專利名稱：一種含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療器械敷料類，具體地說它是采用組織工程方法以胎牛皮及牛跟腱的膠原為支架構(gòu)建皮膚組織工程支架的方法。
背景技術：
隨著組織工程科學的出現(xiàn)和發(fā)展，皮膚創(chuàng)傷修復敷料研究已從單純的創(chuàng)傷包覆敷料研究轉(zhuǎn)向活性人工皮膚研究，利用組織工程構(gòu)建的活性人工皮膚成為皮膚創(chuàng)傷修復的最佳選擇。
皮膚組織工程支架的研究是組織工程研究的重點之一，已有近20年的歷史，人們對以PLGA、乙丙交酯為主的聚酯類和以絲素、膠原為主的天然生物材料進行深入研究表明，聚酯類雖然生物性能良好，但降解后的產(chǎn)物會使周圍組織酸度升高，在使用上受到限制；以膠原為主的天然生物材料因具有良好的生物相容性和促進組織修復再生、止血等特點日益引起重視。
膠原蛋白具有G-x-y的重復結(jié)構(gòu)域，種屬間差異較小，屬免疫原性較低的蛋白質(zhì)大分子，但不同種屬和同種屬間仍存在差異，這一差異導致膠原存在一定的免疫特性。
膠原溶液經(jīng)冷凍干燥形成的膠原海綿膜彈性差、易破碎、穩(wěn)定性差，因而需外加交聯(lián)劑或經(jīng)特殊處理進行交聯(lián)。
已有的以膠原蛋白為原料制成膠原海綿膜作為創(chuàng)傷敷料的技術中，有的以戊二醛作為交聯(lián)劑，提高了膠原海綿膜的強度、韌性和穩(wěn)定性，但已有報道證實戊二醛具有明顯的細胞毒性，以含有戊二醛的海綿膜培養(yǎng)細胞，細胞向內(nèi)生長很少，并且隨著膠原海綿膜在體內(nèi)的逐漸降解，戊二醛單體也會隨之釋放入體液中，對肌體產(chǎn)生毒害，因此戊二醛不是理想的交聯(lián)劑；有的用硫酸軟骨素作為交聯(lián)劑，提高了膠原海綿膜的強度和對酶的耐受性，但硫酸軟骨素與膠原分子只能弱鍵結(jié)合，其本身具有促進疤痕形成、降低膠原凝血能力等缺點，同樣不是理想的交聯(lián)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是為了克服已有技術的缺點不足之處，提供一種無抗原性、強度高、柔韌性和耐酶性好、對肌體無毒害、含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建方法。
采用以下工藝技術可實現(xiàn)本發(fā)明的目的(a)、以胎牛皮或牛跟腱為基料，按常規(guī)方法進行脫毛、去筋膜及脂肪和污血、清洗、冷凍、切薄片，用丙酮脫水，再用石油醚脫脂，制成脫水脫脂的胎牛皮或牛跟腱為原料，用雙蒸水清洗原料后加入反應器內(nèi)，加入原料重量1～5％的胃酶或無花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，與原料重量10倍的水配制的水溶液進行一次酶處理，在20～40℃、pH＝2～8條件下、機械振動8～12小時，降解組織纖維間的共價鍵，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀用雙蒸餾水洗滌三次以上，加入原料重量的50～150倍的0.5M醋酸溶液，在0～20℃溫度下，振動24～32小時，再加入氯化鈉，使溶液中氯化鈉濃度達到2M，沉淀完全后，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀裝入透析袋進行透析3～4次，收集透析后膠原溶液，加入反應器內(nèi)，并加入上述原料重量1～3％的無花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，與原料重量10倍的配制的水溶液進行二次酶處理，在30～40℃、pH＝2～8條件下、機械振動4～8小時，去除抗原決定簇；再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清液用原料重量50～150倍的0.05～0.5M的醋酸水溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的無抗原性膠原溶液；(b)、再將(a)項的無抗原性膠原溶液倒入預冷模型中，在-10～-70℃溫度下冷凍4～24小時，再真空冷凍干燥24～