形成數(shù)達到90%以上時，通過高速離心5-10分鐘，去其上層清液，留存下層灰白色菌體，然后按菌體與無水淀粉1∶4的比例(重量比)向菌體中加入淀粉，經(jīng)75℃-85℃干燥后，粉碎、過80目篩，獲得每克混合物中含有蠟樣芽孢桿菌活菌至少40億個的菌粉；再將葡萄糖、菌粉與淀粉按1∶3∶6的比例(重量比)均勻混合，即得每克混合物中含有存活蠟樣芽孢桿菌10-15億個的粉劑；粉劑加入適量水分，經(jīng)壓制得片劑。
2.如權(quán)利要求1所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于生產(chǎn)用菌種或種子菌液的培養(yǎng)溫度為37℃。
3.如權(quán)利要求1或2所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于大罐內(nèi)培養(yǎng)的溫度為30℃-32℃。
4.如權(quán)利要求1或2所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于大罐內(nèi)深層通氣的壓力為0.2-0.4公斤，攪拌速度為每分鐘80-130轉(zhuǎn)。
5.如權(quán)利要求3所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于大罐內(nèi)深層通氣的壓力為0.2-0.4公斤，攪拌速度為每分鐘80-130轉(zhuǎn)。
6.如權(quán)利要求1所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于片劑的重量為0.3克，每克中含有蠟樣芽孢桿菌活菌10億個以上。
7.如權(quán)利要求1所述的獸醫(yī)微生物制劑，其特征在于用于預(yù)防治療畜禽腹瀉，尤其對需氧或兼氧性微生物引起的幼齡畜禽下痢，包括仔豬黃、白痢羔羊及牛犢下痢，雛雞白痢，雛鴨下痢有良好效果。
全文摘要
本發(fā)明是一種獸醫(yī)微生物制劑的制備方法及用途涉及醫(yī)藥制品技術(shù)領(lǐng)域。它是將蠟樣芽孢桿菌(Bacillus Cereus)SA38菌株，采用菌種培養(yǎng)，一級種子罐培養(yǎng)、生產(chǎn)大罐培養(yǎng)，然后進行高速離心沉淀，獲得灰白色菌體，加入無水淀粉，經(jīng)干燥、粉碎、過篩，即得每克混合物中含有存活芽孢桿菌10億個以上的粉劑。將粉劑加入適量的水分，壓制，即得片劑。每片重0.3g。作為畜禽，尤其對幼齡畜禽下痢的預(yù)防和治療用生物制劑。
文檔編號A61K35/74GK1090202SQ93101239
公開日1994年8月3日 申請日期1993年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月19日
發(fā)明者何明清 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)