專利名稱：一種溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米顆粒藥物的制備方法，尤其涉及一種應(yīng)用于腎纖維化治療的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法。
背景技術(shù)：
腎間質(zhì)纖維化病理機(jī)制有多環(huán)節(jié)與多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，目前尚無(wú)特異有效的治療藥物，而多采用綜合措施。傳統(tǒng)的治療藥物主要有:ACE1、血管緊張素II i型受體拮抗劑(ATlRA)、可溶性TGF-β抗體等。然而由于傳統(tǒng)藥物的靶向性差，所以抗纖維化的治療效果差，浪費(fèi)大量的醫(yī)療資源。我國(guó)在防治腎間質(zhì)纖維化疾病中有悠久的歷史，目前研究較多的中藥有姜黃素、丹參、大黃、冬蟲夏草、慢腎康、大黃庶蟲丸等。姜黃素(curcumin, CM)是從植物姜黃Curcumalonga L.中提取的主要有效成分，具有抗腫瘤、抗炎和降血脂等作用。目前已有學(xué)者證實(shí)姜黃素能干擾MCs細(xì)胞周期分布，具有抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，延緩腎小球硬化的作用(彭文李琦付文成等《姜黃素及OX-LDL對(duì)系膜細(xì)胞凋亡及FAP-1和bag-Ι表達(dá)的影響》，上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào).2007，21 (4):54-57 ;王浩、付文成、王云滿等《姜黃素及氧化低密度脂蛋白對(duì)系膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響》上海醫(yī)學(xué).2007，30 (7):545-547.)。然而目前含姜黃素的活血化瘀中藥尚缺乏明確的抗纖維化機(jī)理，同時(shí)靶向性較差。納米微粒具有小尺寸效應(yīng)，表面效應(yīng)及很強(qiáng)的吸附性和生物活性，表現(xiàn)出許多優(yōu)異性能和全新的功能，可作為載體，改變藥物在體內(nèi)的分布，提高了藥物吸收利用度和穩(wěn)定性，改善藥物性質(zhì)和祀向性。在國(guó)外的一些研究中，現(xiàn)有技術(shù)中已有將姜黃素載入納米微粒治療大鼠囊性纖維化，實(shí)現(xiàn)了姜黃素抗纖維化的祀向治療(Cartiera MS, FerreiraEC, Caputo C， et al.Partial correction of cystic fibrosis defects with PLGAnanoparticles, encapsulating curcumin.Mol Pharm.2010 Feb I; 7 (I): 86-93.X 但腎臟是人體的重要器官，具有保持水、電解質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物質(zhì)的平衡作用。目前現(xiàn)有技術(shù)中使用較成熟的姜黃素聚乙二醇(polyglycol，PEG)和聚乳酸(PLA)嵌段共聚物對(duì)于腎間質(zhì)沒有很好的腎靶向性。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用于腎纖維化治療的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法。本發(fā)明的一種溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，包括制備姜黃素納米顆粒的步驟，其中，還包括以下步驟:
步驟1，將姜黃素納米顆粒和溶菌酶在溶劑中混合并加入多肽偶合劑攪拌，所述姜黃素納米顆粒:溶菌酶的質(zhì)量比為1:4飛； 步驟2，將攪拌后的溶液透析、進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述步驟I的溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、戊烷、己烷、辛烷、苯、甲苯、二甲苯、乙腈、卩比啶、苯酚等。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述步驟I中的攪拌時(shí)間為2(Γ36小時(shí)。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述步驟2中的透析時(shí)間為24 36小時(shí)。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述多肽偶合劑為EDC.HCl (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)、HATU (2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯)、HOBt (N-羥基苯并三氮唑)中的一種或多種。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述姜黃素納米顆粒的載體為聚乙二醇(polyglycol, PEG)和聚乳酸(PLA)的共聚物。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述制備姜黃素納米顆粒的步驟包括:
