專利名稱：對(duì)lap與lip之比例的控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了控制細(xì)胞中LAP與LIP之比例的組合物和方法。特別地，本發(fā)明提供了編碼LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)活性的重組載體，其中LIP活性的表達(dá)被抑制，且其中LIP活性的表達(dá)被抑制到使得LIP不會(huì)下調(diào)LAP活性，以及提供了減少LIP活性表達(dá)的寡核苷酸和反義核酸。本發(fā)明還提供了篩選一種試劑是否可調(diào)節(jié)由C/EBPβ基因表達(dá)的LAP與LIP表達(dá)水平之比例的方法。
人們也進(jìn)行了為治療癌癥而在細(xì)胞或組織中導(dǎo)入細(xì)胞因子基因的嘗試。例如進(jìn)行了下面的嘗試在淋巴細(xì)胞(例如，淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL))中導(dǎo)入細(xì)胞因子基因，以及通過(guò)由轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子而活化淋巴細(xì)胞以便提高被動(dòng)免疫性；或通過(guò)在TILs中直接導(dǎo)入具有抗腫瘤活性的IFN或TNF基因來(lái)提高在腫瘤位點(diǎn)處的抗腫瘤活性。Treisman J.等人(1994，Cell Immunol.156448-457)和Hwu等人(1993，J.Immumol.1504104-4115)。
此外，已經(jīng)報(bào)告了一種通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等等而在腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入細(xì)胞因子基因，和通過(guò)使用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞作為腫瘤疫苗而使宿主的腫瘤-特異的免疫細(xì)胞被誘導(dǎo)的嘗試。Adris S.等人(2000，Cancer Res.606696-6703)和Hiroishi K等人(1999，Gen Ther.121988-1994)。
在許多開(kāi)發(fā)的方法中已經(jīng)涉及到CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)基因。Hirai等人(2001，J.of Cell Biol.Vol.153785-794)。在C/EBPβ基因的核苷酸序列中存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，且LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)和LIP(轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白)是通過(guò)每個(gè)轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的翻譯而產(chǎn)生的。Descombes等人(1991，Cell，第67卷，569-579)。另外報(bào)道說(shuō)，當(dāng)LAP/LIP比例提高時(shí)，靶基因的轉(zhuǎn)錄活性被提高，且在大鼠肝的分化中的最后階段LAP/LIP比例提高了。Descombes等人，上述文獻(xiàn)。Buck等人(1994，EMBO Journal Vol.13，No.4，第851-860頁(yè))公開(kāi)了可以通過(guò)LAP/LIP比例來(lái)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的分化和靜止?fàn)顟B(tài)。
Hiral等人，上述文獻(xiàn)，報(bào)道了當(dāng)用上皮形成素處理細(xì)胞時(shí)，C/EBPβ的表達(dá)提高了，而且改變了編碼的LAP/LIP比例，上皮形成素為一種在乳腺的肌上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的表面上被表達(dá)、并與乳腺的形態(tài)形成有關(guān)的蛋白。
盡管在治療癌癥癥狀方面已經(jīng)有所進(jìn)展，但仍需要更好的篩選可以治療和/或改善癌癥癥狀的試劑的方法，以及治療和/或改善癌癥的癥狀的方法。
在此公開(kāi)的全部專利和出版物在此以其整體引用作為參考。
本發(fā)明還提供包含用另一個(gè)密碼子對(duì)LIP的起始密碼子ATG進(jìn)行的取代的變體LAP多肽，其中取代密碼子不是TTG，且在某些例子中，不是翻譯終止密碼子。在某些例子中，變體LAP多肽包含用編碼Ala，Gly，Pro或Arg的密碼子對(duì)LIP的起始密碼子ATG進(jìn)行的取代。本發(fā)明還提供了編碼這種多肽的被分離的核酸。本發(fā)明還提供了包含鄰近C/EBPβ基因的核苷酸序列中的LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG的長(zhǎng)度為約10到約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，或它們的互補(bǔ)序列，其中所述寡核苷酸，或它們的互補(bǔ)序列能夠減少LIP表達(dá)。在某些例子，寡核苷酸的長(zhǎng)度為約10到80個(gè)核苷酸。在其它例子中，寡核苷酸的長(zhǎng)度為約15到約50個(gè)核苷酸。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的重組載體，寡核苷酸或變體LAP多肽(或編碼所述多肽的分離的核酸)的宿主細(xì)胞，組合物和試劑盒，以及獲得諸如此類的方法。
本發(fā)明還提供了改進(jìn)細(xì)胞中LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)表達(dá)水平的比例的方法，包括使細(xì)胞與本發(fā)明的重組載體或本發(fā)明的寡核苷酸或本發(fā)明的變體LAP多肽在適宜條件下接觸。在某些例子中，細(xì)胞是癌細(xì)胞，例如乳腺或肝癌細(xì)胞。本發(fā)明還提供了治療和/或改善相關(guān)于個(gè)體中LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)表達(dá)水平的異常比例有關(guān)的疾病和/或狀況的癥狀的方法，該方法包括給予個(gè)體本發(fā)明的重組載體，或寡核苷酸，或變體LAP多肽。在某些例子中，疾病或狀況是癌癥。本發(fā)明還提供了篩選一種試劑是否可調(diào)節(jié)C/EBPβ基因表達(dá)的LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的表達(dá)水平的比例的方法，該方法包括使C/EBPβ基因與所述試劑接觸以及測(cè)定LAP表達(dá)與LIP表達(dá)的比例的步驟。在某些例子中，試劑是一種低分子量化合物；在其它例子中，試劑是一種天然存在的物質(zhì)的提取物。在其它例子中，所述比例是通過(guò)RNA印跡法測(cè)定的。在某些例子中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含所述C/EBPβ基因。在某些例子中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)可提高細(xì)胞中LAP的表達(dá)水平的試劑的鑒定，或?qū)山档图?xì)胞中LIP的表達(dá)水平的試劑的鑒定。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的重組載體在制造治療和/或改善癌癥癥狀的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的變體LAP多肽在制造治療和/或改善癌癥的癥狀的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的寡核苷酸在制造治療和/或改善癌癥癥狀的藥物中的用途。
本發(fā)明提供了其中LIP活性表達(dá)被抑制的編碼LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)活性的重組載體。在某些例子中，本發(fā)明提供了編碼LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)活性的重組載體，其中LIP活性表達(dá)被抑制，且其中LIP活性的表達(dá)被抑制到一定程度，以至于LIP活性不能下調(diào)LAP活性。本發(fā)明提供了編碼LAP變異形式的分離的核酸，其中LIP的起始密碼子ATG已經(jīng)被另一個(gè)密碼子所取代，其中取代密碼子不是TTG，且在某些例子中，不是終止密碼子。本發(fā)明提供了變體LAP多肽，其中LIP的起始密碼子ATG已經(jīng)被另一個(gè)密碼子所取代，其中取代密碼子不是TTG，且在某些例子中，不是終止密碼子。在某些例子中，這樣的變體LAP多肽顯示溶瘤活性。
特別地，本發(fā)明提供了包含部分或全部C/EBPβ基因的核酸的重組載體，其中所述核酸包含鄰近C/EBPβ的核苷酸序列中的LIP的起始密碼子的核苷酸序列中的突變。在某些例子中，這種重組載體顯示出溶瘤活性，并可用于基因治療，即可用于對(duì)患有和LAP與LIP的比例有關(guān)的疾病或狀況的細(xì)胞或個(gè)體給藥或遞送。特別地，本發(fā)明的重組載體可用于向細(xì)胞給予或遞送表達(dá)LAP活性的重組載體。這種重組載體可被用于增加細(xì)胞中LAP與LIP活性的比例的方法；并可用于治療和/或改善患有相關(guān)于LAP與LIP的比例的疾病和/或狀況的個(gè)體中的相關(guān)于LAP與LIP的比例的疾病和/或狀況的癥狀的方法；以及可用于篩選改進(jìn)LAP與LIP的比例的試劑的方法。本發(fā)明還提供了能夠降低，減少或抑制LIP表達(dá)的寡核苷酸，反義核酸和干擾RNA。
在此公開(kāi)的發(fā)明提供了改進(jìn)細(xì)胞中LAP與LIP的表達(dá)水平的比例的方法，包括使細(xì)胞與能夠降低、減少或抑制LIP的表達(dá)的本發(fā)明的重組載體，或本發(fā)明的寡核苷酸、反義核酸或干擾RNA接觸。在某些例子中，使細(xì)胞和本發(fā)明的重組載體，或本發(fā)明的寡核苷酸，反義核苷酸或干擾RNA以及上皮形成素一起接觸。本發(fā)明還提供了治療和/或改善相關(guān)于個(gè)體中LAP與LIP的表達(dá)水平的比例的疾病和/或狀況的癥狀，例如癌癥的方法，該方法包括對(duì)患有癌癥的個(gè)體給予本發(fā)明的重組載體，或本發(fā)明的寡核苷酸、反義核酸或干擾RNA，它們單獨(dú)或和其它治療聯(lián)合或與上皮形成素聯(lián)合用藥。
本發(fā)明還提供了篩選一種試劑是否調(diào)節(jié)C/EBPβ基因表達(dá)的LAP與LIP的表達(dá)水平的比例的方法。本發(fā)明還提供了測(cè)定具體的癌癥或惡性細(xì)胞對(duì)用本發(fā)明的重組載體，或本發(fā)明的寡核苷酸，反義核苷酸或干擾RNA治療是否敏感的方法。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的重組載體，或本發(fā)明的寡核苷酸，反義核苷酸或干擾RNA的試劑盒。在某些例子中，本發(fā)明的試劑盒包括用來(lái)試驗(yàn)所治療的癌細(xì)胞的敏感性的重組載體。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的重組載體，或本發(fā)明的寡核苷酸，反義核苷酸或干擾RNA的組合物，以及獲得本發(fā)明的重組載體或本發(fā)明的寡核苷酸，反義核酸或干擾RNA的方法。
除非另有陳述，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中使用在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)的常規(guī)的分子生物學(xué)，病毒學(xué)，微生物學(xué)，免疫學(xué)，和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)全部在文獻(xiàn)中說(shuō)明。見(jiàn)例如，Maniatis等人，Molecμlar CloningA LaboratoryManual(1982)；DNA CloningA Practical Approach，vols.I&II(D.Glover，編)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，編(1984))；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins，編(1985))；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins，編(1984))；Animal Cell Culture(R.Freshney，編(1986))；Perbal.A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；Ausubel，等人，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987，1988，1989，1990，1991，1992，1993，1994，1995，1996)；和Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)；第I，II和III卷(1989)。
I.CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)；LAP和LIPCCAAT/強(qiáng)子結(jié)合蛋白(“C/EBP”)包含一類增強(qiáng)子結(jié)合蛋白質(zhì)(EBPs)，它的成員能夠優(yōu)先識(shí)別和結(jié)合CCAAT序列基元(例如在轉(zhuǎn)鐵蛋白和ApoB基因中所發(fā)現(xiàn)的)，增強(qiáng)子核心序列基元，或若干病毒啟動(dòng)子的增強(qiáng)子區(qū)(Landschultz，W.H.等人，Genes Dev.2786-800(1989)；Brunel，F(xiàn).等人，J.Biol.Chem。26310180-10185(1988)；Metzger，S.等人，J.Biol.Chem.2659978-9983(1990))。
