專利名稱：重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療因燒傷、燙傷及潰瘍帶來創(chuàng)面損傷的凝膠劑，具體地說是將重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(以下簡稱rhGM-CSF)與適當(dāng)基質(zhì)混合制成外用凝膠劑，本發(fā)明還涉及該凝膠劑的制備方法。
背景技術(shù)：
rhGM-CSF是由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的一種酸性蛋白。rhGM-CSF具有生白細(xì)胞作用，是一種調(diào)節(jié)造血和白細(xì)胞功能必須的細(xì)胞生長因子，它能夠全面改善慢性潰瘍的病理特征，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)，增強(qiáng)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的殺菌能力，在機(jī)體內(nèi)廣泛參與造血、免疫及抗感染等過程，對于傷口愈合起著重要作用。
選擇以活化巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞功能細(xì)胞因子rhGM-CSF促進(jìn)燒傷愈合，正在臨床研究方面得到重視。目前rhGM-CSF用于燒傷的治療絕大多數(shù)的方法是通過全身注射或局部給藥，取得了一定的效果。但是rhGM-CSF的體內(nèi)半衰期較短，經(jīng)過體循環(huán)后到達(dá)創(chuàng)面的有效藥物較少，而且給患者帶來許多不便，在臨床應(yīng)用方面受到限制。
因此，發(fā)明一種既保證rhGM-CSF的有效成分，又在臨床上方便使用且效果更加明顯的rhGM-CSF新劑型是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以直接涂抹在因燒傷、燙傷、潰瘍帶來的損傷創(chuàng)面上，具有抑制病菌感染，促進(jìn)創(chuàng)面組織愈合，縮短愈合時(shí)間，使用方便，易于清洗等作用，且對皮膚無刺激性，無毒副作用的rhGM-CSF凝膠劑。
本發(fā)明的另一目的是提供該rhGM-CSF凝膠劑的制備方法。
本發(fā)明的關(guān)鍵在于如何保持rhGM-CSF的生物活性，這是至關(guān)重要的，各組分比例混合不同就會(huì)影響rhGM-CSF的生物活性，從而影響維持其藥效，所以本發(fā)明各組分的篩選以生物活性檢定為判斷依據(jù)，同時(shí)還對制劑進(jìn)行了各項(xiàng)檢定，以保證其臨床用藥安全性，有效性。
本發(fā)明制備方法的關(guān)鍵在于1.制劑中使用的基質(zhì)不能時(shí)皮膚有任何刺激作用和毒副作用，各成分之間不應(yīng)該對人體和對rhGM-CSF活性有影響。
2.增強(qiáng)主要活性成分rhGM-CSF的穩(wěn)定性。也就是說通過調(diào)整各種組分的比例，將rhGM-CSF在制劑中所能發(fā)生的上述的有害變化降低至最低限度，甚至是完全避免，只有這樣才能保證制劑在制備、貯存、運(yùn)輸和病人使用中的藥物有效性。
3.rhGM-CSF是分子量較大的蛋白質(zhì)分子，并且有一定的空間結(jié)構(gòu)，容易受到空間位阻效應(yīng)的影響，所以要調(diào)整制劑中各個(gè)組分的比例，使rhGM-CSF能持續(xù)有效釋放。
本發(fā)明rhGM-CSF凝膠劑，由下述原料制成凝膠基質(zhì)(重量百分比)包括增稠劑0.1～10，濕潤劑0.1～20，防腐劑0.1～5，穩(wěn)定劑0.1～10，水55～99.5；人血白蛋白0.1克～20克/克基質(zhì)，重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子0.1微克～300微克/克基質(zhì)。
增稠劑是羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙二醇、卡伯母、甲殼胺，濃度分別為0.5％～5％。濕潤劑是甘油、丙二醇，濃度分別為0.1％～10％。防腐劑是對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、苯酚、山梨酸、苯甲酸鈉，濃度分別為0.1％～3％。穩(wěn)定劑是十二烷基硫酸鈉、吐溫、右旋糖苷、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素，濃度分別為0.5％～5％。
