專利名稱：一種狐貍腦炎活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種狐貍腦炎活疫苗及其制備方法，屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
狐貍腦炎是由犬腺病毒-I型病毒引起的以狐貍食欲減退或廢絕、飲欲增加、精神沉郁、反應(yīng)遲鈍、體溫升高、嘔吐、體虛無力、眼球震顫、陣發(fā)性抽搐、麻痹等特征的急性、接觸性傳染疾病。早在1925年Green就報(bào)道了狐貍腦炎，并在1930年Greent和Dewey等人發(fā)表了其病原體為病毒的證據(jù)(參考文獻(xiàn)胡體拉家畜傳染病學(xué).北京科學(xué)出版社， 1963. )。1989年，狐貍腦炎首次在我國山東省爆發(fā)，其后在全國范圍內(nèi)廣泛流行并導(dǎo)致狐貍出現(xiàn)較高的死亡，給我國養(yǎng)狐業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。1962年，Dithfield在一次爆發(fā)犬傳染性喉氣管炎期間從犬呼吸道中分離(參考文獻(xiàn):Darai G, Rosen A,DepI-Hs H, Flugel RM. Characterization of the DNA of canine adenovirus byrestriction enzyme analysis [J]. Intervirology, 1985, 23 (1) :23-8.) ^jt 得單純引起呼吸道病變(喉氣管炎)而不引起肝炎的犬腺病毒-II型病毒，即A^株(多倫多A26/61)。后來將犬傳染性肝炎病毒稱為1型腺病毒(CAV-I)，將似6株病毒稱為犬傳染性喉氣管炎病毒，即2型腺病毒(CAV-2)。犬腺病毒-II型毒株在毒力、可溶性抗原結(jié)構(gòu)、 細(xì)胞感染范圍以及紅細(xì)胞凝集范圍方面都與標(biāo)準(zhǔn)株犬傳染性肝炎病毒有些差別。但是應(yīng)用犬腺病毒-II型毒株免疫的犬與狐貍，卻能對犬傳染性肝炎病毒產(chǎn)生有效的免疫力(參考文獻(xiàn)殷震.動物病毒學(xué).第2版.北京科學(xué)出版社，1997，1104-1130)。1978年，第一個商業(yè)性犬腺病毒-II型弱毒疫苗株作為犬腺病毒-I型弱毒疫苗株的替代品上市后，目前世界上所用的狐貍腦炎疫苗都以犬腺病毒-II型病毒代替犬腺病毒-I型病毒疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用本發(fā)明人自行分離、鑒定、致弱、保存的一株犬腺病毒-II型弱毒CAV-2RZ株作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，接種MDCK細(xì)胞進(jìn)行病毒繁殖，經(jīng)過收獲、配苗、凍干等步驟，制備出安全、有效的狐貍腦炎活疫苗。
具體實(shí)施例方式為了有效地控制狐貍腦炎疫情，本發(fā)明人于2003年利用自行分離、鑒定、致弱的犬腺病毒II型(Canine adenovirus type幻CAV-2RZ株進(jìn)行了狐貍腦炎活疫苗的研究。疫苗安全試驗(yàn)和效力試驗(yàn)結(jié)果表明，我們研制的狐貍腦炎活疫苗(CAV-2RZ株)安全可靠，無不良反應(yīng)，免疫狐貍后能產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)免疫力，可有效預(yù)防狐貍腦炎的發(fā)生。1.疫苗生產(chǎn)用毒株(1)病毒來源疫苗制造及檢驗(yàn)用毒種為犬腺病毒II型(Canine adenovirus type 2)CAV-2RZ 株細(xì)胞毒，由本發(fā)明人分離、鑒定、致弱、保管和供應(yīng)。2011年11月17日該株病毒已送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No. M75。(2)病毒株特性1)病毒含量將毒種用含2%新生牛血清的細(xì)胞營養(yǎng)液(MEM)作10倍系列稀釋，取10_4、10_5、 10_6、10_74個稀釋度，分別接種已長成單層的MDCK細(xì)胞96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種8孔，每孔100 μ 1，同時設(shè)不接毒對照組，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察96 120 小時，記錄細(xì)胞病變(CPE)的孔數(shù)。