來(lái)源于哺乳動(dòng)物的C/EBPβ基因是已知的且公開(kāi)在，例如，Descombes等人(1990，Genes Dev.Vol.4，pgs.1541-1551)和Akira等人(1990，EMBO J9，1897-1906)。源自大鼠的C/EBPβ基因的核苷酸序列和氨基酸序列被分別描述為SEQ ID NOS1和2。源自人的C/EBPβ基因的核苷酸序列和氨基酸序列被分別描述為SEQ ID NOS3和4。
C/EBPβ基因具有2個(gè)翻譯產(chǎn)物，即LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)和LIP(轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白)。2種翻譯產(chǎn)物的存在可歸因于在C/EBPβ(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β)基因的核苷酸序列中存在2個(gè)或2個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)或LIP(轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白)每一個(gè)都是通過(guò)從這些轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的任何一個(gè)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄/翻譯而產(chǎn)生的。
LAP是一種具有轉(zhuǎn)錄控制位點(diǎn)和N-末端側(cè)的DNA結(jié)合位點(diǎn)的蛋白，而LIP是一種僅僅具有LAP的DNA結(jié)合位點(diǎn)而沒(méi)有轉(zhuǎn)錄控制位點(diǎn)的蛋白。這兩種蛋白質(zhì)具有相同的構(gòu)架，即LIP與LAP都具有C-末端的145個(gè)氨基酸(Buck等人，上文)。不受理論的限制，Descombes等人(1991，Cell，vol.67569-579頁(yè))提出LAP和LIP是由相同的mRNAs通過(guò)滲漏核糖體掃描機(jī)理翻譯的。LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG相應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸序列中的第457到第459個(gè)核苷酸，并相應(yīng)于SEQ ID NO3的核苷酸序列中的第595到597個(gè)核苷酸。
Buck等人，上文，報(bào)道了LAP表達(dá)和S-期在肝癌細(xì)胞中是互相排斥的。他們發(fā)現(xiàn)LAP在G1/S界面前抑制肝癌細(xì)胞增殖并阻止細(xì)胞進(jìn)入S-期。Descombes等人(1991，Cell vol.67569-579)公開(kāi)了LAP和LIP都具有包含堿性DNA結(jié)合域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)二聚螺旋的145個(gè)C-末端氨基酸。Buck等人，上文，公開(kāi)了阻止肝癌進(jìn)入S-期要求LAP亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的完整。Buck等人，上文，還公開(kāi)了LIP(缺少LAP的N-末端活化結(jié)構(gòu)域)在阻斷肝癌細(xì)胞增殖和中是無(wú)效的，并且拮抗LAP對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用。不受理論的限制，Buck等人，上文，提出LIP的145個(gè)氨基酸，包括亮氨酸拉鏈和堿性域，通過(guò)或者直接與DNA-結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)或間接地通過(guò)形成LIP/LAP二聚物而起LAP的拮抗劑的作用。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了其中LIP表達(dá)被抑制的編碼LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)活性的重組載體。在另一個(gè)例子中，本發(fā)明提供了其中LIP的表達(dá)被抑制，且其中LIP的表達(dá)被抑制到使得LIP不能下調(diào)LAP活性的編碼LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)活性的重組載體。LAP活性可以通過(guò)在Buck等人，上文中所公開(kāi)的試驗(yàn)中的LAP抑制肝癌細(xì)胞增殖的能力來(lái)測(cè)定，或通過(guò)在此文實(shí)施例中公開(kāi)的體內(nèi)模型中LAP抑制癌癥形成的能力來(lái)測(cè)定。
Descombes等人，(1991，Cell，vol.67569-579)公開(kāi)了LAP mRNA具有三個(gè)符合讀框的AUGs。LAP起始于第一個(gè)符合讀框的AUG處(39kd蛋白)；且LIP起始于第三個(gè)讀框AUG(20kd蛋白)。在某些例子中，重組載體包括N-末端LAP活化域和/或DNA結(jié)合域和/或亮氨酸拉鏈且表達(dá)LAP活性，其中LIP活性被抑制。本發(fā)明提供了編碼LAP活性的重組載體，包含編碼變體LAP多肽的核酸，其中LIP的起始密碼子被另一個(gè)密碼子所取代，其中取代密碼子不是TTG，且在某些例子中，不是終止密碼子。本發(fā)明還提供了編碼變體LAP多肽的分離的核酸，其中LIP的起始密碼子被另一個(gè)密碼子所取代，其中取代密碼子不是TTG，且在某些例子中，不是終止密碼子。本發(fā)明提供了LAP多肽的變體形式，其中LIP的起始密碼子被另一個(gè)密碼子所取代，其中取代密碼子不是TTG，且在某些例子中，不是終止密碼子。在此使用的“變體LAP多肽”是一種包括LIP的起始ATG密碼子的突變的多肽，以致在變體LAP多肽保留了至少一種LAP生理活性時(shí)，LIP活性被減低或抑制。
本發(fā)明提供了包含部分或全部C/EBPβ基因的重組基因載體，在某些例子中，為重組病毒載體，和在其它例子中，提供了病毒顆粒，其中部分或全部C/EBPβ基因包含鄰近LIP的起始密碼子ATG的區(qū)域，其中在鄰近LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG的核苷酸序列中導(dǎo)入了突變。在此所使用的術(shù)語(yǔ)“突變”包括核酸插入，缺失和取代物。在某些例子中，突變是用另一個(gè)密碼子取代LIP的起始密碼子ATG。在某些例子中，該突變降低，減少或抑制了LIP的轉(zhuǎn)錄/翻譯。在某些例子中，該突變降低、減少或抑制了LIP的轉(zhuǎn)錄/翻譯，而沒(méi)有在編碼LAP的核酸中導(dǎo)入移碼突變。在其它例子中，該突變降低，減少或抑制了LIP的轉(zhuǎn)錄/翻譯，同時(shí)保留了LAP的生理活性。在其它例子中，重組載體包括C/EBPβ的核酸片段或部分，只要片段或部分編碼了保留LAP活性的產(chǎn)物。LAP活性可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和通過(guò)在此文中公開(kāi)的方法測(cè)定。在某些例子中，LIP的起始密碼子ATG被編碼另一個(gè)氨基酸的密碼子所取代，其中取代密碼子不是TTG，且在某些例子中，取代密碼子不是終止密碼子。在某些例子中，取代密碼子是保守密碼子且不是TTG。在某些例子中，密碼子編碼Ala，Gly或Pro。在于此公開(kāi)的其它例子中，LIP的起始密碼子ATG被CGC取代。在這種重組基因載體到細(xì)胞或組織的遞送中，LIP的轉(zhuǎn)錄/翻譯被降低，減少，停止或抑制。在其它例子中，LIP的轉(zhuǎn)錄/翻譯被降低，減少，停止或抑制，而沒(méi)有影響來(lái)源于C/EBPβ基因的LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)的轉(zhuǎn)錄/翻譯。在某些例子中，LAP的至少一種生理活性被保留。在某些例子中，在本發(fā)明的重組載體向細(xì)胞的遞送中，LAP被優(yōu)勢(shì)地表達(dá)。此外，如本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例所證明，當(dāng)向裸鼠IP注射包括導(dǎo)入C/EBPβ突變的基因的載體時(shí)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比較，小鼠沒(méi)有癌癥形成和轉(zhuǎn)移。即，在本發(fā)明中已經(jīng)揭示了通過(guò)僅僅LAP的占優(yōu)勢(shì)的表達(dá)可使體內(nèi)癌細(xì)胞正?；?。
可被用于本發(fā)明的C/EBPβ(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β)基因的來(lái)源是不受特別限制的，且可以使用來(lái)源于任何活生物體的任何一種基因。本發(fā)明包括來(lái)源于任何來(lái)源的C/EBPβ。在某些例子中，可以使用來(lái)源于哺乳動(dòng)物的C/EBPβ基因。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是指哺乳動(dòng)物物種的任何個(gè)體，且包括大的動(dòng)物(牛，羊，馬等等)，運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(包括狗和貓)，和靈長(zhǎng)類(包括舊世界猴，新世界猴，猿，人，等等)。在其它例子中，使用人的C/EBPβ基因。特別地，源自人的C/EBPβ基因的核苷酸序列和氨基酸序列分別被稱作SEQ ID NOS3和4。
用于本發(fā)明的C/EBPβ(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白b)基因可以是由哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞等等通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，例如PCR而獲得的cDNA?？梢缘玫紺/EBPβ的哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞系的例子包括肝實(shí)質(zhì)性細(xì)胞，乳房上皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。這種細(xì)胞系是可以從公共來(lái)源獲得的。做為選擇，C/EBPβ基因或它們的片段或部分，例如包括LIP的起始密碼子ATG的片段或部分，可以是根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的SEQ ID NOS1到4的核苷酸序列和氨基酸序列的信息化學(xué)合成的基因。
此外，當(dāng)包含部分或全部C/EBPβ基因的本發(fā)明的重組基因載體被用作人的基因治療試劑，即對(duì)人給藥或遞送時(shí)，優(yōu)選使用人的基因以減少、最小化或抑制任何潛在的免疫排斥，并提高治療的效果。
在鄰近C/EBPβ基因的核苷酸序列中的LIP的起始密碼子ATG的核苷酸序列中導(dǎo)入突變的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它通過(guò)使用常用的重組技術(shù)例如通過(guò)使用PCR方法使用適當(dāng)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行。PCR技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的。
在鄰近LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG的核苷酸序列中進(jìn)行或設(shè)計(jì)突變的導(dǎo)入以便降低、減少、停止或抑制LIP的轉(zhuǎn)錄/翻譯，且在某些例子中，不影響LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)的轉(zhuǎn)錄/翻譯。措詞“不影響LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)的轉(zhuǎn)錄/翻譯”是指具有生物活性的LAP是在沒(méi)有導(dǎo)入引起LAP的轉(zhuǎn)錄/翻譯中發(fā)生移碼的突變的情況下被表達(dá)的。LAP調(diào)節(jié)各種蛋白質(zhì)，包括FGF受體和IL-8的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)顯示LAP將停滯HepG2細(xì)胞的增殖并降低由c-jun啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。見(jiàn)Buck等人，1994，The EMBO J.vol 13851-860。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能確定鄰近LIP中的起始密碼子ATG導(dǎo)入的突變是否影響LAP的生物活性，通過(guò)例如，Buck等人所公開(kāi)的由始于c-jum啟動(dòng)子的HepG2增殖或轉(zhuǎn)錄的方法測(cè)定。另外，措詞“降低，減少，停止或抑制LIP的轉(zhuǎn)錄/翻譯”是指具有生理活性的LIP是在與對(duì)照組相比較較低的水平下被表達(dá)的，或LIP表達(dá)水平是不可檢測(cè)出的或LIP不是由突變型C/EBPβ基因表達(dá)的。試驗(yàn)LAP和LIP的轉(zhuǎn)錄/翻譯的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且包括RNA印跡和PCR法。
此外，在此使用的措詞“鄰近LIP的起始密碼子ATG的核苷酸序列”，包括由LIP的起始ATG(相應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸序列中的第457和第459個(gè)核苷酸)的正向(3′)和反向(5′)的在約100個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的核苷酸序列；且在某些例子中，為ATG正向和反向的約90個(gè)核苷酸；且在某些例子中，為ATG正向和反向的80個(gè)核苷酸；且在某些例子中，為ATG正向和反向的70個(gè)核苷酸，ATG正向和反向的60個(gè)核苷酸；且在某些例子中，為ATG正向和反向的50個(gè)核苷酸；且在某些例子中，為ATG正向和反向的40個(gè)核苷酸；在某些例子中，為ATG正向和反向的30個(gè)核苷酸；且在某些例子中，為ATG正向和反向的20個(gè)核苷酸；在某些例子中，為ATG正向和反向的10或5個(gè)核苷酸；且在某些例子中，ATG被另外的氨基酸密碼子取代。在其它例子中，ATG保持完整，而鄰近ATG的核酸，在某些例子中ATG的3′端，是突變的以致不能發(fā)生由LIP的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