48小時，得到孔徑均勻，厚度為0.1～0.5mm的膠原海綿膜，然后置入0.5～10％濃度的丙三醇水溶液中，丙三醇水溶液用量為膠原海綿膜重量50～150倍，吸附膨脹后取出膠原海綿膜，在105～130℃溫度下，真空干燥18～32小時，得到干膠原海綿膜；(c)、將肝素溶于0.005～1M的醋酸水溶液中，水溶液肝素含量為0.1～10mg/ml，然后用100目濾網(wǎng)過濾，得到肝素醋酸水溶液；(d)、將表皮生長因子溶于三蒸水中，三蒸水中表皮生長因子的含量為0.001～0.1μg/ml，得到表皮生長因子水溶液；(e)、最后將(c)項的肝素醋酸水溶液和(d)項的表皮生長因子水溶液按體積比1∶1～50的比例混合，機械振動48小時后，將上述混合液再與5％的丙三醇水溶液按體積比0.1～5∶100混合后，浸潤(b)項的干膠原海綿膜，潤濕后，在-10～-70℃溫度下，冷凍4～10小時，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點及效果1)、本發(fā)明制成的皮膚組織工程支架所用膠原海綿膜無抗原性。
膠原的抗原決定簇位于膠原分子的非螺旋的尾肽部分，本發(fā)明首先采用專一性強的胃酶或無花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶對膠原的共價鍵進行定向切除，然后用無花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶對膠原的尾肽進行切除，使膠原不再具有抗原性。
2)、采用增塑和熱交聯(lián)聯(lián)合處理工藝技術，制成的皮膚組織工程支架強度高、柔韌性和耐酶性好，對創(chuàng)傷肌體無毒害。
已有技術的交聯(lián)劑因會對肌體產(chǎn)生毒害等均存在一定缺陷，本發(fā)明采用以丙三醇增塑和熱交聯(lián)聯(lián)合處理的方法，制成的皮膚組織工程支架，具有強度高、柔韌性和耐酶性好、對肌體無毒害的特點。
3)、本發(fā)明在皮膚組織工程支架中加入表皮生長因子，可有效誘導創(chuàng)傷部位自體細胞生長，促進創(chuàng)面愈合。
外源性表皮生長因子能夠誘導細胞分裂，加速創(chuàng)傷修復，已經(jīng)應用于臨床；將外源性表皮生長因子引入皮膚組織工程支架中，可有效誘導創(chuàng)面組織細胞分化生長。
4)、本發(fā)明采用表皮生長因子緩釋技術，使表皮生長因子可以持續(xù)釋放。
無論體外細胞培養(yǎng)，還是創(chuàng)傷部位自體細胞生長，生長因子都需要與細胞接觸超過一定時間才能有效發(fā)揮作用，而生長因子在體內(nèi)的活性半衰期很短(幾小時或更短)，為解決此問題，本發(fā)明通過引入肝素，促使表皮生長因子與膠原形成一個緩釋系統(tǒng)，逐漸釋放出表皮生長因子，在創(chuàng)傷愈合前保持表皮生長因子持續(xù)作用于創(chuàng)面組織細胞。
具體實施例方式
實施例1將胎牛皮按常規(guī)方法進行脫毛、去筋膜、脂肪和血污、清洗、冷凍、切成厚0.5mm的薄片，用丙酮脫水三次，用石油醚脫脂三次，再抽真空除去石油醚，制成脫水脫脂的胎牛皮為原料，取10g原料，用雙蒸水洗滌加入反應器內(nèi)，加入由0.1g胃酶和100g水配制的水溶液。進行一次酶處理，在20℃、pH＝2條件下，機械振動24小時，降解組織纖維間的共價鍵，經(jīng)離心分離，棄上清液，取沉淀，用雙蒸餾水洗滌三次，加入500g的0.5M醋酸水溶液，在0℃溫度下，機械振動32小時后，再加入氯化鈉，使溶液中氯化鈉濃度達到2M，沉淀完全后，離心分離，棄上清，取沉淀裝入透析袋進行透析三次，收集透析后膠原溶液加入反應器內(nèi)，并加入0.3g菠蘿酶與100g水配制的水溶液進行二次酶處理，在30℃、pH＝6條件下，機械振動8小時，去除抗原決定簇，再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清，用0.05M的醋酸水溶液1000g溶解用失重法測得含有0.4g/ml無抗原性膠原溶液，并倒入直徑100mm的預冷模具中，在-10℃溫度下，冷凍24小時，再真空干燥24小時，得到孔徑均勻的厚度為0.1mm膠原海綿膜0.15g，然后置入0.5％濃度的7.5ml丙三醇溶液中吸附膨脹后取出在105℃溫度下，真空干燥32小時，得干膠原海