專利名稱：一種紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
紫杉醇由wani等在1971年從短葉紅豆杉的樹皮中提取分離出來(lái)，是一種含二萜環(huán)類生物堿成分的抗癌活性藥物。1994年7月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)紫杉醇作為一種新型抗微管、 抗癌藥物進(jìn)入市場(chǎng)?，F(xiàn)已作為治療多種腫瘤，如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌等的一線用藥，對(duì)大腸癌、原發(fā)性肝癌、宮頸癌、直腸癌也有比較顯著的療效。紫杉醇治療腫瘤的機(jī)制主要是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡分子失活，抑癌基因的表達(dá)，激活免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，調(diào)控微管動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定等，對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷。紫杉醇作為近年來(lái)具有重大突破的新一代腫瘤化療藥物，對(duì)多種惡性腫瘤具有顯著的療效，越來(lái)越廣泛的用于臨床治療各種腫瘤。然而，紫杉醇難溶于水，制成注射劑有一定的困難，目前市面上常用的產(chǎn)品主要采用聚氧乙烯蓖麻油與乙醇以1 1的比例組成的混合液來(lái)穩(wěn)定和溶解制劑中的紫杉醇。由于聚氧乙烯蓖麻油在體內(nèi)能夠引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)、超過(guò)敏反應(yīng)，使得有超過(guò)2 %的嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生而引起死亡，并且該藥還有相當(dāng)強(qiáng)的心臟毒性，因此如何克服紫杉醇水不溶性、較大的毒副作用和靶向性低等缺點(diǎn)是目前亟待解決的問(wèn)題，開發(fā)方便安全的靶向給藥系統(tǒng)成為了紫杉醇大規(guī)模應(yīng)用的關(guān)鍵。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇組成的類似生物膜的雙分子層結(jié)構(gòu)。1971年Rymen等人開始將其作為藥物載體。由于其結(jié)構(gòu)類似生物膜，可包封水溶性和脂溶性藥物，具有提高藥物穩(wěn)定性、減少藥物用量、降低毒性；減輕變態(tài)反應(yīng)和免疫反應(yīng)；延緩釋放、降低體內(nèi)消除速度；改變藥物在體內(nèi)的分布等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。納米脂質(zhì)體是在常規(guī)脂質(zhì)體基礎(chǔ)上結(jié)合納米技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種新型載藥系統(tǒng)。 由于納米脂質(zhì)體的粒徑小，很好地解決了常規(guī)脂質(zhì)體包封率低的缺點(diǎn)。納米脂質(zhì)載體具有輔料相容性好、體外釋放可控性強(qiáng)、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。普通納米脂質(zhì)體注射給藥后，會(huì)受到血中的白蛋白、抗體、調(diào)理素等各種因素作用，運(yùn)輸過(guò)程中大部分被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system, RES)識(shí)別、攝取而產(chǎn)生被動(dòng)靶向作用，從而無(wú)法治療非RES疾病，并且可能對(duì)RES器官產(chǎn)生蓄積毒性。Woodle 等研究發(fā)現(xiàn)在脂質(zhì)體膜上加長(zhǎng)鏈聚乙二醇(PEG)可屏蔽RES的識(shí)別清除，增加脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的滯留時(shí)間，延長(zhǎng)藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，從而稱為長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。經(jīng)PEG化的納米脂質(zhì)體，會(huì)進(jìn)一步提高其在腫瘤組織/炎癥部位的富集，并可降低由于普通納米脂質(zhì)體在RES 系統(tǒng)的蓄積而造成的藥物對(duì)器官的毒性。但是該P(yáng)EG化的納米脂質(zhì)體，并不能主動(dòng)地靶向腫瘤部位，為了增強(qiáng)藥效，必須使載藥的納米脂質(zhì)體具有主動(dòng)靶向性。免疫脂質(zhì)體是利用抗體-抗原反應(yīng)具有特異性、高選擇性，將連有抗體的脂質(zhì)體主動(dòng)靶向傳遞至具有與所連抗體相對(duì)應(yīng)抗原的器官、組織和細(xì)胞的一類脂質(zhì)體。免疫脂質(zhì)體具有高效的靶向性，能將藥物準(zhǔn)確地靶向病變部位，提高療效，降低對(duì)正常組織的損傷。 研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、大腸癌、原發(fā)性肝癌、宮頸癌、直腸癌發(fā)生時(shí)， 表皮生長(zhǎng)因子受體(印idermal growth factor receptor, EGFR)會(huì)在癌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá) (蘇進(jìn)，徐新華，表皮生長(zhǎng)因子受體在腫瘤中的研究進(jìn)展，實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志2010年第26卷第2 期)，因此可以利用EGFR抗體為靶標(biāo)，結(jié)合藥物，通過(guò)與EGFR結(jié)合而將藥物靶向運(yùn)送到腫瘤組織，從而抑制惡性腫瘤。西普昔單抗(C225)是EGFR的單克隆抗體，能高效地識(shí)別腫瘤中的EGFR，利用它連接在脂質(zhì)體表面，作為引導(dǎo)紫杉醇脂質(zhì)體導(dǎo)向腫瘤組織的“彈頭”，使制備的紫杉醇免疫脂質(zhì)體對(duì)腫瘤具有主動(dòng)靶向性，從而有效抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)，降低毒副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種能識(shí)別并結(jié)合至實(shí)體瘤表面的EGFR抗原的抗體或抗體片段的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體及其制備方法和在治療EGFR陽(yáng)性腫瘤上的用途。本發(fā)明公布了制備上述PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的方法，包括(1)制備PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體；(2)制備巰基化的抗體；(3)用經(jīng)巰基化的抗體和PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體連接得到內(nèi)包裹紫杉醇外連接抗EGFR抗體的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體。