專利名稱：一組末端酰胺化的抗菌肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組末端酰胺化的抗菌肽、其制備方法及在制備治療細(xì)菌、真菌感染的藥物中的應(yīng)用，該抗菌肽對細(xì)菌和真菌及其耐藥菌株有顯著的殺菌活性。
背景技術(shù)：
抗菌肽是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60個氨基酸組成，分子量在2000-7000D左右。隨著醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，抗菌肽的研究越來越成為生物技術(shù)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的熱門課題。至今為止，在許多動物(尤其是昆蟲)、植物、微生物和人體上己發(fā)現(xiàn)了超過200多種抗菌肽，這類短肽不僅對細(xì)菌、真菌有廣譜的殺菌作用，而且對病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有攻擊作用。臨床試驗也表明，在機體感染病菌或可能導(dǎo)致病菌感染的情況下，抗菌肽能快速殺滅已侵入的病菌，并且能阻止病菌的繼續(xù)侵染。隨著對抗菌肽一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，己有許多研究者對這些抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能進行研究，發(fā)現(xiàn)在模擬膜的疏水環(huán)境下，分子中的α “螺旋度與其殺菌活性密切相關(guān)。另外研究結(jié)果表明抗菌肽是通過破壞膜的完整性使得細(xì)菌細(xì)胞膜滲漏而殺死細(xì)菌(Nakajima Y. et al.，J. Biol. Chem, 262 :1665_1669 ；ZasloffM. Nature, 2002,415 389-395)。因此有人試圖通過增加分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)或提高多肽中含正電荷氨基酸的比 歹舌個生白勺$月太(Broth W. B. et al. ,Antimicrobial Agents Chemotherapy, 2001,45 1894-1895 ；Hong S. Y. etal.，P印tides，2001，22 :1669_1674)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種由SEQ. ID NO 1所示式I的氨基酸序列組成的抗菌肽Rl-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-NH2(SE Q. ID NO 1)式 I其中Rl 是 Leu, lie, Val, Phe, Lys-Leu, Lys-Ile, Lys-Val, Lys-Phe, Arg-Leu, Arg-Ile, Arg-Val, Arg-Phe 或不存在；R2 :Val, Val-Lys, Val-Arg, Val-Lys-Lys, Val-Lys-Arg, Val-Lys-Lys-Leu, Val-Lys_Lys_11e , Val-Lys-Lys-Val, Val-Lys-Lys-Phe , Val-Lys-Arg-Leu, Val-Lys-Arg-Ile, Val-Lys-Arg-Val, Val-Lys-Arg-Phe, Val-Arg-Lys, Val-Arg-Arg, Val-Arg-Lys-Leu, Val-Arg_Lys_11e , Val-Arg-Lys-Val, Val-Arg-Lys-Phe , Val-Arg-Arg-Leu, Val-Arg-Arg-11 e, Val-Arg-Arg-Val, Val-Arg-Arg-Phe 或不存在。所述抗菌肽的進一步特征在于，該抗菌肽的結(jié)構(gòu)為以下4種Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 2)，
Rl-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO :3)，Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-NH2 (SEQ. ID NO 4)，Rl-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-NH2(SE Q. ID NO 5)之一，Rl 是 Leu, lie, Val, Phe, Lys-Leu, Lys-Ile, Lys-Val, Lys-Phe, Arg-Leu, Arg-Ile, Arg-Val 或 Arg-Phe ；R2 Mi Val, Val-Lys, Val-Arg, Val-Lys-Lys, Val-Lys-Arg, Val-Lys-Lys-Leu, Val-Lys-Lys-IIe , Val-Lys-Lys-Val, Val-Lys-Lys-Phe, Val-Lys-Arg-Leu, Val-Lys-Arg-Ile, Val-Lys-Arg-Val, Val-Lys-Arg-Phe ；Val-Arg-Lys, Val-Arg-Arg, Val-Arg-Lys-Leu, Val-Arg-Lys-Ile, Val-Arg-Lys-Val, Val-Arg-Lys-Phe, Val-Arg-Arg-Leu, Val-Arg-Arg-Ile, Val-Arg-Arg-Val 或 Val-Arg-Arg-Phe0所述抗菌肽的進一步特征在于，該抗菌肽的結(jié)構(gòu)為Rl-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2,其中 Rl 是 Leu，lie, Val，Phe，Lys-Leu，Lys-IIe，Lys-Val，Lys-Phe，Arg-Leu，Arg-IIe，Arg-Val 或 Arg-Phe0所述抗菌肽的進一步特征在于，該抗菌肽的結(jié)構(gòu)為Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-NH2, 其中 R2 是 Val， Val-Lys, Val-Arg, Val-Lys-Lys, Val-Lys-Arg, Val-Lys-Lys-Leu, Val-Lys_Lys_I1e， Val-Lys-Lys-Val, Val-Lys-Lys-Phe, Val-Lys-Arg-Leu, Val-Lys-Arg-IIe, Val-Lys-Arg-Val, Val-Lys-Arg-Phe ；Val-Arg-Lys, Val-Arg-Arg, Val-Arg-Lys-Leu, Val-Arg-Lys-I1e, Val-Arg-Lys-Val, Val-Arg-Lys-Phe， Val-Arg-Arg-Leu, Va 1 -Arg-Arg-11 e, Val-Arg-Arg-Val 或 Val-Arg-Arg-Phe0所述抗菌肽的進一步特征在于，該抗菌肽的結(jié)構(gòu)為Rl-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-N H2, 其中 Rl 是 Leu, lie, Val, Phe, Lys-Leu, Lys-Ile, Lys-Val, Lys-Phe, Arg-Leu, Arg-Ile, Arg-Val 或 Arg-Phe ；R2 是 