按Reed-Muench法計(jì)算TCID5tl (中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二 0 — 0年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明以下簡稱《中國獸藥典》)，每毫升病毒含量應(yīng)> IO6-5TCID5002)安全性將毒種經(jīng)肌肉注射接種2 10月齡健康易感狐貍(犬腺病毒中和抗體效價不高于1 4) 5只，IOml/只，觀察14日，應(yīng)無異常反應(yīng)。3)免疫原性用2 10月齡健康易感狐貍(犬腺病毒中和抗體效價不高于1 4)5只，每只肌肉注射接種毒種Iml (含IO4 5TCID5tl),同時設(shè)不接種對照狐貍5只。免疫后21日采血，分離血清，測定犬腺病毒中和抗體效價，免疫狐貍?cè)俨《局泻涂贵w效價均應(yīng)不低于1 30，對照狐貍?cè)俨《局泻涂贵w效價均應(yīng)不高于1 4。5)特異性將毒種作1000倍稀釋，與等量10倍稀釋的犬腺病毒-II型特異性抗血清混合，不中和對照加等體積MEMJS 37°C中和60分鐘，接種已長成單層的MDCK細(xì)胞M孔細(xì)胞培養(yǎng)板，中和組接種12孔，不中和對照和細(xì)胞對照各6孔，每孔0. 5ml。將細(xì)胞培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察96 120小時。中和組和細(xì)胞對照組應(yīng)不出現(xiàn)CPE，不中和對照組應(yīng)全部出現(xiàn)CPE。6)毒種保存_15°C以下保存，保存期為M個月；-70°C以下保存，保存期為60個月。2.狐貍腦炎活疫苗(CAV-2RZ株)的生產(chǎn)(1)將生長良好的MDCK細(xì)胞按常規(guī)方法傳代，待細(xì)胞長成單層后，傾去生長液，換以含2%毒種的維持液(含2%新生牛血清的MEM)，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)速為8 IOr/ h。(2)接種后，每日觀察1 2次細(xì)胞病變(CPE)，當(dāng)CPE達(dá)80%左右時即可收獲，凍融1次，置_15°C以下凍結(jié)保存，檢驗(yàn)備用。C3)將檢驗(yàn)合格的病毒液，按1 1的比例加入5%蔗糖-脫脂乳作穩(wěn)定劑，充分混合，定量分裝。(4)分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。3.狐貍腦炎活疫苗(CAV-2RZ株)的檢驗(yàn)(1)性狀微黃白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加入稀釋液后迅速溶解。(2)無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。(3)支原體檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無支原體生長。
(4)外源病毒檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法行檢驗(yàn)，應(yīng)無外源病毒污染。并參照現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定的方法，用Vero、F81、MDCK、BTC細(xì)胞進(jìn)行外源性犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。(5)鑒別檢驗(yàn)將疫苗稀釋至1頭份/ml，然后作100倍稀釋，與等量10倍稀釋的犬腺病毒-II型特異性抗血清混合，不中和對照加等體積MEM，經(jīng)37°C中和60分鐘，接種已長成單層的MDCK細(xì)胞M孔細(xì)胞培養(yǎng)板，中和組接種12孔，不中和對照和細(xì)胞對照各6孔，每孔0. 5ml。將細(xì)胞培養(yǎng)板置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察96 120小時。中和組和細(xì)胞對照組應(yīng)不出現(xiàn)CPE，不中和對照組應(yīng)全部出現(xiàn)CPE。(6)安全檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份將疫苗稀釋成每毫升含5頭份，肌肉注射接種2 10月齡健康易感狐貍(犬腺病毒中和抗體效價不高于1 4)5只，2ml/只，觀察14日，應(yīng)全部健活。