本發(fā)明中脂質(zhì)體的制備采用具有良好的生物相容性的脂質(zhì)材料即 DC-Chol (3 β -[N- (N’，N，- 二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇)、P0PC (油酰磷脂酰膽堿)、 DSPE-PEG (甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)和DSPE-PEG-MAL(馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)；DC-Chol、POPC,DSPE-PEG和DSPE-PEG-MAL其摩爾比為1 1 0.05 0.01。本發(fā)明中連接于PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體表面的抗體選自抗體C225或EMD72000或其片段，更進(jìn)一步優(yōu)選抗體C225。PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體其粒徑范圍為40-300nm，更進(jìn)一步優(yōu)選80_200nm。本發(fā)明所公開的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的用途為治療EGFR陽(yáng)性腫瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、大腸癌、原發(fā)性肝癌、宮頸癌、直腸癌等。并可應(yīng)用于上述腫瘤患者的一線治療、二線治療、三線治療或用于已經(jīng)接受、但不應(yīng)答所有可使用的標(biāo)準(zhǔn)療法的患者群體。本發(fā)明所公開的上述PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的制備方法，詳細(xì)步驟如下(I)PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體的制備膽固醇氯甲酸溶于無(wú)水氯仿，在冰浴中滴加過(guò)量N，N-二甲基乙二胺制備 DC-Chol。將 DC-Chol、P0PC、DSPE-PEG 和 DSPE-PEG-MAL 以摩爾比為 1 1 0. 05 0.01， 溶于適量的氯仿溶液，30°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)吹干制成納米脂質(zhì)體薄膜。用蒸餾水和氯仿按1 2 的比例配置的機(jī)溶劑溶解紫杉醇，將紫杉醇溶液轉(zhuǎn)入上述納米脂質(zhì)體薄膜中，在20°C水浴條件下超聲5min，最終制得PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體。將制得的PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體通過(guò)微孔濾膜，濃縮后得到具有一定粒徑大小的PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體。(2)抗體的巰基化及PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的制備按照Trant’ s試劑盒附帶的實(shí)驗(yàn)步驟將抗體C225巰基化，室溫下，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下與PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)12h，得到PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體。進(jìn)一步地，本發(fā)明所公開的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的制備方法，還可以用于連接其他抗體的包裹紫杉醇的納米脂質(zhì)體。更進(jìn)一步的，利用本發(fā)明所公開的方法，還可以制備其他類型的抗腫瘤藥物的各種免疫納米脂質(zhì)體。


圖IPEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體制備流程示意圖；圖2PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體、PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體和紫杉醇治療原發(fā)性肝癌的療效曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體的制備將膽固醇氯甲酸酯用無(wú)水氯仿溶解，冰浴，滴加過(guò)量的N，N-二甲基乙二胺溶液，制備 DC-Chol。將 DC-Chol、POPC, DSPE-PEG 和 DSPE-PEG-MAL 按其摩爾比 1:1: 0. 05 0.01等體積加至茄形瓶中，30°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)吹干。加入用有機(jī)溶劑(蒸餾水氯仿=1 2)溶解的紫杉醇，渦旋震蕩，20°C超聲水浴5min，使得脂質(zhì)體包裹紫杉醇形成PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體。用同樣的方法將超純水代替紫杉醇，制得空白納米脂質(zhì)體作為實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照。將得到的PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體和空白納米脂質(zhì)體在薄膜擠出器的作用下依次通過(guò)400、200、100和80nm的微孔濾膜。然后過(guò)SWphar0SeCL-4B柱將未被包裹的紫杉醇除去。用HPLC法檢測(cè)游離紫杉醇含量，通過(guò)公式包封率=(總紫杉醇量-未包裹的脂質(zhì)體中紫杉醇量)/總紫杉醇量X 100%，計(jì)算PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的包封率。測(cè)定粒徑，加入10%海藻糖做凍干保護(hù)劑，凍干成PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體粉末，4°C 保存。實(shí)施例2 =PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的制備(1)巰基化抗體的制備將EGFR抗體C225按照Traut ’ s試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟巰基化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2) PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的制備將包裹有紫杉醇的納米脂質(zhì)體用2ml超純水重懸，加入Iml巰基化的抗體C225，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)12h。將反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)Swphar0SeCL-4B柱分離未連接的抗體和已經(jīng)連接抗體的PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體，洗脫液進(jìn)行熒光測(cè)定，繪制洗脫曲線。PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體制備流程示意圖如圖1所示。本發(fā)明的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體粒徑分布為80-200nm。粒徑的測(cè)量方法 取15μ 1的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體溶于超純水中，直接在Zeta sizer Nano S儀器上測(cè)量讀數(shù)即可(Malvern instruments, UK)。實(shí)施例3 =PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體用于治療原發(fā)性肝癌的裸小鼠實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)裸小鼠體重20g士 lg，均為雌性，接種SMMC-7721細(xì)胞2. 5 X IO6個(gè)/只，待腫瘤長(zhǎng)至5-10mm時(shí)隨機(jī)分組，每組5只，分別注射PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體、PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體、紫杉醇，其中紫杉醇的總含量相同，開始進(jìn)行治療。經(jīng)腹腔注射，每日一次，連續(xù)注射10天。觀察療效(1)療效曲線每隔2天測(cè)量一次腫瘤體積，以腫瘤體積(mm3)為縱坐標(biāo)，治療天數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制療效曲線，如圖2所示。(2)腫瘤抑制能力比較停藥24小時(shí)候處死全部小鼠，解剖瘤塊，稱量，比較三種條件下對(duì)腫瘤的抑制能力(表1)。表1 PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體、PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體和紫杉醇對(duì)腫瘤的
抑制能力
權(quán)利要求
1.PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體，其特征如下，其中包含識(shí)別并結(jié)合至實(shí)體瘤表面的 EGFR抗原的抗體或抗體片段，并且還在免疫納米脂質(zhì)體中封裝了抗腫瘤藥物紫杉醇，用于治療EGFR陽(yáng)性腫瘤。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體，其特征如下，該P(yáng)EG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的制備方法，包括a)制備PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體；b)制備巰基化的抗體；c)用經(jīng)巰基化的抗體和PEG化紫杉醇納米脂質(zhì)體連接得到內(nèi)包裹紫杉醇外連接抗 EGFR抗體的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體。
3.權(quán)利要求2所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體制備方法，其特征在于，其中步驟 a)中制備脂質(zhì)體的材料為 DC-Choi、POPC、DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL。
4.權(quán)利要求2所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體制備方法，其特征在于，其中步驟 a)中 DC-Chol、POPC、DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL 以摩爾比為 1 1 0. 05 0. 01 混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體的治療范圍，其特征如下，EGFR 陽(yáng)性腫瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、大腸癌、原發(fā)性肝癌、宮頸癌、直腸癌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體，其特征如下，所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體連接的抗體選自單克隆抗體C225或EMD72000或其片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體，其特征在于，所述的抗體優(yōu)選C225。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體，其特征如下，所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體粒徑大小范圍為40-300nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體粒徑，其特征如下，所述的PEG 化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體粒徑大小更具體的范圍為80-200nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體，其特征如下，該P(yáng)EG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體用于腫瘤患者的一線治療。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體，其特征如下，該P(yáng)EG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體用于腫瘤患者的二線治療。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體，其特征如下，該P(yáng)EG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體用于腫瘤患者的三線治療。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體，其特征如下，該P(yáng)EG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體用于治療已經(jīng)接受、但不應(yīng)答所有可使用的標(biāo)準(zhǔn)療法的患者群體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種內(nèi)包裹紫杉醇外連接抗EGFR抗體的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體及其制備方法和用途；本發(fā)明公開的內(nèi)包裹紫杉醇外連接抗EGFR抗體的PEG化紫杉醇免疫納米脂質(zhì)體具有生物靶向性良好、抑制腫瘤細(xì)胞作用顯著的特點(diǎn)，可以用于治療EGFR陽(yáng)性腫瘤。
文檔編號(hào)A61K31/337GK102379848SQ20111025752
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者梁蘭, 梁青, 王菁, 田雪, 鄒慶薇, 韓江微 申請(qǐng)人:天津冠勤生物科技有限公司