Val，Val-Lys, Val-Arg, Val-Lys-Lys, Val-Lys-Arg, Val-Lys-Lys-Leu, Val-Lys_Lys_I1e， Val-Lys-Lys-Val, Val-Lys-Lys-Phe, Val-Lys-Arg-Leu, Val-Lys-Arg-IIe, Val-Lys-Arg-Val, Val-Lys-Arg-Phe ；Val-Arg-Lys, VaI-Arg-Arg,Val-Arg-Lys-Leu,Val-Arg-Lys-I le,Val-Arg-Lys-Val,Val-Arg-Lys-Phe, Val-Arg-Arg-Leu, Va 1 -Arg-Arg-11 e, Val-Arg-Arg-Val 或 Val-Arg-Arg-Phe0所述抗菌肽的進一步特征在于，具有如下序列Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-Val-NH2 (S EQ. ID NO 6)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-N H2(SEQ. ID NO 7)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-L yS-NH2 (SEQ. ID NO 8)
Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-NH2 (SEQ. ID NO 9)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 10)Lys-Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (S EQ. ID NO 11)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-N H2 (SEQ. ID NO 12) Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-Val-Arg-NH2 (S EQ. ID NO 13)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Lys-N H2 (SEQ. ID NO 14)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-N H2 (SEQ. ID NO 15)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-I Ie-NH2 (SEQ. ID NO 16)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-V al-NH2 (SEQ. ID NO 17)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-P he-NH2 (SEQ. ID NO 18)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-I Ie-NH2 (SEQ. ID NO 19)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-L eu-NH2(SEQ. ID NO 20)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-V al-NH2(SEQ. ID NO 21)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-P he-NH2(SEQ. ID NO 22)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-I Ie-NH2(SEQ. ID NO 23)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-L eu-NH2 (SEQ. ID NO 24)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-V al-NH2(SEQ. ID NO 25)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-P he-NH2(SEQ. ID NO 26)Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-L ys-NH2(SEQ. ID NO 27)Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-LyS-NH2(SEQ. ID NO 28)Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-L yS-NH2(SEQ. ID NO 29)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-A rg-NH2(SEQ. ID NO 30)Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-A rg-NH2(SEQ. ID NO 31)Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-A rg-NH2(SEQ. ID NO 32)Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-A rg-NH2(SEQ. ID NO 33)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-A rg-NH2 (SEQ. ID NO 34)Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-A rg-NH2(SEQ. ID NO 35)Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-A rg-NH2(SEQ. ID NO 36)Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-A rg-NH2(SEQ. ID NO 37)IIe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 38)Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 39)Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 40)Arg-Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (S EQ. ID NO 41)Arg-Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (S EQ. ID NO 42) Arg-Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (S EQ. ID NO 43)Arg-Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (S EQ. ID NO 44)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-NH2 (S EQ. ID NO 45)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-N H2 (SEQ. ID NO 46)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-L eu-NH2 (SEQ. ID NO 47)。