rhGM-CSF凝膠劑的制備方法是先將增稠劑、濕潤劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和水按上述比例混合并攪拌均勻制成水溶性凝膠基質(zhì)，然后在0.08～0.15MPa壓力，100～126℃條件下，將制成的水溶性凝膠基質(zhì)高壓滅菌15～30分鐘，自然冷卻到室溫，再加入上述配比的人血白蛋白和重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，緩慢攪拌混合均勻，制成凝膠劑。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、本發(fā)明選用的凝膠劑基質(zhì)合理，對皮膚無毒、無刺激作用，不沾染衣物，易于清洗；2、本發(fā)明采用的凝膠劑基質(zhì)為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，藥物溶解在其中，這樣可以使蛋白質(zhì)類藥物rhGM-CSF更加穩(wěn)定，藥物緩慢釋放，同時(shí)能吸收創(chuàng)面滲液形成高度親水的凝膠劑，從而控制創(chuàng)面的分泌和細(xì)菌的感染，同時(shí)加快藥物的溶出，在一定程度上起到緩釋作用，使其作用更加持久，促進(jìn)創(chuàng)面組織愈合，加快愈合速度，使rhGM-CSF的作用更加直接有效，復(fù)發(fā)率低；
3、本發(fā)明凝膠劑可以直接涂抹在燒傷、燙傷、潰瘍帶來的損傷創(chuàng)面上，使用方便，減輕了患者的用藥痛苦，便于患者接受及使用.
本發(fā)明所涉及到的檢定實(shí)驗(yàn)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)包括1、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)活性用TF-1依賴細(xì)胞株/MTT比色法進(jìn)行，4℃條件下，放置一年后仍保持活性。同時(shí)，對制劑的外觀、PH值、失水、均勻性作長期觀察，均無明顯變化，說明發(fā)明的制劑具有良好的穩(wěn)定性。
2、微生物限度實(shí)驗(yàn)沒有檢出綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌，符合要求。
3、皮膚過敏實(shí)驗(yàn)重組人巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑分別以每克含量0.4mg、0.8mg、1.6mg、1.0g(相當(dāng)于人臨床用量的1倍、2倍、4倍)涂于豚鼠正常及破損皮膚受試區(qū)，面積均為20cm2，結(jié)果表明，一次給藥和多次給藥，對照組與給藥組比較觀察，皮膚刺激反應(yīng)強(qiáng)度均＜0.5分，說明重組人巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑一次給藥和多次給藥對豚鼠完整和破損皮膚均無刺激性。
試驗(yàn)方法一次性給藥刺激試驗(yàn)取白色健康豚鼠72只，分為完整皮膚組和破損皮膚組。完整皮膚組分為6組，每組6只，雌雄各半，對照BFGF噴霧劑組，羧甲基纖維素鈉基質(zhì)對照組及空白對照組，在試驗(yàn)前24小時(shí)，將動(dòng)物背部脊柱右側(cè)剪毛，面積為4cm×5cm，完整皮膚組重組人巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑三個(gè)劑量按1g/只分別涂于受試區(qū)，陽性對照組BFGF噴霧劑劑量為3600AU/只，羧甲基纖維素鈉基質(zhì)對照組用量為1g/只，涂抹區(qū)域均為20cm2，空白對照組剪毛作為對照，不給任何藥物和基質(zhì)，破損皮膚組剪毛后消毒皮膚并用注射針頭劃“#”字型破口，以滲血為度，破損面積4cm×5cm，劃痕間距0.5cm，分細(xì)及給藥方法、劑量同完整皮膚組，各試驗(yàn)組涂藥后用紗布、膠布固定，24小時(shí)后用溫水去除殘留受試物，去除受試物后1h、24h、48h和72h觀察涂抹部位有無紅斑和水腫等變化，以及恢復(fù)時(shí)間。
多次給藥刺激試驗(yàn)取白色健康豚鼠72只，方法同前，每天涂藥，連續(xù)觀察涂抹藥物部位有無紅斑和水腫等變化，連續(xù)給藥10天后，將動(dòng)物處死，取皮膚標(biāo)本作鏡下病理觀察。
試驗(yàn)結(jié)果和評價(jià)每只動(dòng)物評分法和評價(jià)法按《新藥(西藥)臨床及臨床前研究指導(dǎo)原則》中皮膚刺激試驗(yàn)項(xiàng)的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。結(jié)果見表1、表2及表3，由表中可見，一次給藥和多次給藥，對照組與受試組比較觀察，未見紅斑及水腫，動(dòng)物全身狀況良好，無行為改變，皮膚刺激反應(yīng)強(qiáng)度均＜0.5分，鏡下病理觀察未見異常，說明重組人巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑一次給藥和多次給藥對豚鼠完整皮膚和破損皮膚均無刺激性，試驗(yàn)證明局部皮膚用藥頗安全。
