專利名稱：一種腦蛋白水解物及其凍干粉針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說，涉及一種腦蛋白水解物及其凍干粉針。
背景技術(shù)：
腦蛋白水解物是一種大腦所特有的肽能神經(jīng)營養(yǎng)藥物。能以多種方式作用于中樞神經(jīng)，調(diào)節(jié)和改善神經(jīng)元的代謝，促進突觸的形成，誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化，并進一步保護神經(jīng)細胞免受各種缺血和神經(jīng)毒素的損害。常見用于頡腦外傷、腦血管病后遺癥伴有記憶減退及注意力集中障礙的癥狀改善。現(xiàn)有技術(shù)公開了多種腦蛋白水解物的制備方法及其制劑，如:中國專利ZLOl 130523.1公開了一種腦蛋白水解物注射液生產(chǎn)工藝，具體為:新鮮豬腦去除表面的粘膜及血潰等，加2倍體積的水勻漿，用雙層紗布過濾，濾液先用胃蛋白酶水解，用鹽酸調(diào)PH到1.5-1.6，水浴溫度40-45°C，時間為6_8小時，再用氫氧化鈉調(diào)PH到7.6-7.7，加胰酶(胰酶先溶解于0.02N的氯化鈣溶液中于4°C下活化30分鐘)水解，40-45°C水浴水解4-6小時，得到水解液，加鹽酸調(diào)PH值2.5-3.0，-20 _10°C下靜置10-30小時；在室溫條件下，用雙層紗布過濾，再加入1/2體積的水，加氫氧化鈉調(diào)PH值到中性，用孔徑為0.5-1.0um的微孔濾膜過濾澄清，取澄清液，依次用截流分子量為7萬和I萬的超濾膜超濾，得到的超濾液再用截流分子量為1000的超濾膜進行濃縮，得到的濃縮液加熱到100°C沸騰15分鐘，然后迅速冷卻到25°C以下，再依次經(jīng)過0.5-lum孔徑的微孔濾膜和截流分子量為7萬和I萬的超濾膜，得到的超濾液再經(jīng)121°C蒸氣滅菌30分鐘得到的除菌溶液稱為腦蛋白水解的混和多妝、氣基酸溶液精制品。中國專利ZL200610065169.0公開了一種腦蛋白水解物的生產(chǎn)方法，該方法包括如下步驟:(I)取經(jīng)檢驗 合格的新鮮或凍存健康豬腦，用膠體磨勻漿，收集勻漿液；(2)將勻漿液分別用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，進行過濾，收集濾出液；(3)將濾出液用羥基磷灰石層析柱進行吸附分離純化，調(diào)配肽圖，收集目標(biāo)物；(4)采用對分子截留為8KD的濾膜進行超濾，收集濾出液，進行定氮、氨基酸分析；(5)按國家藥品監(jiān)督管理局2000年12月28日頒布的編號為WS1-XG-25-2000藥品標(biāo)準(zhǔn)計算氨基酸用量，添加相應(yīng)氨基酸配制成濃配液，0.22 μ m濾膜進行精過濾，即得注射用腦蛋白水解物的原液。中國專利ZL200410022091.5公開了一種腦蛋白水解物制劑的制備方法。具體用新鮮或凍存豬腦去除表面的包膜及血管，加I 2倍體積的純化水勻漿，隔水蒸汽加熱至80 85°C，15分鐘，快速降溫至40 45°C時，用鹽酸調(diào)pH至1.5 2.0，用胃蛋白酶酶解3 12小時或沉淀分離取上清，調(diào)溫至40 42°C后，用氫氧化納調(diào)pH至7.7 8.0，用胰酶多酶在38 42°C條件下，酶解2 4小時，然后再用鹽酸調(diào)pH值2.5 3.0，-20 -10°C下靜置冷凍12 48小時；在室溫條件下，過濾，加氫氧化鈉調(diào)pH值到中性，用孔徑為0.2
1.0um的微孔無機膜過濾澄清，取澄清液，用截流分子量為I萬的超濾膜超濾，收集透過液，再用截流分子量為100 1000的納濾膜進行納濾濃縮，棄透過液，得到的濃縮液經(jīng)121°C蒸汽滅菌30分鐘，該除菌溶液為腦蛋白水解物精制品；調(diào)配L-色氨酸、L-酪氨酸，根據(jù)所需藥液量，計算需要添加的各種氨基酸用量，調(diào)配肽圖，與上述溶液配制成濃配液，然后稀配、灌裝成半成品，再經(jīng)115 121°C蒸汽滅菌30分鐘，制成無菌制劑。雖然上述技術(shù)方案都能得到一種腦蛋白水解物及其制劑，但普遍存在提取率低，均質(zhì)程度差的缺陷，間接影響了患者的用藥安全，限制了其的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一目的在于提供一種腦蛋白水解物，該提取物采用特殊的方法制備得至IJ，該制備方法避免了高溫對腦蛋白中有效成分的破壞，提高了腦蛋白水解物制劑的療效。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種腦蛋白水解物，所述提取物采用如下方法制備而成:(I)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至5 10Pa，保持壓力5 15min，后通入二氧化碳至壓力為10 18MPa，保持壓力20 25min ；(2)在轉(zhuǎn)速300 500rpm下，將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量5 8倍的液體二氧化碳中，加畢，攪拌20-60min，降溫至-70 _80°C，保持2 4h,然后5 IOmin將溫度升溫至40 50°C，將二氧化碳氣化；(3)向步驟2得到的凍融腦漿中 加入2-4倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量0.5 1%的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，30 40°C下水解3 4h，得酶解物；(4)將酶解物離心，取上清液，按上清液重量0.1-0.5%加入藥用活性碳，室溫下攪拌10_20min,用0.4 0.5 μ m微孔濾膜過濾除碳，再用0.22 0.30 μ m微孔濾膜過濾即得。