所述抗菌肽的進一步特征在于，一種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1-6 的任一項所述的抗菌肽或者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。所述抗菌肽的進一步特征在于，制備用于治療細(xì)菌或真菌感染藥物中的用途。本發(fā)明提供了此類抗菌肽的制備方法，本發(fā)明采用微波促進Fmoc/tBu正交保護固相合成策略高效快速地合成得到此類抗菌肽的肽鏈。采用微波促進Fmoc/tBu正交保護固相合成策略，于固相載體上先合成得到載有第一個Fmoc保護氨基酸的樹脂，茚三酮法檢測為陰性后脫去Fmoc保護基得到載有第一個氨基酸殘基的樹脂；再進入下一個偶聯(lián)循環(huán)，按照相應(yīng)的肽序用不同的保護氨基酸重復(fù)偶聯(lián)和脫保護的步驟，依次延長所需的氨基酸序列，合成得到載有相應(yīng)多肽的樹脂，最后用切割劑將多肽從樹脂上切割下來得到多肽粗品。粗品經(jīng)純化，凍干得多肽純品。本發(fā)明提供的一組抗菌肽，其制備方法可以是固相化學(xué)法，也可以將抗菌肽的編碼基因克隆到載體上，然后在宿主細(xì)胞中表達后獲得。其中表達載體可以是質(zhì)?；虿《局械囊环N，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞、包括酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等。制備的抗菌肽可通過質(zhì)譜鑒定。利用96孔板法檢測多肽的殺菌活性(In Yup Park etc ；FEBS Letters ； 437(1998)258-262)以預(yù)先合成的天然抗菌肽Pexiganan以及抗生素氨芐西林和慶大霉素為對照，進行殺菌活性檢測。結(jié)果表明本發(fā)明合成抗菌肽的殺菌活性強于所述兩種天然抗菌肽的殺菌活性?？咕脑诟咝⒕耐瑫r也有可能作用于高等有機體包括人體細(xì)胞，因為抗菌肽的作用方式都是在細(xì)胞膜上穿孔使得細(xì)胞發(fā)生滲漏死亡。所以把抗菌肽能否使紅細(xì)胞發(fā)生滲漏作為其是否有毒性的一個標(biāo)準(zhǔn)，如果抗菌肽能使紅細(xì)胞中的血紅蛋白發(fā)生滲漏，就可以通過檢測0D490。值確定毒性的大小。因此本發(fā)明還檢測了合成抗菌肽對人體紅細(xì)胞的溶血活性，實驗表明，抗菌肽溶血率值很低，證實本發(fā)明合成抗菌肽的溶血毒性極小。
具體實施例方式在本說明書全文中采用以下縮寫DIEA :N, N' - 二異丙基乙胺；DMF 二甲基甲酰胺；DCM 二氯甲烷；Fmoc :N_9_芴甲氧羰基；DIC =N, N，-二異丙基碳二亞胺；DMAP :4_ 二甲氨基吡啶；HB TU 苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBT 羥基-苯并三氮唑；HPLC 高效液相色譜；ESI-MS 電噴霧質(zhì)譜；Gly 甘氨酸；Ser 絲氨酸；Ala 丙氨酸； Thr 蘇氨酸；Val 纈氨酸；Ile 異亮氨酸；Leu 亮氨酸；Tyr 酪氨酸；Phe 苯丙氨酸；His 組氨酸；Pro 脯氨酸；Asp 天門冬氨酸；Met 蛋氨酸；Glu 谷氨酸；Trp 色氨酸；Lys 賴氨酸；Arg 精氨酸。Asn 天冬酰胺；Gln 谷氨酰胺。本發(fā)明是通過下列實施例來進行說明的，但這些實施例不做任何限制本發(fā)明的解釋。實施例1Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 2)的微波促進固相合成(1)樹脂的溶脹
稱取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg (取代量 0. 4mmol/g)，經(jīng) 7mL DCM 溶脹 30min，抽濾去DCM，再用IOmLNMP溶脹30min，最后分別用NMP，DCM, NMP 7mL沖洗干凈。(2)微波促進Fmoc保護基的脫除將溶脹好的樹脂放入反應(yīng)器中，加入7mL含0. IM HOBT的25 %哌啶/NMP (V/V)溶液，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)lmin，微波功率為15W，反應(yīng)溫度控制在50°C以內(nèi)，使用空氣壓縮機壓縮空氣冷卻，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液；再加入7mL含0. IM HOBT的25%哌啶/NMP (V/V)溶液在微波反應(yīng)器中再反應(yīng)4min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈。得到脫去初始連接的Fmoc保護基的樹脂。(3)微波促進 Fmoc-Val-Rink amide-MBHA Resin 的合成將Fmoc-Ser (tBu)-OH (0. 04mmol)，HBTU (0. 04mmol) , HOBT (0. 04mmol)禾口 DIPEA(0. 08mmol)溶于IOmL NMP中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng) 7min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹脂3次。(4)偶合效率的檢測用茚三酮法或者溴酚蘭法定性檢測樹脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進入下一個偶合循環(huán)。茚三酮法取少量樹脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5%茚三酮乙醇、 KCN吡啶溶液(2ml 0. OOlM KCN稀釋于98ml吡啶中)、80%苯酚乙醇溶液各2滴，于100°C 加熱5分鐘，如果樹脂顯藍色即為陽性。溴酚蘭法取少量樹脂顆粒用二甲酰乙酰胺洗滌，放入透明小瓶中加入3滴的溴酚藍二甲基乙酰胺溶液，常溫下振搖3分鐘，如果樹脂顯藍色即為陽性。(5)肽鏈的延長按照SEQ. ID NO 2的序列，重復(fù)上述脫保護和偶合的步驟依次連接上相應(yīng)的氨基酸，偶合微波促進反應(yīng)時間5 20min不等。得到連有肽鏈的樹脂。(6)樹脂上多肽的裂解將上述得到的連有肽鏈的樹脂放入反應(yīng)瓶中，各加入裂解劑Reagent K (TFA/苯甲硫醚 / 水 / 苯酚/EDT，82. 5 5 5 5 2. 5，V/V) 10mL，先在 0°C下振搖 30min，再在常溫下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌三次，合并濾液。將濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標(biāo)多肽的粗品。最終得到SEQ. ID NO 2粗品 72. 5mg，收率為 93. 6%0使用HPLC測定純度。色譜條件為C18反相柱(150mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相A 0. 1 % TFA/水(V/V)，流動相B 0. 1% TFA/乙腈(V/V)；流動相梯度流動相B 10 % 80 %， 20min ；流速為lmL/min ；柱溫為40°C ；檢測波長為214nm。使用制備液相色譜純化，色譜條件為:C18 反相柱(320mmX28mm, 5 μ m)；流動相 A 0. 1% TFA/ 水(V/V)，流動相 B 0. 1% TFA/ 乙腈(V/V)；流動相梯度流動相B 40% 90%，20min ；流速為6mL/min檢測波長為214nm。 收集的溶液凍干得純品。理論相對分子質(zhì)量為1937. 26。ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ 1839. 19，實驗測定值[M+H]+ =1839. 2實施例2
Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-NH2 (SEQ. ID NO 6) ；ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2051· 34，[M+3H]3+:684· 45，[M+4H]4+ 513. 585，實驗測定值[M+H]+ 2051. 3，[M+3H]3+ 684. 4，[M+4H]4+ 513. 6實施例3Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-N H2 (SEQ. ID NO 7) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2179· 81，[M+2H]2+:1090· 4，[M+3H]3+ 727. 27，實驗測定值[M+H]+ 2179. 9，[Μ+2Η]2+ 1090. 5，[Μ+3Η]3+ 727. 3實施例4Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys -Lys-NH2 (SEQ. IDNO 8) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ 2307. 98，[M+2H]2+ 1154. 49， [M+3H]3+ 769. 99，實驗測定值[M+H]+ 2308. 1，[M+2H]2+ 1154. 6，[M+3H]3+ 770. 0實施例5Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-NH2 (SEQ. ID NO 9) ；ESI-MSm/z 理論計算值[M+H]+ 1938. 47，[M+2H]2+ 969. 74，[M+3H]3+ 646. 82，實驗測定值[M+H]+ 1938. 6，[Μ+2Η]2+ :969· 8，[Μ+3Η]3+ :646· 9實施例6Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 10) ；ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ :1952. 5，[M+2H]2+ -.976. 75，[M+3H]3+ :651. 5，實驗測定值[M+H]+ :1952. 6，[M+2H]2+ -.976. 8，[M+3H]3+ :651. 5實施例7Lys-Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 ( SEQ. ID NO 11) ；ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+:2080· 67，[M+2H]2+:1040· 84，[M+3H]3+ 694. 22，實驗測定值[M+H]+ 2080. 8，[M+2H]2+ 1040. 9，[M+3H]3+ 694. 3實施例8Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Ar g-NH2 (SEQ. ID NO 12) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ -.2222. 83，[M+2H]2+ 1111. 92， [M+3H]3+ :741. 61，實驗測定值[M+H]+ -.2222. 9，[M+2H]2+ :1112· 0，[M+3H]3+ :741· 7實施例9Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-NH2 ( SEQ. ID NO 13) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H] + 2094. 66，[M+2H]2+:1047· 83，[M+3H]3+ 698. 89，實驗測定值[M+H]+ 2094. 8，[M+2H]2+ 1047. 9，[M+3H]3+ 698. 9實施例10Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Ly S-NH2 (SEQ. ID NO 14) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ -.2222. 83，[M+2H]2+ 1111. 92， [M+3H]3+ 741. 61，實驗測定值[M+H]+ -.2222. 9，[M+2H]2+ 1112. 0，[M+3H]3+ 741. 7實施例11Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Ar g-NH2 (SEQ. ID NO 15) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ :2250· 85，[M+2H]2+ :1125· 92， [Μ+3Η]3+ :750. 95，實驗測定值[M+Hr+ 2251. 0，[M+2H]2+ 1126. 0，[M+3H]3+ 751. 0
實施例12Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Ile-NH2 (SEQ. ID NO 16) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2307· 98，[M+2H]2+ 1154. 49, [M+3H]3+ 769. 99，實驗測定值[M+H]+ 2308. 1，[M+2H]2+ 1154. 6，[M+3H]3+ 770. 0實施例13Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys -Val-NH2 (SEQ. IDNO 17) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2293· 95，[M+2H]2+:1147· 48， [M+3H]3+ 765. 32，實驗測定值[M+H]+ -.2294. 1，[M+2H]2+ 1147. 6，[M+3H]3+ 765. 4實施例14Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-P he-NH2 (SEQ. IDNO 18) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ -.2342, [M+2H]2+ 1171. 5，[M+3H]3+ 781. 33，實驗測定值[M+H]+:2342· 1，[M+2H]2+:1171· 6，[M+3H]3+:781· 4實施例15Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Ar g-I Ie-NH2 (SEQ. ID NO 19) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ :2336，[M+2H]2+ 1168. 