舉例來(lái)說(shuō)，LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG可以被另一個(gè)密碼子取代，其中密碼子不是TTG，且在某些例子中，不是終止密碼子。用來(lái)取代ATG的密碼子的種類沒(méi)有特別限制，只要密碼子取代物是一種非終止密碼子的密碼子，且不能導(dǎo)致LAP的翻譯的移碼。Buck等人，上文，公開(kāi)了要求LAP亮氨酸拉鏈(在C-末端145個(gè)氨基酸中被發(fā)現(xiàn))的完整以阻止肝癌細(xì)胞進(jìn)入S-期。優(yōu)選編碼不會(huì)使被編碼蛋白的性質(zhì)受影響的氨基酸的密碼子。這種氨基酸的例子包括丙氨酸，甘氨酸和脯氨酸。在此公開(kāi)的說(shuō)明性的實(shí)施方案中，LIP的起始密碼子被編碼Arg的密碼子取代。如實(shí)施例中所示，當(dāng)g6乳腺癌細(xì)胞用包括此取代物的載體轉(zhuǎn)染，且被導(dǎo)入到裸鼠內(nèi)時(shí)，與對(duì)照組比較裸鼠失去癌癥形成能力。
本發(fā)明的重組基因載體是包括具有以上描述的在其中導(dǎo)入的突變的部分或全部C/EBPβ基因的載體。本發(fā)明的重組基因載體是在適宜的載體中通過(guò)向啟動(dòng)子的下游導(dǎo)入，例如通過(guò)連接導(dǎo)入具有導(dǎo)入其中的突變的核苷酸序列的C/EBPβ基因而構(gòu)建的。在基因序列中導(dǎo)入突變和構(gòu)建重組載體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在某些例子中，當(dāng)重組基因載體被導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，它也是能夠表達(dá)作為細(xì)胞中的基因產(chǎn)物的部分或全部LAP的表達(dá)載體。在某些例子中，部分或全部LAP保留了至少一種LAP活性。上皮形成素已知可增加C/EBPβ的表達(dá)(Hirai等人，2001，J.of Cell Biol.Vol.153pg.785-794)。因此，在本發(fā)明的某些例子中，還在細(xì)胞中導(dǎo)入了編碼部分或全部上皮形成素的核酸，以及本發(fā)明的重組載體，特別地為能夠表達(dá)具有至少一種LAP活性的部分或全部LAP基因產(chǎn)物的重組載體。這些具有上皮形成素活性的蛋白質(zhì)或肽的例子包括上皮形成素本身(即全長(zhǎng)蛋白)、包含上皮形成素的部分氨基酸序列和具有上皮形成素活性的肽，以及它們的修飾肽。上皮形成素和它們的部分肽詳細(xì)地公開(kāi)在歐洲專利公開(kāi)EP0698666，美國(guó)專利U.S.5,726,298，美國(guó)專利US5,837,239和國(guó)際專利公開(kāi)WO 98/22505和WO 01/94382中；且還可以使用其中描述的這些上皮形成素和部分肽。編碼上皮形成素的核酸是在本發(fā)明的重組載體之前、之后或同時(shí)被導(dǎo)入細(xì)胞的，且可在相同的重組載體或不同的載體上被導(dǎo)入。
如上所述，本發(fā)明提供了一種C/EBPβ基因，其中包括用摻入本發(fā)明的重組載體中的另一個(gè)密碼子(只要密碼子不是TTG)對(duì)LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG進(jìn)行的取代。本發(fā)明包括在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明的重組載體的方法。在某些實(shí)施方案中，載體是重組病毒載體且宿主細(xì)胞被病毒載體感染。因此本發(fā)明包括本發(fā)明的重組載體，其特征在于通過(guò)用載體感染細(xì)胞而在細(xì)胞中導(dǎo)入基因，并且使基因在細(xì)胞中表達(dá)。在細(xì)胞中導(dǎo)入基因構(gòu)建物，例如，本發(fā)明的重組載體可以使用本領(lǐng)域任何已知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括磷酸鈣-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔法，脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，裸DNA摻，電穿孔，以及病毒(DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒兩者介導(dǎo)的)轉(zhuǎn)染。實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中導(dǎo)入基因的方法是本領(lǐng)域所熟知的。II.病毒載體可以使用動(dòng)物，即哺乳動(dòng)物例如人的表達(dá)質(zhì)粒。在某些例子中，載體是一種病毒載體。用于本發(fā)明中的載體的例子包括病毒載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺伴隨病毒載體，桿狀病毒載體，以及牛痘病毒載體。病毒載體中，特別優(yōu)選使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，因?yàn)樵诩?xì)胞被逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染之后，病毒基因組將插入宿主染色體中且載體使外源基因整合到載體中以被穩(wěn)定地和長(zhǎng)期地表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒重組載體的結(jié)構(gòu)以及它們體外或體內(nèi)的用途已經(jīng)在文獻(xiàn)中被廣泛地描述特別見(jiàn)Breakfield等人，New Biologist 3(1991)203；EP453242，EP 178220，Bemstein等人，Genet Eng.7(1985)235；McCormick，BioTechnology 3(1985)689，等等。使用不能復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的標(biāo)記基因的基因轉(zhuǎn)移方法是早已確認(rèn)的(Correll，et al.(1989)PNAS USA868912；Bordignon(1989).PNAS USA 866748-52；Cμlver，K.(1990)，PNAS USA883155；and Ri]1，D.IL(1991)Blood79(10)2694-700.
腺病毒具有實(shí)現(xiàn)高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)的優(yōu)點(diǎn)且不要求對(duì)于細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞增殖。有關(guān)腺病毒和腺病毒載體體系的發(fā)展情況的一般背景參考文獻(xiàn)見(jiàn)Graham等人(1973)Virology 52456-467；Takiff等人(1981)Lancet 11832-834；Berkner等人(1983)Nucleic Acid Research 116003-6020；Graham(1984)EMBO J32917-2922；Bett等人(1993)J.Virology 675911-5921；和Bett等人(1994)Proc.Natl Acad Sci.USA 918802-8806。腺病毒載體已經(jīng)被用于基因的體外克隆和表達(dá)(Gluzman等人，Cold Spring Harbor，N.Y.11724.第187頁(yè))，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生(WO95/22616)，將基因回體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中(WO95/14785；WO95/06120)或體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中(特別見(jiàn)WO93/19191，WO94/24297，WO94/08026)。
腺伴隨病毒(AAV)是一種細(xì)小病毒，其是一種大約5kb的單鏈線狀DNA病毒，其病毒復(fù)制要求輔助病毒(腺病毒等等)。(見(jiàn)B.J.Carter，在″Handbook ofParvoviruses″中，P.Tijsser.編CRC出版社，第155-168頁(yè))。來(lái)源于AAVs的載體在體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移中的用途已經(jīng)在文獻(xiàn)中被描述(具體見(jiàn)WO91/18088；WO93/09239；U.S.Pat.Nos.4,797,368，5,139,941.和EP 488 528)。人們知道腺伴隨病毒是通過(guò)ITRs(反向末端重復(fù)序列)整合到宿主細(xì)胞的染色體的特異部位，ITRs存在于病毒基因組的兩端且具有T形發(fā)夾結(jié)構(gòu)。至于病毒蛋白質(zhì)，基因組的左半邊編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(調(diào)節(jié)蛋白)的Rep，而基因組的右半邊編碼衣殼蛋白的Cap，衣殼蛋白為一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。為了制造AAV載體，構(gòu)建了包括在AAV兩端的ITRs的AAV，且將具有目的基因的質(zhì)粒(AAV載體質(zhì)粒)或包括目的基因的核酸插入到ITRs之間。病毒復(fù)制或病毒顆粒的形成所需的病毒蛋白質(zhì)是由其它輔助細(xì)胞質(zhì)粒提供的。將以上兩種質(zhì)粒例如通過(guò)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入到HEK293細(xì)胞中，而后將得到的細(xì)胞用腺病毒(輔助病毒)感染，由此制備非增殖的重組體AAV(AAV載體)。做為選擇，宿主細(xì)胞包含編碼輔助病毒功能的核酸。此AAV載體存在于細(xì)胞核中，因此在凍融和收集細(xì)胞之后，通過(guò)加熱將沾污的腺病毒滅活或通過(guò)例如CsCl梯度從AAV中除去。此外，載體是通過(guò)氯化銫密度-梯度超速離心法純化的。
桿狀病毒已經(jīng)被用來(lái)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，見(jiàn)例如U.S.Pat.No.5,731,182。桿狀病毒的基因組可以通過(guò)配體DNA的嵌入物而被改進(jìn)，嵌入物包括編碼哺乳動(dòng)物受體特殊蛋白質(zhì)的基因，可使桿狀病毒結(jié)合并進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在US專利No.6,103,244中描述了牛痘病毒。Panicali和Paoletti描述了包括外源基因的重組牛痘病毒的構(gòu)建(1982，Proc.Nat′l Acad Sci.U.S.A.794927-4931；Mackett等人(1982，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.79.7415-7419；和U.S.專利No.4,769,330。
當(dāng)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括來(lái)源于腫瘤病毒例如Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)和來(lái)源于慢病毒屬例如人類免疫缺陷性病毒(HIV)的那些病毒。
通常使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是利用鼠白血病病毒(MoMLV)的基本結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，鼠白血病病毒是RNA病毒，且它具有寬的宿主范圍和比較高的基因?qū)胄?。制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法是本領(lǐng)域已知的。簡(jiǎn)要地，為了制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，首先由病毒基因組中刪除LTR(長(zhǎng)末端重復(fù)序列)之中的大部分的gag，pol，和env，并將目的基因代替它們插入其中。當(dāng)在為表達(dá)基因產(chǎn)物即病毒蛋白(gag，pol和env)而制備的包裝細(xì)胞系中導(dǎo)入此載體質(zhì)粒時(shí)，表達(dá)基因產(chǎn)物(逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)的重組體逆轉(zhuǎn)錄病毒在培養(yǎng)物上清液中被制備，所述細(xì)胞系為包含gag，pol，和env的核酸的細(xì)胞系。通常，克隆了高效價(jià)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生系，且可在長(zhǎng)時(shí)期使用該細(xì)胞系。通常使用以上描述的病毒載體制備細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液來(lái)感染靶細(xì)胞。