進一步地，本發(fā)明優(yōu)選所述提取物采用如下方法制備而成:(I)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至8Pa，保持壓力lOmin，后通入二氧化碳至壓力為15MPa，保持壓力22min ；(2)在轉(zhuǎn)速400rpm下，將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量6.5倍的液體二氧化碳中，加畢，攪拌40min，降溫至_75°C，保持3h，然后8min內(nèi)將溫度勻速升溫至45°C，將二氧化碳氣化；(3)向步驟2得到的凍融腦漿中加入3倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量0.8%的木瓜蛋白酶，35°C下水解3.5h，得酶解物；(4)將酶解物離心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室溫下攪拌15min，用0.25 μ m微孔濾膜過濾即得。其中，步驟(4)所述離心為轉(zhuǎn)速2500rpm下離心20_30min,優(yōu)選25min。本發(fā)明通過將新鮮腦組織先經(jīng)二氧化碳飽和，后凍融、酶解處理，得到一種腦蛋白水解物。該提取方法能夠避免高溫提取對活性成分的破壞，采用溫和簡單的提取條件但同樣能夠使活性成分充分地提取處理，顯著提高了現(xiàn)有方法的收率，同時降低了生產(chǎn)成本。此外，本發(fā)明所述的方法，除作出特別限定的外，都可以選擇本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段來實現(xiàn)，如步驟I中的去脂勻質(zhì)，步驟2和3中的攪拌，以及步驟4中的過濾等。任意能夠?qū)崿F(xiàn)相應(yīng)目的的技術(shù)手段都可以用于實現(xiàn)本發(fā)明，具體選擇為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握。本發(fā)明第二目的在于提供含有上述腦蛋白水解物的凍干粉針。所述凍干粉針中腦蛋白水解物以總含氮量計，每支為20-80mg，優(yōu)選每支為30mg或60mg。含氮量的測定采用現(xiàn)有技術(shù)公知的測定法。
本發(fā)明進一步提供了上述凍干制劑的制備方法，所述制備方法包括如下步驟:
(I)在配液罐中加入60-70%的注射用水，加入處方量的腦蛋白水解物攪拌均勻；
(2)用6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.2-7.35，補水至處方量；
(3)從稀配罐取樣檢測可見異物合格后，進行中間體檢測:檢測合格后，經(jīng)雙級0.22 μ m微孔濾膜過濾至灌裝間待灌裝；
(4)冷凍干燥，即得。
其中，所述注射用水的量為每1000瓶(30mg)2500ml或每1000瓶(60mg)5000ml。
其中，所述的冷凍干燥為:
(4.1)先將制品溫度降至-45°C以下，保溫3-5小時；
(4.2)加熱板層，3-5小時內(nèi)升溫至-25°C，再6-9小時內(nèi)升溫至0°C，然后6_8小時升溫至20°C，最后3-5小時內(nèi)升溫至40°C并保溫4-16小時。
作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述的冷凍干燥為:
(4.1)先將制品溫度降至-45°C以下，保溫4小時；
(4.2)加熱板層，4小時內(nèi)勻速升溫至_25°C，再8小時內(nèi)勻速升溫至0°C，然后7小時內(nèi)勻速升溫至20°C，最后4小時內(nèi)勻速升溫至40°C并保溫6或12小時。
本發(fā)明所提供的腦蛋白水解物有效成分含量高，故治療效果優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品。同時，本發(fā)明提供了特殊的凍干工藝，使制備的凍干粉針具有顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的穩(wěn)定性，進一步確保了用藥安全。
具體實施方式
以下用實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作更詳細的解釋說明，但其并非是對本發(fā)明的限制。
實施例1腦蛋白水解物的制備
(I)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至8Pa，保持壓力lOmin，后通入二氧化碳至壓力為15MPa，保持壓力22min ；
(2)在轉(zhuǎn)速400rpm下，將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量6.5倍的液體二氧化碳中，加畢，攪拌40min，降溫至_75°C，保持3h，然后8min內(nèi)將溫度勻速升溫至45°C，將二氧化碳氣化；