表1 一次性給藥皮膚刺激評分結(jié)果

表2 多次給藥皮膚刺激評分結(jié)果

表3 皮膚刺激強(qiáng)度評價(jià)


在豚鼠皮膚刺激實(shí)驗(yàn)中，將本發(fā)明的rhGM-CSF凝膠劑涂抹于脫毛區(qū)，間隔1周連續(xù)三次，最后一次致敏后14天，將制劑涂抹于激發(fā)區(qū)，觀察到無發(fā)紅、發(fā)疹、水泡等現(xiàn)象，結(jié)果表明制劑無過敏反應(yīng)。
4、體外釋放實(shí)驗(yàn)參照DiBase MD等(Pharm Acta Helv， 1991，66(5-6)165)的方法進(jìn)行，體外釋放符合零級動(dòng)力學(xué)模式。
為表明本發(fā)明rhGM-CSF凝膠劑對因燒傷、燙傷、潰瘍帶來的創(chuàng)面損傷的治療效果，本發(fā)明臨床應(yīng)用情況如下以增稠劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、防腐劑制成的水溶性rhGM-CSF凝膠劑，直接涂抹于疾患處，利用藥物滲透而發(fā)揮治療作用，使用本制劑無不良反應(yīng)，適用于燒傷、燙傷及潰瘍等疾病療效較好。同時(shí)，凝膠劑所用輔料少，工藝簡單，便于操作，適用于臨床。
用法與用量將患處充分拭凈后，按損傷皮膚面積大小，用0.1～0.3μg/cm2，涂于患處，適當(dāng)包扎，即可。每日1～2次。
效價(jià)評價(jià)臨床應(yīng)用效果由醫(yī)師按自覺癥狀和查體所見綜合評定，分為痊愈、顯效、有效、無效四類，痊愈、顯效、有效合計(jì)為有效，治療組與對照組比較，結(jié)果見表4、表5。
表4 治療組臨床觀察結(jié)果類型例數(shù)痊愈顯效有效無效治愈率％有效率％深淺二度燒傷43 37 3 2 1 86 95.34燙傷85 78 6 1 0 91.76 100糖尿病引起潰瘍 23 20 1 1 1 86.96 95.65靜脈功能引起潰瘍52 47 2 1 2 90.496.15
表5 對照組臨床觀察結(jié)果類型用藥品種例數(shù) 痊愈 顯效 有效 無效 治愈率％ 有效率％深淺二度燒傷bFGF35302 1 2 85.71 94.28燙傷磺胺嘧啶鋅 36193 2 1252.78 66.67糖尿病引起潰瘍 FGF 118 1 0 2 72.73 81.82靜脈功能引起潰瘍紅霉素軟膏 24181 1 4 7583.33從表4、表5可見，rhGM-CSF凝膠劑臨床驗(yàn)證，在治療燒傷、燙傷及潰瘍。有效率分別在95％以上，證明rhGM-CSF凝膠劑是可行的，較合理。而對照組有效率在75％。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取甲基纖維素1g，甘油2g，對羥基苯甲酸乙酯1g，硫酸軟骨素1g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌15分鐘，冷卻到室溫，制成基質(zhì)部分。在基質(zhì)中加入人血白蛋白5g，rhGM-CSF100μg，同時(shí)緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實(shí)施例2取羧甲基纖維素鈉2g，丙二醇5g，對羥基苯甲酸甲酯3g，十二烷基硫酸鈉2g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌25分鐘，冷卻到室溫，制成基質(zhì)部分。在基質(zhì)中加入人血白蛋白1g，rhGM-CSF300μg，同時(shí)緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實(shí)施例3取聚乙二醇5g，丙二醇5g，山梨酸3g，吐溫3g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌15分鐘，冷卻到室溫，制成基質(zhì)部分。在基質(zhì)中加入人血白蛋白5g，rhGM-CSF 300μg，同時(shí)緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實(shí)施例4取卡伯母2g，甘油5g，對羥基苯甲酸甲酯1g，右旋糖苷1g，上述原料混合后成酸性，為保證蛋白不變性，加入三乙醇胺1g，調(diào)ph值，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌15分鐘，冷卻到室溫，制成其質(zhì)部分。