腺病毒是一種具有大約36kb的大小的線狀雙鏈DNA病毒。制備腺病毒載體的方法是本領(lǐng)域已知的，且在下面簡(jiǎn)要地描述。在某些例子中，使用復(fù)制缺損型腺病毒，例如缺乏部分或全部重要的E1功能的腺病毒。腺病毒載體的制備方法如下簡(jiǎn)述。簡(jiǎn)要地，從腺病毒上刪掉E1基因區(qū)域，并構(gòu)建具有插入到該區(qū)域中的目的基因的粘粒。這些粘粒連同其中E1基因區(qū)域已經(jīng)被切除的親代病毒DNA(使用具有與其連接的末端蛋白的那些)一起被導(dǎo)入到HEK293細(xì)胞中。然后，在細(xì)胞中發(fā)生同源重組，引起非增殖的腺病毒載體的產(chǎn)生。通過(guò)凍融細(xì)胞收集這些病毒載體，并通過(guò)氯化銫密度-梯度超速離心法純化。腺病毒載體的特征是該載體可以制備高效價(jià)的載體，可以在大量細(xì)胞中有效地導(dǎo)入基因，且可以在非分裂的細(xì)胞中導(dǎo)入基因。當(dāng)基因被導(dǎo)入癌細(xì)胞中時(shí)，少量細(xì)胞毒性無(wú)關(guān)緊要。見(jiàn)Horowitz J.1999，Curr.Opin.Mol.Ther.4500-509。此外，還有其中的瞬時(shí)基因表達(dá)可以獲得治療效果的一些例子，而且因此腺病毒載體特別適合于癌癥的基因治療。
因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞用作宿主，故可以使用啟動(dòng)子例如來(lái)源于SV40的啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng)子或β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。此外，如果必要的話可以使用增強(qiáng)子。細(xì)胞或組織的特異表達(dá)可以通過(guò)使用細(xì)胞特異性增強(qiáng)子和/或啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。通常見(jiàn)Huber等人(1995)Adv.Drug Delivery Reviews 17279-292。包括本發(fā)明的重組載體的表達(dá)載體還可以包含腫瘤-標(biāo)記蛋白質(zhì)的一或多個(gè)啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，或腫瘤中的可以將載體導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞的其它被上調(diào)的因子。例如，ErbB2的啟動(dòng)子(在乳腺腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)增強(qiáng))可以被用于將本發(fā)明的重組載體導(dǎo)向乳腺腫瘤細(xì)胞。
作為在動(dòng)物中表達(dá)的質(zhì)粒載體的宿主，可使用大腸桿菌K12-HB101株，DH5a株等等。這種株是可以從公共來(lái)源獲得的。轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(見(jiàn)例如，Maniatis等人)。至于病毒載體的宿主，可使用具有制備病毒的能力的動(dòng)物細(xì)胞，例如COS-7細(xì)胞，CHO細(xì)胞，BALB/3T3細(xì)胞以及希拉細(xì)胞。病毒載體可以是具有復(fù)制能力的或復(fù)制缺陷的。復(fù)制缺陷型病毒載體是在合適的輔助細(xì)胞系中生長(zhǎng)的，輔助細(xì)胞系就是包含編碼對(duì)復(fù)制是不可缺少的病毒功能的核酸的細(xì)胞系。至于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的宿主，可以使用ψCRE，ψCRIP，MLV等等。至于腺病毒載體和腺伴隨病毒載體的宿主，可以使用來(lái)源于人胚腎的HEK293細(xì)胞等等。在動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入病毒載體可以通過(guò)磷酸鈣方法，或?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它方法進(jìn)行。
如下培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體以制備重組基因載體。
大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以使用pH值為5到8的液體培養(yǎng)基進(jìn)行，液體培養(yǎng)基包含碳源，氮源，無(wú)機(jī)物質(zhì)及其它為其生長(zhǎng)所需的物質(zhì)。培養(yǎng)通常在15到43℃進(jìn)行大約8到24小時(shí)。培養(yǎng)之后，可以通過(guò)常規(guī)的DNA分離以及純化方法得到本發(fā)明的重組基因載體。
動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以使用諸如199培養(yǎng)基，MEM培養(yǎng)基，以及DMEM培養(yǎng)基之類的培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行，這種培養(yǎng)基包含大約5到20％胎牛血清。優(yōu)選培養(yǎng)基的pH值為大約6到8。培養(yǎng)通常在30到40℃下進(jìn)行大約18到60小時(shí)。包含本發(fā)明的重組基因載體的病毒顆粒被釋放到培養(yǎng)物的上清液中。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法例如氯化銫離心方法，聚乙二醇沉淀法，以及過(guò)濾濃縮法，進(jìn)行病毒顆粒的濃縮和純化，由此得到本發(fā)明的重組基因載體。III.LIP的控制本發(fā)明提供了降低，減少或抑制宿主細(xì)胞中LIP的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的組合物和方法。這種組合物包括能夠降低、減少或抑制宿主細(xì)胞中LIP的轉(zhuǎn)錄的反義核酸，寡核苷酸，即寡核苷酸引誘物(decoy)，核酶，以及干擾RNAs(iRNAs)。相應(yīng)地本發(fā)明提供了用于降低或抑制細(xì)胞中LIP的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的方法，包括使細(xì)胞與能夠降低、減少或抑制細(xì)胞中LIP的轉(zhuǎn)錄的反義核酸，寡核苷酸，核酶和/或干擾RNAs(iRNAs)接觸。LIP的轉(zhuǎn)錄和翻譯是通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，包括PCR和RNA印跡技術(shù)測(cè)定的。
本發(fā)明提供了約10到約100核苷酸長(zhǎng)度的寡核苷酸，包括鄰近C/EBPβ(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β)基因的核苷酸序列中的LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG的核苷酸序列，或它們的互補(bǔ)序列。在某些例子中，寡核苷酸能夠降低，減少或抑制細(xì)胞中的LIP功能。
在某些例子，寡核苷酸的長(zhǎng)度為約10到80個(gè)核苷酸，在其它例子中，寡核苷酸的長(zhǎng)度為約15到約50個(gè)核苷酸；在其它例子中，寡核苷酸的長(zhǎng)度為約20到約80個(gè)核苷酸；在其它例子中，寡核苷酸的長(zhǎng)度為約15到約40個(gè)核苷酸；在其它例子中，寡核苷酸的長(zhǎng)度為約15到約30個(gè)核苷酸；在其它例子中，寡核苷酸的長(zhǎng)度為約15到約25個(gè)核苷酸。在其它例子中，寡核苷酸為至少約10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或至少約20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在其它例子中，寡核苷酸為至多約30，40，50，60，70，或80個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。包括鄰近LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG的核苷酸序列的寡核苷酸被用作引誘物寡核苷酸以降低，減少或抑制LIP表達(dá)。此外，具有與以上核苷酸序列互補(bǔ)的序列的寡核苷酸被用作反義寡核苷酸，以降低，減少或抑制LIP表達(dá)。例如，包括SEQ ID NO.1的第427個(gè)核酸G到第489個(gè)核酸C(63個(gè)堿基)的序列的核酸，或其互補(bǔ)鏈，以及包括SEQ ID NO3第565個(gè)核酸G到第627個(gè)核酸(63個(gè)堿基)的序列的核酸，或其互補(bǔ)鏈，是可以從其上設(shè)計(jì)寡核苷酸引誘物和/或反義核酸的區(qū)域。將作為寡核苷酸引誘物或反義核酸的寡核苷酸(DNA或RNA)插入到載體中，并轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中以降低或減少細(xì)胞中LIP的表達(dá)水平。在沒(méi)有理論限制的情況下，LIP的啟動(dòng)子或其類似物與寡核苷酸結(jié)合。本發(fā)明的寡核苷酸可單獨(dú)使用，或與本發(fā)明的重組體一起使用，或與其它治療物一起使用。
在如上所述的兩種情況中，LIP的表達(dá)被降低、減少或抑制，結(jié)果提高了LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的表達(dá)水平的比例，兩者都是從C/EBPβ(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β)基因表達(dá)的。如本文的實(shí)施例所證明，在癌癥的體內(nèi)模型中降低了LIP的表達(dá)，由此增加LAP與LIP的表達(dá)的比例，可得到與對(duì)照組相比較減少了癌癥形成和轉(zhuǎn)移的結(jié)果。因此，對(duì)細(xì)胞給予或?qū)肽軌蚪档汀p少或抑制LIP表達(dá)的寡核苷酸或反義核酸或iRNA，是與減少與癌癥有關(guān)的癥狀包括例如，癌癥形成和/或轉(zhuǎn)移以及減緩腫瘤生長(zhǎng)有相互關(guān)系的。
干擾RNA(iRNA)具有序列特異的，轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機(jī)制，轉(zhuǎn)錄后的基因沉默由與該基因同源的雙鏈RNAs(dsRNA)被抑制而產(chǎn)生。見(jiàn)Sharp，P.(2001，Genes&Development，15485490)。由mRNA加上其互補(bǔ)鏈組成的dsRNA形成RNA-RNA雙鏈體。此雙鏈體區(qū)域通過(guò)類RNAseIII的酶降解，且mRNA不能被翻譯。當(dāng)在細(xì)胞中導(dǎo)入時(shí)，短dsRNA(小干擾RNA或siRNA)在降解包含短dsRNA序列的mRNAs中也是有效的。在沒(méi)有理論的限制的情況下，有證據(jù)表明在細(xì)胞中存在細(xì)胞RNA降解體系，可能受dsRNA刺激，作為防止病毒或轉(zhuǎn)座子RNAs侵入的一種手段。本發(fā)明包括干擾RNA序列，該序列包含鄰近LIP的起始密碼子ATG的，且能夠降低、減少和/或抑制LIP表達(dá)的核苷酸序列。在某些例子中，iRNA被設(shè)計(jì)成能導(dǎo)向于LIP的起始ATG，其相應(yīng)于核苷酸序列SEQ ID NOl中第457到459個(gè)核苷酸，以及相應(yīng)于核苷酸序列SEQ ID NO3中的第595到597個(gè)核苷酸。設(shè)計(jì)iRNAs的方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的iRNA可單獨(dú)使用，或與本發(fā)明的重組載體一起使用，和/或與具有LAP活性的突變型LAP多肽一起使用，和/或與其它治療一起使用。
做為選擇，本發(fā)明包括能降低、減少、停止或抑制LIP轉(zhuǎn)錄，以及在某些例子中，使LAP不能有效表達(dá)的核酶的用途。能夠降低，減少或抑制LIP的核酶可單獨(dú)使用，或與本發(fā)明的重組載體一起使用，和/或與具有LAP活性的突變型LAP多肽一起使用，和/或與其它治療一起使用。
用于篩選能夠降低、減少和/或抑制LIP表達(dá)的特定寡核苷酸，反義核酸以及iRNAs的試驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的和在此描述的。簡(jiǎn)要地，在此的實(shí)施例中公開(kāi)的試驗(yàn)中，使g6乳腺癌細(xì)胞系與試樣例如本發(fā)明的重組載體、寡核苷酸、反義或iRNA接觸，并組織學(xué)檢驗(yàn)形態(tài)和細(xì)胞粘著。在與能夠降低、減少和/或抑制LIP表達(dá)的重組載體，寡核苷酸，反義或干擾RNAs(iRNAs)接觸的細(xì)胞中，其形態(tài)將類似于正常的非癌的細(xì)胞。還可以將這種細(xì)胞導(dǎo)入到先天裸鼠中，測(cè)定癌癥形成能力和癌癥的轉(zhuǎn)移。可使用重組載體，例如包含部分或全部CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)基因的核苷酸序列的病毒載體作為對(duì)照組，其中所述部分或全部C/EBPβ基因包含鄰近LIP轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白的起始密碼子ATG的核酸，且其中核苷酸序列包含鄰近所述LIP轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白的起始密碼子ATG的突變。在本文的實(shí)施例中描述的重組載體可在篩選試驗(yàn)中作為對(duì)照組使用。組合物以及其用途本發(fā)明包括包含本發(fā)明的重組載體，重組病毒載體或病毒顆粒，寡核苷酸，反義RNA或或iRNA的組合物。在某些例子中，組合物也可以進(jìn)一步地包含藥學(xué)可接受的賦形劑或載體，或緩沖液。
在某些例子中，這種組合物用于治療和/或改善相關(guān)于細(xì)胞或個(gè)體中LAP與LIP的比例的疾病或狀況，例如癌癥和/或腫瘤生長(zhǎng)的癥狀的方法。在某些例子中，在此公開(kāi)的組合物顯示出溶瘤活性。在此使用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指改善，提高，減少，或穩(wěn)定化一或多種疾病或不希望的狀況例如癌癥的癥狀，以及減緩一或多種疾病或不希望的狀況的癥狀的進(jìn)展。本發(fā)明的組合物可以或不能與其它治療程式結(jié)合使用，包括但不局限于本領(lǐng)域已知的化療劑，輻射和/或抗體。在某些例子中，本發(fā)明的組合物是與部分或全部上皮形成素聯(lián)合用藥的。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“惡性的”，“惡性的細(xì)胞“，“腫瘤”，“腫瘤細(xì)胞”，“癌癥”以及“癌細(xì)胞”，(可互換地使用)指的是顯示相對(duì)自發(fā)生長(zhǎng)的細(xì)胞，以致這些細(xì)胞顯示出以細(xì)胞增殖顯著失控為特征的異常的生長(zhǎng)表現(xiàn)型。術(shù)語(yǔ)“腫瘤”包括轉(zhuǎn)移性的以及非轉(zhuǎn)移性腫瘤。