將有機(jī)溶劑、姜黃素、聚乙二醇和聚乳酸的共聚物、乳化劑、純化水混合，用高剪切乳勻機(jī)分散，并超聲乳化；然后攪拌揮發(fā)有機(jī)溶劑；最后調(diào)節(jié)pH值至酸性，加三氯甲烷萃取，，收集有機(jī)相，并用無(wú)水硫酸鎂干燥，除去有機(jī)溶劑，得到姜黃素納米微粒。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述姜黃素的加入量為2 3.2mg/ml有機(jī)溶劑、聚乙二醇和聚乳酸的共聚物的加入量為15 21mg/mg姜黃素。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，乳化劑的加入量為2 3ml/ml有機(jī)溶劑。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中 ，純化水的加入量為5飛ml/ml有機(jī)溶劑。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、四氫呋喃，二氯甲烷、三氯甲烷、正乙烷、環(huán)乙烷、三乙烷、甲醇、異丙醇、正丁醇、丙酮。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述乳化劑選自6 12%的聚乙烯醇(PVA)、聯(lián)苯酚聚氧乙烯醚甲醛縮合物、芳烷基酚聚氧乙烯醚甲醛縮合物、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛縮合物、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物水溶液。LZM又稱胞壁質(zhì)酶(muramidase)或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase),是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。LZM作為一適宜的腎祀向載體，具有可供藥物連接的功能基團(tuán)，在腎臟中特異性蓄積，特別是通過(guò)重吸收機(jī)制，在腎近端小管中蓄積，但被連接藥物對(duì)其理化性質(zhì)影響不大。本發(fā)明將溶菌酶連接進(jìn)姜黃素納米顆粒中，結(jié)合了姜黃素對(duì)腎纖維化治療的功效和溶菌酶對(duì)腎間質(zhì)的靶向性的特性，并且利用了納米顆粒的小尺寸效應(yīng)，制備了具有小尺寸效應(yīng)的帶腎靶向溶菌酶的姜黃素顆粒。從而能夠有效的治療腎纖維化。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的實(shí)施例中，一種溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，包括制備姜黃素納米顆粒的步驟和以下步驟:
步驟1，將姜黃素納米顆粒和溶菌酶在溶劑中混合并加入多肽偶合劑攪拌，所述姜黃素納米顆粒:溶菌酶的質(zhì)量比為1:4飛；
步驟2，將攪拌后的溶液透析、進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。本發(fā)明的實(shí)施例中將溶菌酶連接進(jìn)姜黃素納米顆粒中，結(jié)合了姜黃素對(duì)腎纖維化治療的功效和溶菌酶對(duì)腎間質(zhì)的靶向性的特性，并且利用了納米顆粒的小尺寸效應(yīng)，制備了具有小尺寸效應(yīng)的帶腎靶向溶菌酶的姜黃素顆粒。從而能夠有效的治療腎纖維化。在本發(fā)明的實(shí)施例中，姜黃素納米顆粒的載體優(yōu)選聚乙二醇和聚乳酸的共聚物，如前所述，因?yàn)樵摲N納米顆粒在現(xiàn)有技術(shù)中研究的較為成熟，當(dāng)然在其他實(shí)施例中，也可使用其他姜黃素納米顆粒，本實(shí)施例對(duì)此不作限制。在本發(fā)明的實(shí)施例中，溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、戊烷、己烷、辛烷、苯、甲苯、二甲苯、乙腈、吡啶、苯酚等，優(yōu)選乙醇溶液。多肽偶合劑為EDC.HCl、HATU、H0Bt中的一種或多種，優(yōu)選EDC -HCUHOBt。當(dāng)然，在其他實(shí)施例中，也可選用其他溶劑和多肽偶合劑，本實(shí)施例對(duì)此不作限制。下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)闡釋。實(shí)施例1