綿膜，取肝素與0.005M醋酸水溶液中使肝素含量為0.1mg/ml，再將表皮生長因子溶于三蒸水中，使表皮生長因子含量為0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液100ml與表皮生長因子溶液100ml混合機械振動48小時后，取上述混合液0.1mL與5％濃度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸潤干膠原海綿膜，潤濕后在-70℃溫度下，冷凍4小時，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架。
實施例2將牛跟腱按實施例1的方法進行脫水脫脂，抽真空除去石油醚，制成脫水脫脂的牛跟腱為原料，取原料10g用雙蒸水洗滌后加入反應器內(nèi)，加入由0.3g胰凝乳蛋白酶與100g配制的水溶液進行一次酶處理，在30℃、pH＝6條件下，機械振動16小時，降解組織纖維間的共價鍵，經(jīng)離心分離，棄上清，取沉淀，用雙蒸餾水洗滌四次，加入1000g0.5M醋酸水溶液，在10℃溫度下，機械振動28小時，再加入氯入鈉，使溶液中氯化鈉濃度達2M，沉淀完全后，離心分離，棄上清，取沉淀，裝入透析袋進行透析四次，收集透析后的膠原加入反應器內(nèi)，并加入0.2g木瓜酶與100g水配制的水溶液進行二次酶處理，在35℃、pH＝7條件下，機械振動6小時，去除抗原性決定簇，再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清，用0.1M的醋酸水溶液1000g溶解，用失重法，測得含有2mg/ml無抗原性膠原溶液，并倒入直徑100mm的預冷模具中，在-40℃溫度上冷凍10小時，再真空干燥36小時，得到孔徑均勻厚度為0.25mm膠原海綿膜0.3g并置入5％濃度的30mL丙三醇水溶液，吸附膨脹后取出，在120℃溫度下，真空干燥20小時，得到干膠原海綿膜，取肝素溶于0.1M的醋酸溶液中，使肝素含量為5mg/ml，在將表皮生長因子溶于三蒸水中，使表皮生長因子含量為0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液10ml和表皮生長因子水溶液200mL混合機械振動48小時后，取上述混合液1ml與5％濃度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸潤干膠原海綿膜，浸潤后在-40℃溫度下，冷凍6小時，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架。
實施例3用實施例2的脫水脫脂的牛跟腱為原料，取10g，用雙蒸水洗滌后加入反應器內(nèi)，加入由0.5g菠蘿酶與100g水配制的水溶液進行一次酶處理，在40℃、pH＝8條件下，機械振動8小時，降解組織纖維間的共價鍵，經(jīng)離心分離，棄上清，取沉淀用雙蒸水洗滌四次，加入1500g的0.5M醋酸水溶液中，在20℃溫度下，機械振動24小時后，再加入氯化鈉使溶液中氯化鈉濃度達2M，沉淀完全后，離心分離，棄上清，取沉淀裝入透析袋進行透析五次，收集透析后的膠原溶液加入反應器內(nèi)，并加入0.1g胰凝乳蛋白酶與100g水配制的水溶液進行二次酶處理，在40℃、pH＝8條件下機械振動4小時，除去抗原決定簇，再按常規(guī)方法酶滅活處理，離心分離，棄上清，取沉淀，用0.5M的醋酸水溶液1000g進行溶解，用失重法測定得到含4mg/ml無抗原膠原溶液，并倒入直徑50mm的預冷模具中，在-70℃溫度下，冷凍4小時，再真空干燥48小時，得到孔徑均勻厚度為0.5mm的膠原海綿膜，0.5g，置入10％濃度的45ml丙三醇溶液吸附膨脹后取出，在130℃溫度下，真空干燥18小時，得到干膠原海綿膜，取肝素溶于1M的醋酸水溶液中，肝素含量為10mg/ml，再取表皮生長因子溶于三蒸水中，表皮生長因子含量為0.1μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液5ml與表皮生長因子水溶液150ml混合機械振動48小時后，取混合液5ml與5％濃度的丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸潤干膠原海綿膜，潤濕后在-10℃溫度下，冷凍10小時，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架。