(3)向步驟2得到的凍融腦漿中加入3倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量0.8%的木瓜蛋白酶，35°C下水解3.5h，得酶解物；
(4)將酶解物離心，轉(zhuǎn)速2500rpm下離心25min，取上清液，按上清液重量0.3%加入藥用活性碳，室溫下攪拌15min，用0.45 μ m微孔濾膜過濾除碳，再用0.25 μ m微孔濾膜過濾即得。
實施例2腦蛋白水解物的制備
(I)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至5Pa，保持壓力15min，后通入二氧化碳至壓力為IOMPa,保持壓力25min ；
(2)在轉(zhuǎn)速300rpm下，將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量5倍的液體二氧化碳中，加畢，攪拌60min，降溫至_70°C，保持2h，然后5min將溫度升溫至50°C，將二氧化碳氣化；(3)向步驟2得到的凍融腦漿中加入2倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量0.5%的木瓜蛋白酶，40°C下水解3h，得酶解物；(4)將酶解物離心，轉(zhuǎn)速2500rpm下離心26min取上清液，按上清液重量0.1%加入藥用活性碳，室溫下攪拌20min，用0.4 μ m微孔濾膜過濾除碳，再用0.22 μ m微孔濾膜過濾即得。實施例3腦蛋白水解物的制備(I)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至10Pa，保持壓力5min，后通入二氧化碳至壓力為18MPa,保持壓力20min ；(2)在轉(zhuǎn)速500rpm下，將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量8倍的液體二氧化碳中，加 畢，攪拌20min，降溫至_80°C，保持4h，然后IOmin將溫度升溫至40°C，將二氧化碳氣化；(3)向步驟2得到的凍融腦漿中加入4倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量1%的胃蛋白酶，30°C下水解4h，得酶解物；(4)將酶解物離心，轉(zhuǎn)速2500rpm下離心25min取上清液，按上清液重量0.5%加入藥用活性碳，室溫下攪拌lOmin，用0.5 μ m微孔濾膜過濾除碳，再用0.30 μ m微孔濾膜過濾即得。實施例4腦蛋白水解物的制備(I)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至8Pa，保持壓力8min，后通入二氧化碳至壓力為12MPa，保持壓力24min ；(2)在轉(zhuǎn)速350rpm下，將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量6倍的液體二氧化碳中，加畢，攪拌50min，降溫至-72°C，保持3h，然后6min將溫度升溫至40°C，將二氧化碳氣化；(3)向步驟2得到的凍融腦漿中加入3倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量0.6%的木瓜蛋白酶，32°C下水解4h，得酶解物；(4)將酶解物離心，轉(zhuǎn)速2500rpm下離心20min取上清液，按上清液重量0.4%加入藥用活性碳，室溫下攪拌12min，用0.45 μ m微孔濾膜過濾除碳，再用0.22 μ m微孔濾膜過濾即得。實施例5腦蛋白水解物的制備(I)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至6Pa，保持壓力15min，后通入二氧化碳至壓力為16MPa，保持壓力22min ；(2)在轉(zhuǎn)速380rpm下，將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量6倍的液體二氧化碳中，加畢，攪拌28min，降溫至_72°C，保持3h，然后7min將溫度升溫至48°C，將二氧化碳氣化；(3)向步驟2得到的凍融腦漿中加入2倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量0.5%的胃蛋白酶，36°C下水解4h，得酶解物；(4)將酶解物離心，轉(zhuǎn)速2500rpm下離心30min取上清液，按上清液重量0.3%加入藥用活性碳，室溫下攪拌16min，用0.4 μ m微孔濾膜過濾除碳，再用0.28 μ m微孔濾膜過濾即得。本發(fā)明進一步提供以上述腦蛋白水解物為活性成分制備的凍干粉針，所述凍干粉
針的處方為:
權(quán)利要求