5， [M+3H]3+ 779. 33，實驗測定值[M+H]+ 2336. 1，[M+2H]2+ 1168. 6，[M+3H]3+ 779. 4實施例16Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-L eu-NH2 (SEQ. IDNO 20) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ :2336，[M+2H]2+ 1168. 5，[M+3H]3+ 779. 33，實驗測定值[M+H]+ 2336. 1，[Μ+2Η]2+ :1168· 6，[Μ+3Η]3+ :779· 4實施例17Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg -Val-NH2 (SEQ. IDNO 21) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2321· 97，[Μ+2Η]2+:1161· 48， [Μ+3Η]3+ 774. 66，實驗測定值[Μ+Η]+ -.2322. 1，[Μ+2Η]2+ :1161. 6，[Μ+3Η]3+ -.774. 7實施例18Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg -Phe-NH2 (SEQ. IDNO 22) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+:2370· 01，[Μ+2Η]2+:1185· 51， [Μ+3Η]3+ :790. 67，實驗測定值[Μ+Η]+ :2370. 1，[Μ+2Η]2+ :1185. 6，[Μ+3Η]3+ -.790. 7實施例1923) ；ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+ :2364· 01，[Μ+2Η]2+ :1182· 5，[Μ+3Η]3+ 788. 67，實驗測定值[Μ+Η]+ 2364. 1，[Μ+2Η]2+ :1182· 6，[Μ+3Η]3+ :788· 7實施例20Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg -Leu-NH2 (SEQ. IDNO 24) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ 2364. 01，[M+2H]2+ 1182. 5， [M+3H]3+ 788. 67，實驗測定值[M+H]+ 2364. 1，[M+2H]2+ 1182. 6，[M+3H]3+ 788. 7實施例21 Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg -Val-NH2 (SEQ. IDNO 25) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2349· 98，[M+2H]2+ 1175. 49, [M+3H]3+ 783. 99，實驗測定值[M+H]+ 2350. 1，[M+2H]2+ 1175. 6，[M+3H]3+ 784. 0
實施例22Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg -Phe-NH2 (SEQ. IDNO 26) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ 2398. 03，[M+2H]2+ 1199. 51， [M+3H]3+ 800. 01，實驗測定值[M+H]+ 2398. 1，[M+2H]2+ 1199. 6，[M+3H]3+ 800. 1實施例23Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-NH2 (SEQ. ID NO 27) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2307· 98，[M+2H]2+ 1154. 49, [M+3H]3+ 769. 99，實驗測定值[M+H]+ 2308. 1，[M+2H]2+ 1154. 6，[M+3H]3+ 770. 0實施例24Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys -Lys-NH2 (SEQ. IDNO 28) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2293· 95，[M+2H]2+:1147· 48， [M+3H]3+ 765. 32，實驗測定值[M+H]+ -.2294. 1，[M+2H]2+ 1147. 62，[M+3H]3+ 765. 4實施例25Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-L ys-NH2 (SEQ. IDNO 29) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ -.2342, [M+2H]2+ 1171. 5，[M+3H]3+ 781. 33，實驗測定值[M+H]+:2342· 1，[M+2H]2+:1171· 6，[M+3H]3+:781· 4實施例26 Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-A rg-NH2 (SEQ. IDNO 30) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ :2336，[M+2H]2+ 1168. 5，[M+3H]3+ 779. 33，實驗測定值[M+H]+ 2336. 1，[Μ+2Η]2+ :1168· 6，[Μ+3Η]3+ :779· 4實施例27Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Ly S-Arg-NH2 (SEQ. ID NO 31) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ :2336，[M+2H]2+ :1168· 5， [M+3H]3+ 779. 33，實驗測定值[M+H]+ 2336. 1，[M+2H]2+ 1168. 6，[M+3H]3+ 779. 42實施例28Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys -Arg-NH2 (SEQ. IDNO 32) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2321· 97，[M+2H]2+:1161· 48， [M+3H]3+ 774. 66，實驗測定值[M+H]+ -.2322. 1，[M+2H]2+ 1161. 6，[M+3H]3+ 774. 7實施例29Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys -Arg-NH2 (SEQ. IDNO 33) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2370· 01，[M+2H]2+:1185· 51， [M+3H]3+ 790. 67，實驗測定值[M+H]+ 2370. 1，[M+2H]2+ 1185. 6，[M+3H]3+ 790. 7實施例30Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg -Arg-NH2 (SEQ. IDNO 34) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ 2364. 