在此使用的“溶瘤活性”是指對(duì)腫瘤和/或惡性的和/或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用或壓制作用；腫瘤和/或惡性的和/或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的退行作用；腫瘤和/或惡性的和/或癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡，或預(yù)防其它腫瘤和/或惡性的和/或癌細(xì)胞的產(chǎn)生。在此使用的“抑制或壓制腫瘤生長(zhǎng)”是指在給予包含VSV的組合物、或本發(fā)明的方法的情況下減少腫瘤的生長(zhǎng)速度，使腫瘤生長(zhǎng)完全停止，導(dǎo)致已存在的腫瘤的大小的退行作用，根除腫瘤的存在和/或阻止其它腫瘤的發(fā)生。“抑制”腫瘤生長(zhǎng)表示當(dāng)與沒(méi)有與本發(fā)明的組合物接觸的生長(zhǎng)相比較時(shí)生長(zhǎng)的狀態(tài)被衰減。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法評(píng)價(jià)，包括但不限于測(cè)定腫瘤大小，使用3H-胸苷摻入試驗(yàn)確定腫瘤細(xì)胞是否增殖，或腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)?！耙种啤蹦[瘤和/或惡性的和/或癌細(xì)胞生長(zhǎng)是指下面的任何一種或所有狀態(tài)減緩，延遲，以及停止腫瘤生長(zhǎng)，以及腫瘤收縮。腫瘤和/或惡性的和/或癌性的細(xì)胞的“延遲進(jìn)展”是指推遲，阻礙，減緩，延遲，穩(wěn)定化，和/或延緩疾病的進(jìn)展。該延遲根據(jù)疾病的歷史和/或被治療的個(gè)體可以是持續(xù)時(shí)間。
本發(fā)明包括使用本發(fā)明的重組載體或能夠降低、減少和/或抑制LIP表達(dá)，特別是與在此描述的惡性細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞有關(guān)的LIP表達(dá)的寡核苷酸、反義核酸或iRNA來(lái)增加LAP對(duì)LIP的比例的組合物和方法。適于該治療的個(gè)體是被認(rèn)為具有發(fā)生癌癥、腫瘤或惡性細(xì)胞的危險(xiǎn)的個(gè)體，例如先前有過(guò)包括癌癥、惡性的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的疾病的那些個(gè)體，或有過(guò)這種癌癥、腫瘤細(xì)胞或惡性的細(xì)胞家族史的那些個(gè)體。將根據(jù)可估計(jì)的臨床參數(shù)例如血清學(xué)指征和細(xì)胞、組織或腫瘤活檢物的組織學(xué)檢查來(lái)確定給予本發(fā)明的組合物的適合性。通常，可以給予在藥學(xué)可接受的賦形劑中的組合物。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了抑制癌癥或腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括使癌癥或腫瘤細(xì)胞與本發(fā)明的重組載體或突變型LAP多肽，或核酸構(gòu)建物，例如寡核苷酸或反義核酸或iRNA接觸的步驟，從而增加腫瘤或細(xì)胞中的LAP與LIP的比例。
在其它例子中，這種組合物被用于篩選調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中LAP與LIP的比例的試劑的方法。在某些例子中，用篩選方法來(lái)確定降低，減少或抑制宿主細(xì)胞中LIP表達(dá)的試劑。在其它例子中，用篩選方法來(lái)確定增加宿主細(xì)胞中LAP的表達(dá)或增加宿主細(xì)胞中LAP的生物活性的試劑。在其它例子中，試劑或重組載體或核酸構(gòu)建物具有溶瘤活性，如在此處公開(kāi)的篩選試驗(yàn)中所測(cè)定。
然而在其它例子中，本發(fā)明提供了確定癌細(xì)胞，惡性的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞是否對(duì)用本發(fā)明的組合物治療敏感的方法，該方法包括(a)將包含癌，惡性的或腫瘤細(xì)胞樣品分成第一部分和第二部分；(b)用組合物，例如病毒載體或包含部分或全部CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)基因的核苷酸序列的重組載體，或能夠減少LIP轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸或反義核酸或iRNA，或一種通過(guò)此處公開(kāi)的篩選法確定的試劑處理第一部分，其中所述部分或全部C/EBPβ基因包含鄰近LIP轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白的起始密碼子ATG的區(qū)域，且其中核苷酸序列包含LIP轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白的起始密碼子ATG中的突變；以及(c)確定第一部分中的死細(xì)胞百分比是否高于第二部分，其中如果第一部分的死細(xì)胞百分比高于第二部分，則癌，惡性或腫瘤細(xì)胞對(duì)用組合物治療是敏感的。
在某些例子中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于基因治療的試劑，即涉及向細(xì)胞中給予或遞送的試劑，其中該試劑包含重組基因載體，該重組基因載體包含部分或全部CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)基因，其中C/EBPβ(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β)的核苷酸序列中的LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG被另一個(gè)密碼子所取代，其中取代密碼子不是TTG，或該試劑包含本發(fā)明的寡核苷酸或反義核酸或iRNA。這種組合物可被用于治療和/或改善癌癥的癥狀的方法，例如，抑制或減緩腫瘤生長(zhǎng)。在某些例子中，當(dāng)局部地給予腫瘤細(xì)胞或惡性的細(xì)胞時(shí)，以及當(dāng)給予腫瘤或惡性的細(xì)胞遠(yuǎn)端時(shí)，例如通過(guò)靜脈內(nèi)給藥或通過(guò)其它途徑給藥，這樣的試劑將具有溶瘤活性。在一些例子中，本發(fā)明的重組載體或突變型LAP多肽，或核酸構(gòu)建物，例如寡核苷酸或反義核酸或iRNA是離體進(jìn)行，被處理的細(xì)胞在處理后返回到個(gè)體中。
要被治療的癌癥的例子包括，但不局限于，惡性黑色素瘤，惡性淋巴瘤，消化器官癌，肺癌，食道癌，胃癌，大腸癌，直腸癌，結(jié)腸癌，輸尿管腫瘤，膽囊癌，膽管癌，膽道癌，乳腺癌，肝癌，胰腺癌，睪丸腫瘤，上頜癌，舌癌，唇癌，口腔癌，咽癌，喉癌，卵巢癌，子宮癌，前列腺癌，甲狀腺癌，腦腫瘤，卡波西肉瘤，血管瘤，白血病，瓦凱氏病，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，骨髓瘤，膀胱腫瘤，肉瘤，骨肉瘤，肌肉腫瘤，皮膚癌，基細(xì)胞癌，皮膚附器癌，轉(zhuǎn)移皮膚癌，以及皮膚黑素瘤。優(yōu)選被治療的癌癥的例子包括乳腺癌和肝癌。
用于本發(fā)明的方法的本發(fā)明的組合物可以通過(guò)將重組基因載體，例如病毒載體，(或寡核苷酸或反義核酸或iRNA)作為活性組分與基體材料混合制備。
此外，當(dāng)重組載體被整合到病毒載體中時(shí)，用于基因治療的組合物，即遞送至細(xì)胞中的試劑可以通過(guò)制備包含重組體DNAs的病毒顆粒以及將它們與基體材料混合制備。
用于注射的任何通常的基體材料可被用作基因治療用試劑的基體材料，且它們的例子包括蒸餾水，鹽溶液例如氯化鈉或氯化鈉和無(wú)機(jī)鹽的混合物，甘露糖醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖溶液等等，甘氨酸、精氨酸等的氨基酸溶液，葡萄糖溶液與有機(jī)酸溶液或鹽溶液的混合溶液。做為選擇，除這些基體材料之外，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法，注射劑可以通過(guò)使用佐劑例如滲透壓調(diào)節(jié)劑、酸堿度調(diào)節(jié)劑、植物油或表面活性劑制成溶液、懸浮液、或分散液形式。這些注射劑還可以通過(guò)例如粉末化和冷凍干燥等操作制備，以作為在使用之前被溶解的制劑。此外，本發(fā)明的試劑是被包封在脂質(zhì)體或其它物質(zhì)中的，如果必要的話，僅僅在給藥前被包封，且因此該試劑可被用于治療和/或改善癌癥的癥狀。
作為在活生物體中導(dǎo)入本發(fā)明的組合物的方法，下面的方法是已知的基因的化學(xué)或物理導(dǎo)入法(轉(zhuǎn)染法)；以及使用病毒的方法(轉(zhuǎn)導(dǎo)法)。
用物理手段將基因?qū)牖钌矬w的方法(轉(zhuǎn)染法)的例子包括體內(nèi)電穿孔法方法以及基因槍方法。體內(nèi)電穿孔法是一種通過(guò)對(duì)活體組織直接施加電壓脈沖而在活體組織中導(dǎo)入DNAs的方法。將DNAs溶解到適宜的緩沖溶液(例如1mM Tris，25uM EDTA，150mM NaCl)中，并將得到的溶液使用玻璃電極注入到組織中。在基因槍方法中，將與金顆粒連接的DNAs加速并導(dǎo)入到細(xì)胞中。在大氣壓下，Biorad研制的手持型Helios槍能夠以簡(jiǎn)單的方法通過(guò)體內(nèi)方法高效率地將基因直接導(dǎo)入到個(gè)體中。見(jiàn)Kuo C.F等人2002，Methods of Mol.Med.69137-147?；驑尫椒ň哂邢旅娴膬?yōu)點(diǎn)DNA分解體系例如核內(nèi)體是無(wú)效的，基因可以被導(dǎo)入到任何類型的組織中，且基因可以被導(dǎo)入到特異性部位。
用化學(xué)手段將基因?qū)牖钌矬w的方法的例子包括脂質(zhì)體方法，膜融合蛋白-脂質(zhì)體方法，以及脂轉(zhuǎn)染方法。Nidome T和Huang L，2002，Gene Ther241647-1652。
脂質(zhì)體是一種由極性脂類例如磷脂在水相中形成的泡囊。在形成脂質(zhì)體的過(guò)程中，導(dǎo)入進(jìn)脂質(zhì)體的基因被包裝在膜中。此外，可以進(jìn)行投射治療，其中將一種特異性蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)合到脂質(zhì)體中，并將得到的產(chǎn)物在目的細(xì)胞上濃縮，即靶向遞送到目的細(xì)胞中。
在膜融合蛋白-脂質(zhì)體方法中，將一種病毒被膜與脂質(zhì)體結(jié)合，該病毒被膜是各種病毒進(jìn)入細(xì)胞中的一種進(jìn)入手段。例如，可使用仙臺(tái)病毒的膜融合蛋白，其具有在中性條件下的高融合能力，且通過(guò)細(xì)胞融合可制備多核細(xì)胞。
脂轉(zhuǎn)染方法是一種使用陽(yáng)離子脂類的方法。人們認(rèn)為陽(yáng)離子脂類可中和被導(dǎo)入的基因的負(fù)電荷，且陽(yáng)離子類脂將同時(shí)中和質(zhì)膜表面的負(fù)電荷，并由于脂類的疏水性而與膜溶合，由此纏繞DNAs。陽(yáng)離子脂類的具體商業(yè)產(chǎn)品的例子包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)染蛋白，脂轉(zhuǎn)染胺，和轉(zhuǎn)染胺(transfectam)。這些陽(yáng)離子脂類被認(rèn)為具有類脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，且導(dǎo)入的基因被結(jié)合在脂質(zhì)體表面。
轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種使用病毒在活生物體中導(dǎo)入基因的方法，該方法能夠高效率地導(dǎo)入基因。具體地，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺伴隨病毒載體等等。
藥學(xué)可接受的載體是本領(lǐng)域熟知的，包括但不局限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，無(wú)菌等滲緩沖水溶液，以及它們的組合。這樣的一種可接受的載體的例子是包含一或多種穩(wěn)定劑例如穩(wěn)定化的水解蛋白質(zhì)、乳糖等等的一種生理學(xué)平衡培養(yǎng)基。載體優(yōu)選是無(wú)菌的。制劑將適合給藥的方式。
如果需要，組合物還可以包含少量的濕潤(rùn)或乳化劑，或pH緩沖劑。組合物可以是液體溶液，懸浮液，乳劑，片劑，藥丸，膠囊，持續(xù)釋放制劑，或粉劑?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)載體例如藥物級(jí)的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂，等等。
通常，組分是單獨(dú)地或在單位劑型中混合地提供的，例如以在標(biāo)明活性劑的量的密閉容器例如安瓿或sachette中的干燥凍干粉劑或無(wú)水的濃縮物被提供的。當(dāng)組合物通過(guò)注射給藥時(shí)，可以提供無(wú)菌稀釋劑的安瓿，以使組分可以在給藥之前混合。
應(yīng)用于制劑中的組合物或組合物中試劑的準(zhǔn)確劑量將取決于給藥途徑，和將被治療的細(xì)胞或個(gè)體例如人的性質(zhì)，且應(yīng)該根據(jù)醫(yī)師的判斷和根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)的環(huán)境而決定。在特定制劑中使用的試劑的精確的量不是關(guān)鍵的，條件是給出為產(chǎn)生所需要的活性，例如溶瘤活性所必需的組合物的最低量。預(yù)期的劑量范圍為少至約10毫克，多至1毫克或以上的量。
本發(fā)明的載體或病毒顆粒或核酸組合物的有效劑量還可以由動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)得到的劑量反應(yīng)曲線外推得到。