將20ml 二氯甲烷、64mg姜黃素、60mll2%聚乙烯醇、1.344g聚乙二醇和聚乳酸的共聚物、IOOml純化水混合，用高剪切乳勻機(jī)在12000rpm轉(zhuǎn)速下剪切8min分散，并在300w功率下超聲8次，每次30s ;然后攪拌揮發(fā)二氯甲烷；最后調(diào)節(jié)PH至酸性，加三氯甲烷萃取，并用無(wú)水硫酸鎂干燥，得到姜黃素納米微粒。將姜黃素納米顆粒Ig和5g溶菌酶在乙醇溶液中混合并加入EDC -HCUHOBt攪拌24小時(shí)；然后將攪拌后的溶液透析48小時(shí)，并進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。得到的溶菌酶姜黃素納米顆粒的粒徑101.5nm，有效直徑正態(tài)分布，姜黃素含量2.58%。多分散指數(shù)0.252，在介質(zhì)20%乙醇溶液及0.25%Tween-80溶液中均呈現(xiàn)緩慢釋放的特征，沒有發(fā)生突釋現(xiàn)象。實(shí)施例2
將20ml 二氯甲烷、40mg姜黃素、40ml6%聚乙烯醇、0.6g聚乙二醇和聚乳酸的共聚物、120ml純化水混合，用高剪切乳勻機(jī)在12000rpm轉(zhuǎn)速下剪切8min分散，并在300w功率下超聲8次，每次30s ;然后攪拌 揮發(fā)二氯甲烷；最后調(diào)節(jié)PH至酸性，加三氯甲烷萃取，并用無(wú)水硫酸鎂干燥，得到姜黃素納米微粒。將姜黃素納米顆粒0.8g和3.2g溶菌酶在乙醇溶液中混合并加入EDC.HCUHOBt攪拌36小時(shí)；然后將攪拌后的溶液透析24小時(shí)，并進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。得到的溶菌酶姜黃素納米顆粒的粒徑105.6nm，有效直徑正態(tài)分布，姜黃素含量2.38% ;多分散指數(shù)0.253，在介質(zhì)20%乙醇溶液及0.25%Tween-80溶液中均呈現(xiàn)緩慢釋放的特征，沒有發(fā)生突釋現(xiàn)象。實(shí)施例3
將15ml 二氯甲烷、35mg姜黃素、35mll0%聚乙烯醇、0.6g聚乙二醇和聚乳酸的共聚物、80ml純化水混合，用高剪切乳勻機(jī)在12000rpm轉(zhuǎn)速下剪切8min分散，并在300w功率下超聲8次，每次30s ;然后攪拌揮去二氯甲烷；最后調(diào)節(jié)PH至酸性，加三氯甲烷萃取，并用無(wú)水硫酸鎂干燥，得到姜黃素納米微粒。將姜黃素納米顆粒0.5g和2g溶菌酶在乙醇溶液中混合并加入EDC -HCUHOBt攪拌24小時(shí)；然后將攪拌后的溶液透析48小時(shí)，并進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。得到的溶菌酶姜黃素納米顆粒的粒徑112.3nm，有效直徑正態(tài)分布，姜黃素含量
2.08% ;多分散指數(shù)0.252，在介質(zhì)20%乙醇溶液及0.25%Tween-80溶液中均呈現(xiàn)緩慢釋放的特征，沒有發(fā)生突釋現(xiàn)象。實(shí)施例4
將16ml 二氯甲烷、40mg姜黃素、40ml8%聚乙烯醇、0.8g聚乙二醇和聚乳酸的共聚物、80ml純化水混合，用高剪切乳勻機(jī)在10000rpm轉(zhuǎn)速下剪切8min分散，并在300w功率下超聲8次，每次30s ;然后攪拌揮去二氯甲烷；最后調(diào)節(jié)PH至酸性，加三氯甲烷萃取，并用無(wú)水硫酸鎂干燥，得到姜黃素納米微粒。將姜黃素納米顆粒0.8g和3.2g溶菌酶在乙醇溶液中混合并加入EDC.HCUHOBt攪拌20小時(shí)；然后將攪拌后的溶液透析48小時(shí)，并進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。得到的溶菌酶姜黃素納米顆粒的粒徑105.6nm，有效直徑正態(tài)分布，姜黃素含量2.38% ;多分散指數(shù)0.255，在介質(zhì)20%乙醇溶液及0.25%Tween-80溶液中均呈現(xiàn)緩慢釋放的特征，沒有發(fā)生突釋現(xiàn)象。實(shí)施例5
將30ml 二氯甲烷、50mg姜黃素、50ml8%聚乙烯醇、1.2g聚乙二醇和聚乳酸的共聚物、80ml純化水混合，用高剪切乳勻機(jī)在12000rpm轉(zhuǎn)速下剪切8min分散，并在300w功率下超聲8次，每次30s ;然后攪拌揮去二氯甲烷；最后調(diào)節(jié)PH至酸性，加三氯甲烷萃取，并用無(wú)水硫酸鎂干燥，得到姜黃素納米微粒。將姜黃素納米顆粒0.8g和3.2g溶菌酶在乙醇溶液中混合并加入EDC.HCUHOBt攪拌24小時(shí)；然后將攪拌后的溶液透析48小時(shí)，并進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。得到的溶菌酶姜黃素納米顆粒的粒徑110.5nm，有效直徑正態(tài)分布，姜黃素含量2.58% ;多分散指數(shù)0.255，在介質(zhì)20%乙醇溶液及0.25%Tween-80溶液中均呈現(xiàn)緩慢釋放的特征，沒有發(fā)生突釋現(xiàn)象。實(shí)施例6