1.一種腦蛋白水解物，其特征在于，所述提取物采用如下方法制備而成: (1)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至5 lOPa，保持壓力5 15min，后通入二氧化碳至壓力為10 18MPa，保持壓力20 25min ； (2)在轉(zhuǎn)速300 500rpm下，將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量5 8倍的液體二氧化碳中，加畢，攪拌20-60min，降溫至-70 _80°C，保持2 4h，然后5 IOmin將溫度升溫至40 50°C，將二氧化碳氣化； (3)向步驟2得到的凍融腦漿中加入2-4倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量0.5 1%的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，30 40°C下水解3 4h，得酶解物； (4)將酶解物離心，取上清液，按上清液重量0.1-0.5%加入藥用活性碳，室溫下攪拌10_20min,用0.4 0.5 μ m微孔濾膜過濾除碳,再用0.22 0.30 μ m微孔濾膜過濾即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦蛋白水解物，其特征在于，所述提取物采用如下方法制備而成: (1)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至8Pa，保持壓力lOmin，后通入二氧化碳至壓力為15MPa，保持壓力22min ； (2)在轉(zhuǎn)速400rpm下，將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量6.5倍的液體二氧化碳中，加畢，攪拌40min，降溫至_75°C，保持3h，然后8min內(nèi)將溫度勻速升溫至45°C，將二氧化碳氣化； (3)向步驟2得到的凍融腦漿中加入3倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量0.8%的木瓜蛋白酶，35°C下水解3.5h，得酶解物； (4)將酶解物離心，取上 清液，按上清液重量0.3%加入藥用活性碳，室溫下攪拌15min，用0.45 μ m微孔濾膜過濾除碳，再用0.25 μ m微孔濾膜過濾即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腦蛋白水解物，其特征在于，步驟(4)所述離心為轉(zhuǎn)速2500rpm 下離心 20_30min。
4.含有權(quán)利要求1 3任意一項所述腦蛋白水解物的凍干粉針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凍干粉針，其特征在于:所述凍干粉針中腦蛋白水解物以以總含氮量計，每支為20-80mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凍干粉針，其特征在于:所述凍干粉針中腦蛋白水解物以以總含氮量計，每支為30mg或60mg。
7.權(quán)利要求4所述凍干粉針的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)在配液罐中加入60-70%的注射用水，加入處方量的腦蛋白水解物攪拌均勻； (2)用6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.2-7.35，補水至處方量； (3)從稀配罐取樣檢測可見異物合格后，進行中間體檢測:檢測合格后，經(jīng)雙級0.22 μ m微孔濾膜過濾至灌裝間待灌裝； (4)冷凍干燥，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述的冷凍干燥為: (4.1)先將制品溫度降至-45°C以下，保溫3-5小時； (4.2)加熱板層，3-5小時內(nèi)升溫至-25°C，再6-9小時內(nèi)升溫至0°C，然后6_8小時升溫至20°C，最后3-5小時內(nèi)升溫至40°C并保溫4-16小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于:所述的冷凍干燥為:(4.1)先將制品溫度降至_45°C以下，保溫4小時； (4.2)加熱板層，4小時內(nèi)勻速升溫至-25°C，再8小時內(nèi)勻速升溫至0°C，然后7小時內(nèi)勻速 升溫至20°C，最后4小時內(nèi)勻速升溫至40°C并保溫6或12小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腦蛋白水解物及其制備方法，所述提取物采用如下方法制備而成(1)取新鮮健康豬腦，去除脂肪，勻漿，然后抽真空至5～10Pa，保持壓力5～15min，后通入二氧化碳至壓力為10～18MPa，保持壓力20～25min；(2)將二氧化碳飽和的去脂腦漿緩慢加入到體積為去脂腦漿重量5～8倍的液體二氧化碳中，加畢，攪拌0.5-2h，降溫至-70～-80℃，保持2～4h，然后5～10min將溫度升溫至40～50℃，將二氧化碳氣化；(3)向步驟2得到的凍融腦漿中加入2-4倍重量的注射用水，攪拌均勻，再加入相當(dāng)于凍融腦漿重量0.5～1%的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，30～40℃下水解3～4h，得酶解物；(4)將酶解物離心，取上清液，活性炭吸附，脫碳，過濾即得。
文檔編號A61P25/28GK103142991SQ201310102329
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者李立忠, 王勇, 解曉榮, 李潤寶, 蘇志強, 姚荷云, 閆潔, 胡成偉 申請人:山西普德藥業(yè)股份有限公司