用于本發(fā)明的基因治療的試劑劑量可根據(jù)患者的年齡，性別，或患者健康狀況，或給藥的途徑或時(shí)間，藥劑的劑型而改變。通常，用于成年人的重組載體的日劑量在約1μg/kg到1000mg/kg的范圍，且在其它例子中，為約10μg/kg到100mg/kg的范圍。給藥的時(shí)間沒(méi)有特別限制。如果以病毒的形式給藥，為約102直到約107p.f.u.，在其它例子中，為約103直到約106p.f.u.，以及在其它例子中，可以給予約104直到約105p.f.u.。如果以多核苷酸構(gòu)建物，例如，重組載體(即不是包裝為病毒)給藥，可以給予約0.01μg到約100μg的本發(fā)明的構(gòu)建物，在其它例子中，給予0.1μg到約500μg，以及在其它例子中，可以給予約0.5μg到約200μg。可以同時(shí)或依次給予一種以上的組合物。在某些例子中，本發(fā)明組合物是與部分或全部上皮形成素聯(lián)合給藥的。給藥是典型地在監(jiān)測(cè)反應(yīng)下周期地給藥。給藥可以是例如，腫瘤內(nèi)，靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
許多方法可能用來(lái)在個(gè)體中給予或?qū)氡景l(fā)明的組合物，例如病毒載體或病毒顆粒，這些方法包括但不局限于口服，皮內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，皮下，以及鼻內(nèi)的途徑。組合物所給予的個(gè)體為靈長(zhǎng)類，或在其它例子中，為哺乳動(dòng)物，或在其它例子中為人，但還可以是非人的哺乳動(dòng)物且包括但不局限于牛，馬，羊，豬，貓，狗，倉(cāng)鼠，小鼠以及大鼠。對(duì)于本發(fā)明的試劑的給藥形式，可以使用常規(guī)的全身性給藥例如靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)給藥，或可以使用對(duì)致癌病變或潛在的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的局部給藥例如局部注射或口服。此外，對(duì)于本發(fā)明的試劑的給藥，還可以使用與導(dǎo)管技術(shù)，基因?qū)爰夹g(shù)，外科手術(shù)技術(shù)等等相結(jié)合的給藥形式。
而且，上皮形成素已知具有增加C/EBPβ的表達(dá)的功能(Hirai等人，Journalof Cell Biology，Vol.153，No.4，2001，785-794)。因此，本發(fā)明的基因治療劑可以進(jìn)一步通過(guò)其與具有上皮形成素活性的蛋白或肽聯(lián)合使用來(lái)提高其治療的效果。用途改進(jìn)LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)/LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的表達(dá)水平的比例通過(guò)使用本發(fā)明的組合物，例如包含在此描述的重組基因載體或能夠降低、減少和/或抑制LIP表達(dá)、或能夠增加LAP表達(dá)的寡核苷酸或反義核酸或iRNA的藥物組合物，在細(xì)胞中表達(dá)的LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)活性與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)活性的表達(dá)水平的比例可以被改變。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了改進(jìn)細(xì)胞中LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)表達(dá)水平的比例的方法，包含使細(xì)胞與在此描述的重組載體或在此描述的寡核苷酸或反義核酸或iRNA在適宜條件下接觸。該方法也將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。特別地，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的組合物的抗癌活性，或溶瘤活性，或例如，腫瘤抑制活性可以隨LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)表達(dá)水平的比例而改變，以便增加LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的比例(LAP表達(dá)/LIP表達(dá))。即，本發(fā)明范圍包括治療和/或改善與癌癥有關(guān)的癥狀的方法，例如抑制腫瘤生長(zhǎng)，該方法包括在癌癥患者中將異常的LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)/LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)表達(dá)水平的比例調(diào)回至正常比值的步驟。篩選抗癌劑的方法本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用LAP和LIP的表達(dá)水平的比例作為指標(biāo)篩選試劑的方法，LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)和LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)都是由C/EBPβ(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β)基因表達(dá)的。通過(guò)本發(fā)明的篩選方法，可以選擇出可以將癌癥患者中的異常的LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)/LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的表達(dá)水平比例調(diào)回至正常比值的物質(zhì)。這樣選擇出的可以將癌癥患者中的異常的LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)/LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的表達(dá)水平比例調(diào)回至正常比值的物質(zhì)可有效用于治療和/或改善癌癥的癥狀，例如，減緩腫瘤的生長(zhǎng)。
可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，例如RNA印跡方法，RT-PCR方法，或蛋白印跡法確定LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)和LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的表達(dá)水平的比例，LAP和LIP都是由C/EBPβ(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β)基因表達(dá)的。用于在這些方法中檢測(cè)LAP和LIP的探針，引物或抗體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)方法使用在本說(shuō)明書(shū)中描述的LAP和LIP的核苷酸序列和氨基酸序列得到或制備。
用于本發(fā)明的篩選方法的試驗(yàn)物質(zhì)的種類沒(méi)有特別限制，且可使用任何物質(zhì)。試驗(yàn)物質(zhì)可以為寡核苷酸，反義核酸，iRNA，低分子量合成化合物或存在于天然存在的物質(zhì)的提取物中的化合物，或可能為化合物庫(kù)，噬菌體展示庫(kù)，或組合庫(kù)。在某些例子中，試驗(yàn)物質(zhì)是低分子量化合物，且優(yōu)選低分子量化合物的化合物庫(kù)?；衔飵?kù)的構(gòu)建物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，還可以使用可商購(gòu)的化合物庫(kù)。
本發(fā)明將提供下面的實(shí)施例詳細(xì)描述，但本發(fā)明的范圍不限制在這些實(shí)施例。
用Nhe I和Bam HI處理Promegap TARGET(PROMEGA)載體，并將上述(a)制備的cDNA使用連接試劑盒(TAKARA)插入到該載體中。
用PtetLAP作為模板，并使用下面的引物(引物3ATA TGC TAG CGG CCGGCT TCC CGT TCG CCC TGC GCG(SEQ ID NO7)；和引物4ATA TGC TAGCAG TGA CCC GCC GAG GCC AGC AGC GGC(SEQ ID NO8))和LATag(TAKARA)來(lái)構(gòu)建LIP區(qū)域cDNA，接著用Nhe I處理，以使它們的末端變成Nhe I位點(diǎn)。
將先前在大腸桿菌中增殖和純化的以上(b)的質(zhì)粒，用Nhe I裂解，并將末端用堿性磷酸酶(TAKARA BAP)去磷酸化。使用Takara連接試劑盒將以上的(c)的DNA插入到其中。
通過(guò)測(cè)定序列，證實(shí)在質(zhì)粒LAP內(nèi)的LIP翻譯起始密碼子ATG被CGC取代(導(dǎo)入突變的LAP的證實(shí))。
切下pTet-接頭載體(GBCO BRL)的Eco RI位點(diǎn)并用BAP處理之后，將由以上(e)的DNA中切除的包括導(dǎo)入突變的LAP的Eco RI切割片段插入到其中(pTet-接頭突變的導(dǎo)入型LAP的構(gòu)建)。實(shí)施例2細(xì)胞培養(yǎng)和基因?qū)雽6細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞系)(Desprez等人，1993，Mol.Cell Differ.199-110Roskelley等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91，12378-12382；Hirai等人，1998，J.Cell.Biol.140159-169)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(加入5％FBS[Hyclone]，5μg/ml胰島素[Sigma-Aldrich]和50μg/ml慶大霉素的DME/F12[GIBCO BRL])中維持。用實(shí)施例1中得到的載體(5μg)，pTet.tTAK載體(Life Technologies)(5μg)，和pSV40neo(Schmidhauser等人，1992，Mol.Biol.Cell.3699-709)(0.5μg)使用質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(Life Technologies)根據(jù)該廠家提供的說(shuō)明轉(zhuǎn)染g6細(xì)胞(5×105)。在連續(xù)存在的四環(huán)素中，選擇耐新霉素的克隆，而后在有或沒(méi)有5μg/ml四環(huán)素的存在下通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析LAP的表達(dá)。通過(guò)此方法分離g6LAP，g6LAP′，和g6LAP″細(xì)胞系。實(shí)施例3由導(dǎo)入突變的LAP引起的細(xì)胞的形態(tài)改變g6細(xì)胞和g6LAP細(xì)胞的形態(tài)見(jiàn)

圖1。當(dāng)在沒(méi)有四環(huán)素的情況下培養(yǎng)時(shí)，可以觀察到具有導(dǎo)致細(xì)胞粘著的導(dǎo)入突變的LAP基因的表達(dá)，且該細(xì)胞形態(tài)上類似于正常細(xì)胞。實(shí)施例4導(dǎo)入突變的LAP對(duì)E-鈣粘著蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行蛋白印跡法。向培養(yǎng)于24-孔平板的細(xì)胞中加入500μlSDS樣品緩沖液。收集細(xì)胞并超聲處理。將得到的樣品置于4-20％的凝膠電泳上，并在PVDF膜上產(chǎn)生FP跡，接著用包含5％脫脂乳(TBST)的TES封閉1小時(shí)，而后與在TBST中稀釋了500倍的抗E-鈣粘著蛋白抗體(ECCD2，TAKARA)反應(yīng)1小時(shí)。反復(fù)進(jìn)行兩次10分鐘的TBS洗滌。使生成物與在TBST中稀釋1000倍的抗大鼠IgHRP標(biāo)記(Amersharn Pharmacia)反應(yīng)1小時(shí)。將生成物用TBS充分洗滌3次，每次洗滌10分鐘。然后，使用ECL(Amersharn Pharmacia)進(jìn)行放射自顯影。結(jié)果見(jiàn)圖2。
從圖2的結(jié)果可知，E-鈣粘著蛋白的表達(dá)被誘導(dǎo)，這是由于在不包含四環(huán)素的培養(yǎng)基中導(dǎo)入突變的LAP(3種不同克隆，g6LAP，g6LAP′和g6LAP″)的表達(dá)。