01，[M+2H]2+ 1182. 5， [M+3H]3+ 788. 67，實驗測定值[M+H]+ 2364. 1，[M+2H]2+ 1182. 6，[M+3H]3+ 788. 7實施例31Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg -Arg-NH2 (SEQ. ID NO 35) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ 2364. 01，[M+2H]2+ 1182. 5，[M+3H]3+ 788. 67，實驗測定值[M+H]+ 2364. 1，[M+2H]2+ 1182. 6，[M+3H]3+ 788. 7實施例32Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg -Arg-NH2 (SEQ. IDNO 36) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ 2349. 98，[M+2H]2+ 1175. 49， [M+3H]3+ 783. 99，實驗測定值[M+H]+ 2350. 1，[M+2H]2+ 1175. 6，[M+3H]3+ 784. 0實施例33Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg -Arg-NH2 (SEQ. IDNO 37) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ 2398. 03，[M+2H]2+ 1199. 51， [M+3H]3+ 800. 01，實驗測定值[M+H]+ 2398. 1，[M+2H]2+ 1199. 6，[M+3H]3+ 800. 1實施例34IIe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 38) ；ESI-MSm/z 理論計算值[M+H]+ 1952. 5，[M+2H]2+ 976. 75，[M+3H]3+ 651. 5，實驗測定值[M+H]+ 1952. 6，[Μ+2Η]2+ :976· 8，[Μ+3Η]3+ :651· 5實施例35Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 39) ；ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ :1938. 47，[M+2H]2+ :969. 74，[M+3H]3+ :646. 82，實驗測定值[M+H]+ :1938. 6，[M+2H]2+ :969. 8，[M+3H]3+ :646. 9實施例36Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 40) ；ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ :1986. 51，[M+2H]2+ :993. 76，[M+3H]3+ :662. 84，實驗測定值[M+H]+ :1986. 6，[M+2H]2+ :993. 9，[M+3H]3+ :662. 9實施例37Arg-IIe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 ( SEQ. ID NO 41) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+:2108· 69，[M+2H]2+:1054· 84，[M+3H]3+ 703. 56，實驗測定值[M+H]+ :2108. 8，[M+2H]2+ 1054. 9，[M+3H]3+ 703. 6實施例38Arg-Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 ( SEQ. ID NO 42) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H] + 2094. 66，[M+2H]2+:1047· 83，[Μ+3Η]3+ 698. 89，實驗測定值[Μ+Η]+ 2094. 8，[Μ+2Η]2+ 1047. 9，[Μ+3Η]3+ 698. 9實施例39Arg-Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 ( SEQ. ID NO 43) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+:2142· 7，[Μ+2Η]2+:1071· 85，[Μ+3Η]3+ 714. 9，實驗測定值[Μ+Η]+ :2142. 8, [Μ+2Η]2+:1071· 9，[Μ+3Η]3+:714· 9實施例40Arg-Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 ( SEQ. ID NO 44) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+:2108· 69，[M+2H]2+:1054· 84，[M+3H]3+ 703. 56，實驗測定值[M+H]+ :2108. 8，[M+2H]2+ 1054. 9，[M+3H]3+ 703. 6實施例41 Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-LyS-NH2 (SEQ. ID NO 45) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2066· 65，[M+2H]2+:1033· 82，[M+3H]3+ 689. 55，實驗測定值[M+H]+ 2066. 8，[Μ+2Η]2+ 1033. 9，[Μ+3Η]3+ 689. 6實施例42Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Ly S-NH2 (SEQ. ID NO 46) ； ESI-MS m/z 理論計算值[M+H]+ 2194. 82，[M+2H]2+ 1097. 91， [M+3H]3+ 732. 27，實驗測定值[M+H]+ 2194. 9，[M+2H]2+ 1098. 0，[M+3H]3+ 732. 3實施例43Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys -Leu-NH2 (SEQ. IDNO 47) ； ESI-MS m/z 理論計算值[Μ+Η]+:2307· 98，[M+2H]2+ 1154. 49, [M+3H]3+ 769. 99，實驗測定值[M+H]+ 2308. 1，[M+2H]2+ 1154. 6，[M+3H]3+ 770. 0實施例44合成抗菌肽的殺菌活性檢測以下實施例中所使用的各種菌株購于中國生物制品檢定所。采用96孔板法對合成抗菌肽的殺菌活性進行檢測，并用氨芐西林、慶大霉素和固相化學(xué)法合成的抗菌肽pexiganan作為對照，以評價本發(fā)明中作為舉例的十條抗菌肽的殺菌活性。按以下步驟進行測定抗菌肽的殺菌活性菌種復(fù)蘇，接種斜面37°C培養(yǎng)過夜，接菌于普通LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，稀釋菌液使菌濃度為104-105CFU/ml，按每孔IOOul菌液接種于96孔板中，將多肽以一定比例稀釋后，每孔中加入10ul，將96孔板置于37°C培養(yǎng)過夜，酶標(biāo)儀檢測OD620值(In Yup Park etc ；FEBS Letters ；437 (1998) 258-262)。檢測結(jié)果見表 1。含有抗菌肽的細(xì)菌的生長濃度(OD62tl)與不加抗菌肽的細(xì)菌的生長濃度的比值大于90%時的抗菌肽濃度即為最小抑菌濃度(最小抑菌濃度(MIC)定義為顯著抑制細(xì)菌生長的最低的濃度)。表1實施例1 43中抗菌肽對不同細(xì)菌的抗菌活性最小抑菌濃度(MIC)的比較