權利要求
1.一種含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建方法，其特征在于它按下述步驟進行(a)、以胎牛皮或牛跟腱為基料，按常規(guī)方法進行脫毛、去筋膜及脂肪和污血、清洗、冷凍、切薄片，用丙酮脫水，再用石油醚脫脂，制成脫水脫脂的胎牛皮或牛跟腱為原料，用雙蒸水清洗原料后加入反應器內(nèi)，加入原料重量1～5％的胃酶或無花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，與原料重量10倍的水配制的水溶液進行一次酶處理，在20～40℃、pH＝2～8條件下、機械振動8～12小時，降解組織纖維間的共價鍵，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀用雙蒸餾水洗滌三次以上，加入原料重量的50～150倍的0.5M醋酸溶液，在0～20℃溫度下，振動24～32小時，再加入氯化鈉，使溶液中氯化鈉濃度達到2M，沉淀完全后，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀裝入透析袋進行透析3～4次，收集透析后膠原溶液，加入反應器內(nèi)，并加入上述原料重量1～3％的無花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，與原料重量10倍的配制的水溶液進行二次酶處理，在30～40℃、pH＝2～8條件下、機械振動4～8小時，去除抗原決定簇；再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清液用原料重量50～150倍的0.05～0.5M的醋酸水溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的無抗原性膠原溶液；(b)、再將(a)項的無抗原性膠原溶液倒入預冷模型中，在-10～-70℃溫度下冷凍4～24小時，再真空冷凍干燥24～48小時，得到孔徑均勻，厚度為0.1～0.5mm的膠原海綿膜，然后置入0.5～10％濃度的丙三醇水溶液中，丙三醇水溶液用量為膠原海綿膜重量50～150倍，吸附膨脹后取出膠原海綿膜，在105～130℃溫度下，真空干燥18～32小時，得到干膠原海綿膜；(c)、將肝素溶于0.005～1M的醋酸水溶液中，水溶液肝素含量為0.1～10mg/ml，然后用100目濾網(wǎng)過濾，得到肝素醋酸水溶液；(d)、將表皮生長因子溶于三蒸水中，三蒸水中表皮生長因子的含量為0.001～0.1μg/ml，得到表皮生長因子水溶液；(e)、最后將(c)項的肝素醋酸水溶液和(d)項的表皮生長因子水溶液按體積比1∶1～50的比例混合，機械振動48小時后，將上述混合液再與5％的丙三醇水溶液按體積比0.1～5∶100混合后，浸潤(b)項的干膠原海綿膜，潤濕后，在-10～-70℃溫度下，冷凍4～10小時，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建方法，其特征是它以胎牛皮或牛跟腱為基料，經(jīng)過脫水、脫脂處理，進行一次酶處理，降低組織纖維間的共價鍵，再經(jīng)透析，進行二次處理，除去抗原決定簇，再用醋酸溶解得到無抗原性膠原溶液，再制成膠原海綿膜，用丙三醇浸泡吸附，經(jīng)干燥后將肝素醋酸水溶液與表皮生長因子水溶液的混合物與丙三醇再次混合潤濕膠原海綿膜，經(jīng)冷凍干燥構(gòu)建成皮膚組織工程支架。該支架具有無抗原性、強度高、柔韌性好、手術植入方便、對創(chuàng)傷面無毒害、并可有效誘導創(chuàng)傷面部位自體細胞生長、促進創(chuàng)面愈合的優(yōu)點及效果。
文檔編號A61L27/00GK1511592SQ02159528
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月30日 優(yōu)先權日2002年12月30日
發(fā)明者楊穎颙, 于淑賢, 劉杰, 王德文, 楊穎 申請人:中國皮革和制鞋工業(yè)研究院, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所