序列表<110>住友電氣工業(yè)株式會(huì)社<120>對(duì)LAP與LIP之比例的控制<130>FA2180A<160>8<210>1<211>894<212>DNA<213>大鼠<400>1atg cac cgc ctg ctg gcc tgg gac gca gca tgc ctc ccg ccg ccg ccc 48Met His Arg Leu Leu Ala Trp Asp Ala Ala Cys Leu Pro Pro Pro Pro15 10 15gcc gcc ttt aga ccc atg gaa gtg gcc aac ttc tac tac gag ccc gac 96Ala Ala Phe Arg Pro Met Glu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr Glu Pro Asp20 25 30tgc ctg gcc tac ggg gcc aag gcg gcc cgc gcc gcg ccg cgc gcc ccc 144Cys Leu Ala Tyr Gly Ala Lys Ala Ala Arg Ala Ala Pro Arg Ala Pro35 40 45gcc gcc gag ccg gcc atc ggc gag cac gag cgc gcc atc gac ttc agc 192Ala Ala Glu Pro Ala Ile Gly Glu His Glu Arg Ala Ile Asp Phe Ser50 55 60ccc tac ctg gag ccg ctc gcg ccc gcc gcc gcg gac ttc gcc gcg ccc 240Pro Tyr Leu Glu Pro Leu Ala Pro Ala Ala Ala Asp Phe Ala Ala Pro65 70 75 80gcg ccc gcg cac cac gac ttc ctt tcc gac ctc ttc gcc gac gac tac 288Ala Pro Ala His His Asp Phe Leu Ser Asp Leu Phe Ala Asp Asp Tyr85 90 95ggc gcc aag ccg agc aag aag ccg tcc gac tac ggt tac gtg agc ctc 336Gly Ala Lys Pro Ser Lys Lys Pro Ser Asp Tyr Gly Tyr Val Ser Leu100 105 110ggc cgc gcg ggc gcc aag gcc gca ccg ccc gcc tgc ttc ccg ccg ccg 384Gly Arg Ala Gly Ala Lys Ala Ala Pro Pro Ala Cys Phe Pro Pro Pro115 120 125cct ccc gcc gca ctc aag gcc gag ccg ggc ttc gaa ccc gcg gac tgc 432Pro Pro Ala Ala Leu Lys Ala Glu Pro Gly Phe Glu Pro Ala Asp Cys130 135 140aag cgc gcg gac gac gcg ccc gcc atg gcg gcc ggc ttc ccg ttc gcc 480Lys Arg Ala Asp Asp Ala Pro Ala Met Ala Ala Gly Phe Pro Phe Ala145 150 155 160ctg cgc gcc tac ctg ggc tac cag gcg acg ccg agc ggc agc agc ggc 528Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala Thr Pro Ser Gly Ser Ser Gly165 170 175agc ctg tcc acg tcg tcg tcg tcc agc ccg ccc ggg acg ccg agc ccc 576Ser Leu Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro180 185190gcc gac gcc aag gcc gcg ccc gcc gcc tgc ttc gcg ggg ccg ccg gcc 624Ala Asp Ala Lys Ala Ala Pro Ala Ala Cys Phe Ala Gly Pro Pro Ala195 200 205gcg ccc gcc aag gcc aag gcc aag aag gcg gtg gac aag ctg agc gac 672Ala Pro Ala Lys Ala Lys Ala Lys Lys Ala Val Asp Lys Leu Ser Asp210 215 220gag tac aag atg cgg cgc gag cgc aac aac atc gcg gtg cgc aag agc 720Glu Tyr Lys Met Arg Arg Glu Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser225 230 235 240cgc gac aag gcc aag atg cgc aac ctg gag acg cag cac aag gtg ctg 768Arg Asp Lys Ala Lys Met Arg Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu245 250 255gag ctg acg gcg gag aac gag cgg ctg cag aag aag gtg gag cag ctg 816Glu Leu Thr Ala Glu Asn Glu Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu260 265 270tcg cga gag ctc agc acg ctg cgg aac ttg ttc aag cag ctg ccc gag 864Ser Arg Glu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pho Glu275 280 285ccg ctg ctg gcc tcg gcg ggt cac tgc tag 894Pro Leu Leu Ala Ser Ala Gly His Cys290 295<210>2<211>297<212>PRT<213>大鼠<400>2Met His Arg Leu Leu Ala Trp Asp Ala Ala Cys Leu Pro Pro Pro Pro1 5 10 15Ala Ala Phe Arg Pro Met Glu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr Glu Pro Asp20 25 30Cys Leu Ala Tyr Gly Ala Lys Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Ala Pro35 40 45Ala Ala Glu Pro Ala Ile Gly Glu His Glu Arg Ala Ile Asp Phe Ser50 55 60Pro Tyr Leu Glu Pro Leu Ala Pro Ala Ala Ala Asp Phe Ala Ala Pro65 70 75 80Ala Pro Ala His His Asp Phe Leu Ser Asp Leu Phe Ala Asp Asp Tyr85 90 95Gly Ala Lys Pro Ser Lys Lys Pro Ser Asp Tyr Gly Tyr Val Ser Leu100 105 110Gly Arg Ala Gly Ala Lys Ala Ala Pro Pro Ala Cys Phe Pro Pro Pro115 120 125Pro Pro Ala Ala Leu Lys Ala Glu Pro Gly Phe Glu Pro Ala Asp Cys130 135 140Lys Arg Ala Asp Asp Ala Pro Ala Met Ala Ala Gly Phe Pro Phe Ala145 150 155 160Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala Thr Pro Ser Gly Ser Ser Gly165 170 175Ser Leu Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro180 185190Ala Asp Ala Lya Ala Ala Pro Ala Ala Cys Phe Ala Gly Pro Pro Ala195 200 205Ala Pro Ala Lys Ala Lys Ala Lys Lys Ala Val Asp Lys Leu Ser Asp210 215220Glu Tyr Lys Met Arg Arg Glu Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser225 230 235 240Arg Asp Lys Ala Lys Met Arg Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu245 250 255Glu Leu Thr Ala Glu Asn Glu Arg Leu Gln Lys Lys Val Gln Gln Leu260 265 270Ser Arg Glu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu275 280 285Pro Leu Leu Ala Ser Ala Gly His Cys290 295<210>3<211>1065<212>DNA<213>人<400>3atg caa cgc ctg gtg gcc tgg gac cca gca tgt ctc ccc ctg ccg ccg 48Met Gln Arg Leu Val Ala Trp Asp Pro Ala Cys Leu Pro Leu Pro Pro15 10 15ccg ccg cct gcc ttt aaa tcc atg gaa gtg gcc aac ttc tac tac gag 96Pro Pro Pro Ala Phe Lys Ser Met Glu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr Glu20 25 30gcg gac tgc ttg gct gct gcg tac ggc ggc aag gcg gcc ccc gcg gcg 144Ala Asp Cya Leu Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Lys Ala Ala Pro Ala Ala35 40 45ccc ccc gcg gcc aga ccc ggg ccg cgc ccc ccc gcc ggc gag ctg ggc 192Pro Pro Ala Ala Arg Pro Gly Pro Arg Pro Pro Ala Gly Glu Leu Gly5055 60agc atc ggc gac cac gag cgc gcc atc gac ttc agc ccg tac ctg gag 240Ser Ile Gly Asp His Glu Arg Ala Ile Asp Phe Ser Pro Tyr Leu Glu65 70 75 80ccg ctg ggc gcg ccg cag gcc ccg gcg ccc gcc acg gcc acg gac acc 288Pro Leu Gly Ala Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Thr Ala Thr Asp Thr85 90 95ttc gag gcg gct 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115120 125aag aac tgc aag aag ccg gcc gag tac ggc tac gtg agc ctg ggg cgc 432Lys Asn Cys Lys Lys Pro Ala Glu Tyr Gly Tyr Val Ser Leu Gly Arg130 135 140ctg ggg gct gcc aag ggc gcg ctg cac ccc ggc tgc ttc gcg ccc ctg 480Leu Gly Ala Ala Lys Gly Ala Leu His Pro Gly Cys Phe Ala Pro Leu145 150 155 160cac cca ccg ccc ccg ccg ccg ccg ccg ccc gcc gag ctc aag gcg gag 528His Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Glu Leu Lys Ala Glu165 170 175ccg ggc ttc gag ccc gcg gac tgc aag cgg aag gag gag gcc ggg gcg 576Pro Gly Phe Glu Pro Ala Asp Cys Lys Arg Lys Glu Glu Ala Gly Ala180 185 190ccg ggc ggc ggc gca ggc atg gcg gcg ggc ttc ccg tac gcg ctg cgc 624Pro Gly Gly Gly Ala Gly Met Ala Ala Gly Phe Pro Tyr Ala Leu Arg195 200 205gct tac ctc ggc tac cag gcg gtg ccg agc ggc agc agc ggg agc ctc 672Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Leu210 215 220tcc agc tcc tcc tcg tcc agc ccg ccc ggc agc ccg agc ccc gct gac 720Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro Ala Asp225 230235 240gcc aag gcc ccc ccg acc gcc tgc tac gcg ggg gcc ggg ccg gcg ccc 768Ala Lys Ala Pro Pro Thr Ala Cys Tyr Ala Gly Ala Gly Pro Ala Pro245 250 255tcg cag gtc aag agc aag gcc aag aag acc gtg gac aag cac agc gac 816Ser Gln Val Lys Ser Lys Ala Lys Lys Thr Val Asp Lys His Ser Asp260 265 270gag tac aag atc cgg cgc gag cgc aac aac atc gcc gtg cgc aag agc 864Glu Tyr Lys Ile Arg Arg Glu Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser275 280 285cgc gac aag gcc aag atg cgc aac ctg gag acg cag cac aag gtc ctg 912Arg Asp Lys Ala Lys Met Arg Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu290 295 300gag ctc acg gcc gag aac gag cgg ctg cag aag aag gtg gag cag ctg 960Glu Leu Thr Ala Glu Asn Glu Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu305 310 315 320tcg cgc gag ctc agc acc ctg cgg aac ttg ttc aag cag ctg ccc gag 1008Ser Arg Glu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu325 330 335ccc ctg ctc gcc tcc tcc ggc cac tgc tag 