將32ml 二氯甲烷、80mg姜黃素、80ml8%聚乙烯醇、1.6g聚乙二醇和聚乳酸的共聚物、80ml純化水混合，用高剪切乳勻機(jī)在12000rpm轉(zhuǎn)速下剪切8min分散，并在300w功率下超聲8次，每次30s ;然后攪拌揮去二氯甲烷；最后調(diào)節(jié)PH至酸性，加三氯甲烷萃取，并用無(wú)水硫酸鎂干燥，得到姜黃素納米微粒。將姜黃素納米顆粒1.2g和4.8g溶菌酶在乙醇溶液中混合并加入EDC.HCUHOBt攪拌24小時(shí)；然后將攪拌后的溶液透析48小時(shí)，并進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。得到的溶菌酶姜黃素納米顆粒的粒徑108.6nm，有效直徑正態(tài)分布，姜黃素含量2.78% ;多分散指數(shù)0.251，在介質(zhì)20%乙醇溶液及0.25%Tween-80溶液中均呈現(xiàn)緩慢釋放的特征，沒有發(fā)生突釋現(xiàn)象。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，包括制備姜黃素納米顆粒的步驟，其特征在于，還包括以下步驟: 步驟1，將姜黃素納米顆粒和溶菌酶在溶劑中混合并加入多肽偶合劑攪拌，所述姜黃素納米顆粒:溶菌酶的質(zhì)量比為1:4飛； 步驟2，將攪拌后的溶液透析、進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。
2.按權(quán)利要求1所述的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟I的溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、戊烷、己烷、辛烷、苯、甲苯、二甲苯、乙腈、吡唆、苯酚等。
3.按權(quán)利要求1所述的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟I中的攪拌時(shí)間為2(Γ36小時(shí)。
4.按權(quán)利要求1所述的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟2中的透析時(shí)間為2Γ48小時(shí)。
5.按權(quán)利要求1所述的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述多肽偶合劑為EDC.HCl、HATU、HOBt中的一種或多種。
6.按權(quán)利要求1所述的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述姜黃素納米顆粒的載體為聚乙二醇和聚乳酸的共聚物。
7.按權(quán)利要求6所述的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述制備姜黃素納米顆粒的步驟包括: 將有機(jī)溶劑、姜黃素、聚乙二醇和聚乳酸的共聚物、乳化劑、純化水混合，用高剪切乳勻機(jī)分散，并超聲乳化；然后攪拌揮發(fā)有機(jī)溶劑；最后調(diào)節(jié)pH值至酸性，加三氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，并用無(wú)水硫酸鎂干燥，除去有機(jī)溶劑，得到姜黃素納米微粒。
8.按權(quán)利要求7所述的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述姜黃素的加入量為2 3.2mg/ml有機(jī)溶劑、聚乙二醇和聚乳酸的共聚物的加入量為15 21mg/mg姜黃素。
9.按權(quán)利要求7所述的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述乳化劑的加入量為2 3ml/ml有機(jī)溶劑。
10.按權(quán)利要求7所述的溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述純化水的加入量為5飛ml/ml有機(jī)溶劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種溶菌酶姜黃素納米顆粒的制備方法，包括制備姜黃素納米顆粒的步驟，其中，還包括以下步驟將姜黃素納米顆粒和溶菌酶在溶劑中混合并加入多肽偶合劑攪拌，所述姜黃素納米顆粒溶菌酶的質(zhì)量比為1:4~5；然后將攪拌后的溶液透析、進(jìn)行濃縮后真空干燥得溶菌酶姜黃素納米顆粒。本發(fā)明制備了具有小尺寸效應(yīng)的帶腎靶向溶菌酶的姜黃素顆粒，從而能夠有效的治療腎纖維化。
文檔編號(hào)A61K31/12GK103083679SQ201110343188
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者彭文, 王云滿, 王浩, 殷佩浩, 李琦, 金周慧, 劉育軍, 付文成, 朱冰冰, 姚衛(wèi)國(guó), 程蔚蔚, 孫仲倫 申請(qǐng)人:上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院