(7)病毒含量測定將疫苗稀釋至1頭份/ml，再作10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_6、個稀釋度，分別接種已長成單層的MDCK細(xì)胞96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種8孔，每孔100 μ 1， 同時設(shè)不接毒對照孔，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察96 120小時，記錄CPE孔數(shù)，按 Reed-Muench法計(jì)算TCID5tl，每頭份疫苗病毒含量應(yīng)彡IO4-5TCID500(8)剩余水分測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定，應(yīng)符合獸用生物制品通則的規(guī)定。(9)真空度測定按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測定，應(yīng)符合規(guī)定。本發(fā)明涉及的微生物信息本發(fā)明所涉及的微生物菌種為犬腺病毒II型(Canine adenovirus type 2) CAV-2RZ株，該株病毒已于2011年11月17日該株病毒已送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No. M75。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明是利用本發(fā)明人自行分離、鑒定、致弱、保存的一株擁有優(yōu)良免疫原性的犬腺病毒CAV-2RZ株作為生產(chǎn)毒株，經(jīng)過收獲、配苗等步驟，制備出安全、有效的狐貍腦炎活疫苗。本發(fā)明采用的生產(chǎn)毒株能夠針對目前疾病流行情況，有效預(yù)防狐貍腦炎的發(fā)生，為毛皮動物疾病的控制創(chuàng)造條件。實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1犬腺病毒II型弱毒CAV-2RZ株安全試驗(yàn)為驗(yàn)證制苗用毒株犬腺病毒-II型弱毒CAV-2RZ株對狐貍的安全性，本發(fā)明人用犬腺病毒II型弱毒CAV-2RZ株Cl代病毒液經(jīng)肌肉途徑大劑量(IOml)接種狐貍，通過臨床觀察、病理組織學(xué)檢查，接種狐貍均未出現(xiàn)喉氣管炎臨床癥狀和病理變化，表明傳代致弱的犬腺病毒-II型CAV-2RZ株毒種對狐貍是安全的。實(shí)施例2犬腺病毒-II型CAV-2RZ株的免疫原性試驗(yàn)
毒株是否具有良好的免疫原性是篩選疫苗株的重要依據(jù)，因此，本發(fā)明人對犬腺病毒II型弱毒CAV-2RZ株免疫原性進(jìn)行了研究，并比較了疫苗免疫狐貍后中和抗體效價與攻毒保護(hù)相關(guān)性，確定抗體保護(hù)的臨界值，為制定疫苗的效力檢驗(yàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果如下表1CAV-2RZ株免疫原性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種狐貍腦炎活疫苗，其特征是本疫苗含有保藏號為CGMCC No. M75的犬腺病毒II 型(Canine adenovirus type 2)，該株病毒已于2011年11月17日該株病毒已送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No. M75。
2.一種狐貍腦炎活疫苗的制備方法，其特征是將保藏號為CGMCC No. 5475的犬腺病毒 II型接種MDCK細(xì)胞37°C培養(yǎng)，當(dāng)接毒細(xì)胞有80%出現(xiàn)病變時，收獲病毒細(xì)胞培養(yǎng)液加入常用的凍干保護(hù)劑，經(jīng)冷凍干燥制成凍干活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種狐貍腦炎活疫苗及其制備方法。本發(fā)明利用自行分離、鑒定、致弱、保存的一株犬腺病毒II型CAV-2RZ株作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，通過在MDCK細(xì)胞上進(jìn)行繁殖，經(jīng)過收獲、凍干等步驟，制備出安全、有效的狐貍腦炎活疫苗。本發(fā)明能夠有效預(yù)防狐貍腦炎的發(fā)生，為毛皮動物疫病的控制創(chuàng)造條件。
文檔編號A61P31/20GK102488894SQ201110455840
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者劉健, 孫培錄, 宋曉飛, 李營, 王蕾, 秦緒偉, 鮑海忠 申請人:齊魯動物保健品有限公司