1065Pro Leu Leu Ala Ser Ser Gly His Cys340345<210>4<211>345<212>PRT<213>人<400>4Met Gln Arg Leu Val Ala Trp Asp Pro Ala Cys Leu Pro Leu Pro Pro15 10 15Pro Pro Pro Ala Phe Lys Ser Met Glu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr Glu20 25 30Ala Asp Cys leu Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Lys Ala Ala Pro Ala Ala35 40 45Pro Pro Ala Ala Arg Pro Gly Pro Arg Pro Pro Ala Gly Glu Leu Gly50 55 60Ser Ile Gly Asp His Glu Arg Ala Ile Asp Phe Ser Pro Tyr Leu Glu65 70 75 80Pro Leu Gly Ala Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Ala Thr Asp Thr85 9095Phe Glu Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Gly100 105 110Gln His His Asp Phe Leu Ser Asp Leu Phe Ser Asp Asp Tyr Gly Gly115 120 125Lys Asn Cys Lys Lys Pro Ala Glu Tyr Gly Tyr Val Ser Leu Gly Arg130 135 140Leu Gly Ala Ala Lys Gly Ala Leu His Pro Gly Cys Phe Ala Pro Leu145 150 155 160His Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Glu Leu Lys Ala Glu165170 175Pro Gly Phe Glu Pro Ala Asp Cys Lys Arg Lys Glu Glu Ala Gly Ala180 185 190Pro Gly Gly Gly Ala Gly Met Ala Ala Gly Phe Pro Tyr Ala Leu Arg195 200 205Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Leu210 215 220Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro Ala Asp225 230235 240Ala Lys Ala Pro Pro Thr Ala Cys Tyr Ala Gly Ala Gly Pro Ala Pro245 250 255Ser Gln Val Lys Ser Lys Ala Lys Lys Thr Val Asp Lys His Ser Asp260 265 270Glu Tyr Lys Ile Arg Arg Glu Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser275 280 285Arg Asp Lys Ala Lys Met Arg Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu290 295 300Glu Leu Thr Ala Glu Asn Glu Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu305 310 315 320Ser Arg Glu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu325 330 335Pro Leu Leu Ala Ser Ser Gly His Cys340345<210>5<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚DNA<400>5gggggatccc gccatggaag tggccaactt ctactac 37<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚DNA<400>0atatgctagc gcgggcgcgt cgtccgcgcg cttgca 36<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚DNA<400>7atatgctagc ggccggcttc ccgttcgccc tgcgcg 36<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡聚DNA<400>8atatgctagc agtgacccgc cgaggccagc agcggc 3權(quán)利要求
1.一種編碼LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)活性的重組載體，其中LIP活性的表達(dá)被抑制，且其中LIP活性的表達(dá)被抑制到使得LIP不會(huì)下調(diào)LAP活性。
2.權(quán)利要求1的重組載體，包含部分或全部CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)基因的核苷酸序列，其中所述部分或全部C/EBPβ基因包含鄰近LIP轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白的起始密碼子ATG的核苷酸序列，且其中核苷酸序列包含鄰近所述LIP轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白的起始密碼子ATG的突變。
3.權(quán)利要求2的重組載體，其中所述突是用編碼另一種氨基酸的密碼子取代ATG，其中取代密碼子不是TTG。
4.權(quán)利要求3的重組載體，其中所述突是用編碼選自Ala，Gly和Pro的氨基酸的密碼子取代ATG。
5.權(quán)利要求4的重組載體，其中所述氨基酸是Ala。
6.權(quán)利要求4的重組載體，其中所述氨基酸是Gly。
7.權(quán)利要求4的重組載體，其中所述氨基酸是Pro。
8.權(quán)利要求3的重組載體，其中所述氨基酸是Arg。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的重組載體，其中所述重組載體是一種病毒載體。
10.權(quán)利要求9的重組病毒載體，其中所述載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，和腺伴隨病毒載體。
11.包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組載體的組合物。
12.權(quán)利要求11的組合物，進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的載體。
13.一種包含用另一個(gè)密碼子對(duì)LIP的起始密碼子ATG進(jìn)行的取代的變體LAP多肽，其中取代密碼子不是TTG。
14.權(quán)利要求13的變體LAp多肽，其中取代密碼子不是翻譯終止密碼子。
15.一種編碼權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)的變體LAP多肽的分離的核酸。
16.包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組載體的宿主細(xì)胞。
17.包含權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)的變體多肽的宿主細(xì)胞。
18.包含權(quán)利要求15的分離的核酸的宿主細(xì)胞。
19.包含權(quán)利要求9-10中任一項(xiàng)的重組病毒載體的病毒顆粒。
20.一種寡核苷酸，包含鄰近C/EBPβ基因的核苷酸序列中的LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的起始密碼子ATG的長(zhǎng)度為約10到約100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列，其中所述寡核苷酸或其互補(bǔ)序列能夠減少LIP表達(dá)。
21.權(quán)利要求20的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸序列的長(zhǎng)度為約10到80個(gè)核苷酸。
22.權(quán)利要求20-21中任一項(xiàng)的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸序列的長(zhǎng)度為約15到約50個(gè)核苷酸。
23.包含權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的寡核苷酸的組合物。
24.權(quán)利要求23的組合物，進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的賦形劑。
25.一種改進(jìn)細(xì)胞中LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)表達(dá)水平的比例的方法，包括使細(xì)胞與權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組載體，或權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)的變體LAP多肽，或權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的寡核苷酸在適宜條件下接觸。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
27.權(quán)利要求25-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞。
28.一種篩選一種試劑是否可調(diào)節(jié)從C/EBPβ基因表達(dá)的LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的表達(dá)水平的比例的方法，該方法包括使C/EBPβ基因與所述試劑接觸并測(cè)定LAP表達(dá)與LIP表達(dá)的比例的步驟。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述試劑是一種低分子量化合物。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述試劑是一種天然存在物質(zhì)的提取物。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述比例是通過(guò)RNA印跡法測(cè)定的。
32.權(quán)利要求28的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含所述C/EBPβ基因。
33.權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包括鑒定可提高細(xì)胞中LAP的表達(dá)水平的試劑。
34.權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包括鑒定可降低細(xì)胞中LIP的表達(dá)水平的試劑。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所述比例是通過(guò)PCR法測(cè)定的。
36.一種治療和/或改善個(gè)體中相關(guān)于LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)與LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的表達(dá)水平的異常比例的疾病和/或狀況的癥狀的方法，該方法包括給予個(gè)體權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組載體，或權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的寡核苷酸，或權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)的LAP多肽。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述個(gè)體患有癌癥。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述癌癥是乳腺癌或肝癌。
39.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組載體在制造治療和/或改善癌癥癥狀的藥物中的用途。
40.權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)的變體LAP多肽在制造治療和/或改善癌癥癥狀的藥物中的用途。
41.權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的寡核苷酸在制造治療和/或改善癌癥癥狀的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠降低，減少或抑制LIP(轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白)的轉(zhuǎn)錄/翻譯，且在某些例子中，不會(huì)影響LAP(轉(zhuǎn)錄激活因子)的轉(zhuǎn)錄/翻譯的重組基因載體和核酸構(gòu)建物。這種載體和構(gòu)建可用于增加細(xì)胞中LAP與LIP活性的比例，和治療和/或改善相關(guān)于LAP與LIP的比例的疾病或狀況的癥狀的方法。本發(fā)明還提供了篩選能夠改進(jìn)細(xì)胞或個(gè)體中LAP與LIP活性比例的試劑的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1451752SQ03130790
公開(kāi)日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2003年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月12日
發(fā)明者平井洋平 申請(qǐng)人:住友電氣工業(yè)株式會(huì)社