權(quán)利要求
1.一種由SEQ. ID NO 1所示式I的氨基酸序列組成的抗菌肽Rl-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-NH2 (SEQ. ID NO 1) 式I 其中Rl 是 Leu, lie, Val, Phe, Lys-Leu, Lys-Ile, Lys-Val, Lys-Phe, Arg-Leu, Arg-Ile, Arg-Val, Arg-Phe 或不存在；R2 :Val, Val-Lys, Val-Arg, Val-Lys-Lys, Val-Lys~Arg, Val-Lys-Lys-Leu, Val-Lys-Lys-IIe , Val-Lys-Lys-Val, Val-Lys-Lys-Phe, Val-Lys-Arg-Leu, Val-Lys-Arg-Ile, Val-Lys-Arg-Val, Val-Lys-Arg-Phe, Val-Arg-Lys, Val-Arg-Arg, Val-Arg-Lys-Leu, Val-Arg-Lys-Ile, Val-Arg-Lys-Val, Val-Arg-Lys-Phe, Val-Arg-Arg-Leu, Val-Arg-Arg-Ile, Val-Arg-Arg-Val, Val-Arg-Arg-Phe 或不存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的抗菌肽，其特征在于，該抗菌肽的結(jié)構(gòu)為以下4種 Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 2), Rl-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 3)，Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-NH2 (SEQ. ID NO 4)，Rl-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-NH2 (SEQ. ID NO 5)之一，Rl 是 Leu，lie, Val, Phe, Lys-Leu, Lys-Ile, Lys-Val, Lys-Phe, Arg-Leu, Arg-IIe, Arg-Val 或 Arg-Phe ；R2 是 Val，Val-Lys, Val-Arg, Val-Lys-Lys, Val-Lys-Arg, Val-Lys-Lys-Leu, Val-Lys-Lys-Ile, Val-Lys-Lys-Val, Val-Lys-Lys-Phe, Val-Lys-Arg-Leu, Val-Lys-Arg-IIe, Val-Lys-Arg-Val, Val-Lys-Arg-Phe ；Val-Arg-Lys, Val-Arg-Arg, Val-Arg-Lys-Leu, Val-Arg-Lys-I1e, Val-Arg-Lys-Val, Val-Arg-Lys-Phe, Val-Arg-Arg-Leu, Va 1 -Arg-Arg-11 e, Val-Arg-Arg-Val 或 Val-Arg-Arg-Phe0
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的抗菌肽結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗菌肽的結(jié)構(gòu)為 Rl-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2,其中 Rl 是Leu, lie, Val, Phe, Lys-Leu, Lys-Ile, Lys-Val, Lys-Phe, Arg-Leu, Arg-IIe, Arg-Val 或 Arg-Phe。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的抗菌肽，其特征在于，該抗菌肽的結(jié)構(gòu)為Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-NH2,其中 R2 是 Val, Val-Lys, Val-Arg, Val-Lys-Lys, Val-Lys-Arg, Val-Lys-Lys-Leu, Val-Lys-Lys-Ile, Val-Lys-Lys-Val, Val-Lys-Lys-Phe, Val-Lys-Arg-Leu, Val-Lys-Arg-I1e, Val-Lys-Arg-Val, Val-Lys-Arg-Phe ；Val-Arg-Lys, Val-Arg-Arg, Val-Arg-Lys-Leu, Val-Arg-Lys-I1e, Val-Arg-Lys-Val, Val-Arg-Lys-Phe， Val-Arg-Arg-Leu, Val-Arg-Arg-IIe，Va 1 -Arg-Arg-Va 1 或 Val-Arg-Arg-Phe0
5.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的抗菌肽結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗菌肽的結(jié)構(gòu)為RI-VaI-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-R2-NH2, 其中 Rl 是 Leu, lie, Val, Phe, Lys-Leu, Lys-Ile, Lys-Val, Lys-Phe, Arg-Leu, Arg-IIe, Arg-Val 或 Arg-Phe ；R2 是 Val, Val-Lys, Val-Arg, Val-Lys-Lys, Val-Lys-Arg, Val-Lys-Lys-Leu, Val-Lys-Lys-Ile, Val-Lys-Lys-Val, Val-Lys-Lys-Phe, Val-Lys-Arg-Leu, Val-Lys-Arg-Ile, Va 1-Lys-Arg-Va 1，VaI-Lys-Arg-Phe ；Val-Arg-Lys, Val-Arg-Arg, Val-Arg-Lys-Leu, Val-Arg-Lys-IIe, Val-Arg-Lys-Val, Val-Arg-Lys-Phe， Val-Arg-Arg-Leu, Va 1 -Arg-Arg-11 e, Val-Arg-Arg-Val 或 Val-Arg-Arg-Phe0