在基質(zhì)中加入人血白蛋白3g，rhGM-CSF 100μg，同時(shí)緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實(shí)施例5取甲殼胺2g，丙二醇5g，苯甲酸鈉0.5g，吐溫5g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌25分鐘，冷卻到室溫，制成基質(zhì)部分。在基質(zhì)中加入人血白蛋白3g，rhGM-CSF 100μg，同時(shí)緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實(shí)施例6取羧甲基纖維素鈉5g，丙二醇10g，苯甲酸鈉0.5g，透明質(zhì)酸1g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.15MPa，126℃條件下，高壓滅菌15分鐘，冷卻到室溫，制成基質(zhì)部分。在基質(zhì)中加入人血白蛋白5g，rhGM-CSF 300μg，同時(shí)緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
權(quán)利要求
1.一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于它是由下述原料制成的凝膠劑凝膠基質(zhì)(重量百分比)增稠劑 0.1～10 濕潤劑 0.1～20 防腐劑 0.1～5穩(wěn)定劑 0.1～10 水 55～99.5人血白蛋白0.1克～20克/克基質(zhì)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子0.1微克～300微克/克基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于增稠劑是羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙二醇、卡伯母、甲殼胺，濃度分別為0.5％～5％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于濕潤劑是甘油、丙二醇，濃度分別為0.1％～10％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于防腐劑是對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、苯酚、山梨酸、苯甲酸鈉，濃度分別為0.1％～3％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于穩(wěn)定劑是十二烷基硫酸鈉、吐溫、右旋糖苷、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素，濃度分別為0.5％～5％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑的制備方法，其特征在于先將增稠劑、濕潤劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和水按上述比例混合并攪拌均勻制成水溶性凝膠基質(zhì)，然后在0.08～0.15MPa壓力，100～126℃條件下，將制成的水溶性凝膠基質(zhì)高壓滅菌15～30分鐘，自然冷卻到室溫，再加入上述配比的人血白蛋白和重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，緩慢攪拌混合均勻，制成凝膠劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠劑及其制備方法。它是按一定比例將增稠劑、濕潤劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和水混合，攪拌均勻，制成水溶性凝膠基質(zhì)，然后在0.08～0.15MPa壓力，100～126℃條件下，將制成的水溶性凝膠基質(zhì)高壓滅菌15～30分鐘，自然冷卻至室溫，加入一定濃度的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子蛋白溶液和人血白蛋白溶液，制成外用凝膠劑。本發(fā)明配方及制備方法獨(dú)特，治療因燒傷、燙傷及潰瘍帶來的創(chuàng)面損傷效果顯著；本發(fā)明使用方便，易清洗，對皮膚無刺激性，無毒副作用；本發(fā)明為重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的應(yīng)用提供了一種新的劑型。
文檔編號A61K9/00GK1517125SQ0310044
公開日2004年8月4日 申請日期2003年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月14日
發(fā)明者李樹奇 申請人:北京邁德康醫(yī)藥技術(shù)有限公司