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的抗菌肽，其特征在于，具有如下序列 Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-Val-NH2 (SEQ. ID NO 6)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-LyS-NH2 (S EQ. ID NO 7)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-N H2 (SEQ. ID NO 8)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-Val-NH2 (SEQ. ID NO 9)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 10)Lys-Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 11)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-NH2 (S EQ. ID NO 12)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-NH2 (SEQ. ID NO 13)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Lys-NH2 (S EQ. ID NO 14)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-NH2 (S EQ. ID NO 15)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Ile-N H2 (SEQ. ID NO 16)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Val-N H2 (SEQ. ID NO 17)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Phe-N H2 (SEQ. ID NO 18)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-Ile-N H2 (SEQ. ID NO 19)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-Leu-N H2(SEQ. ID NO 20)val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-Val-NH2(SEQ. ID NO 21)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-Phe-N H2(SEQ. ID NO 22)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-Ile-N H2(SEQ. ID NO 23)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-Leu-N H2 (SEQ. ID NO 24)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-Val-N H2(SEQ. ID NO 25)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-Phe-N H2(SEQ. ID NO 26)Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-N H2(SEQ. ID NO 27)Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-N H2(SEQ. ID NO 28)Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-N H2(SEQ. ID NO 29)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-N H2(SEQ. ID NO 30)Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-N H2(SEQ. ID NO 31)Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-N H2(SEQ. ID NO 32)Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Arg-N H2(SEQ. ID NO 33)Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-N H2 (SEQ. ID NO 34)Ile-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-N H2(SEQ. ID NO 35)Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-N H2(SEQ. ID NO 36)Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Arg-Arg-N H2(SEQ. ID NO 37)IIe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 38)Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 39)Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 40)Arg-IIe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 41)Arg-Val-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 42)Arg-Phe-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 43)Arg-Leu-Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-LyS-Ser-NH2 (SEQ. ID NO 44)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-NH2 (SEQ. ID NO 45)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-NH2 (S EQ. ID NO 46)Val-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-N H2 (SEQ. ID NO 47)。
7.—種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1-6的任一項所述的抗菌肽或者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
8.權(quán)利要求1-6的任一項的抗菌肽在制備用于治療細(xì)菌或真菌感染藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一組末端酰胺化的新抗菌肽，這些抗菌肽對耐藥細(xì)菌菌株具有強的殺菌活性。本發(fā)明合成抗菌肽的制備方法可以是固相化學(xué)法或是通過基因工程表達獲得。本發(fā)明合成抗菌肽可以用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌感染引起的疾病的藥物。
文檔編號A61P31/04GK102329375SQ201110291548
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者孫李丹, 楊寶衛(wèi), 鄧欣, 錢海, 陳巍, 韓京, 黃文龍 申請人:中國藥科大學(xué)