專利名稱：血斑標本采集和處理方法及其采集卡干血斑dna提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體是一種血斑標本采集和處理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法。
背景技術：
目前，用于地中海貧血基因診斷的DNA是從抗凝全血中提取的。該方法用檸檬酸鈉或EDTA抗凝管保存靜脈血，需在_20°C冰箱中低溫保存，不耐運輸，送檢不方便。因些，急需一種方便運輸?shù)臉颖静杉椒ê透咛崛÷实腄NA提取方法
發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供一種血斑標本采集和處理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的
一種血斑標本采集和處理方法，包括以下步驟
(1)米血
Φ ·嬰兒采血
()用熱毛巾溫浴采血部位不超過41°C，3 5分鐘；
(i i)酒精消毒，用無菌紗布墊擦干；
(iii)針刺，無菌紗布墊擦去第一滴血；
(Iv )用血樣標本采集卡蘸取單個血滴，讓血滴充分浸潤采血圈，形成血斑；至少采集3個米血圈；
上述嬰兒米血，6周 4月或小于5kg的嬰兒米用腳后跟米血法；4 10月或5 IOkg的嬰兒采用腳大拇指采血；大于10月或大于IOkg的嬰兒采用手指采血；
②·采用靜脈采血，用檸檬酸鈉或EDTA抗凝管靜脈血，采集的抗凝全血用移液器移取
75 80ul全血，對準血樣標本采集卡采血圈中心緩慢將血液滴加在采集卡上，形成血斑，避免氣泡產生；至少采集3個血圈；
上述靜脈采血用于嬰兒之外的人群；
(2)采集卡血斑處理
血樣采集完畢后，將制成的采集卡在干燥桌面放置3 4小時風干，形成干血斑，不要放在太陽下晾曬或用任何人工方法(如烘干機)加速干燥；(3)采集卡干血斑的保存
采集卡風干后，將每張采集卡分裝入封口袋中，并在封口袋中放入干燥劑，輕輕將封口袋的空氣擠壓出去在封口，遵循一袋一卡的原則，以避免交叉污染；
(4)采集卡干血斑的遞送
準確填寫樣本信息卡后，將采集卡和信息卡一同放入大信封，采用常溫運輸。上述采集卡干血斑DNA提取方法，包括以下步驟
(1)將采集卡上的2個或以上血斑用打孔器打孔3*3mm(或將圓形的血斑剪下后，剪為約3*3_的樣品)，置于I. 5ml離心管中；
(2)加入300 400ul的TissueLysis Buffer,加入20ul蛋白酶K，震蕩混勻；
(3)56°C溫浴lh，期間顛倒混勻3 5次；
(4)取200ul上清液轉入新的I.5ml離心管中，加入200ul的溶液L，70°C溫浴IOmin,期間顛倒2 3次；
(5)加入200ul4°C的無水乙醇，室溫放置5min ；
(6)將液體轉入帶硅膠柱的2ml離心管中，IOOOOrpm離心lmin，倒掉離心管的收集管中的廢液，將硅膠柱放入收集管中；
(7)在硅膠柱中加入500ul溶液Wl，10000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將硅膠柱放入收集管中；
(8)在娃膠柱中加入500ul溶液W2,IOOOOrpm離心lmin,倒掉收集管中的廢液；
(9)重復步聚8；
(10)將硅膠柱放入收集管中，12000rpm空管離心3min，倒掉收集管中的廢液；
(11)將硅膠柱放入新的I.5ml離心管中，開蓋靜置I 2min，往硅膠柱中心加入60ul的TE洗脫液，靜置2 5min, 12000rpm離心2min,棄柱得DNA ；
所述溶液L為含有10% GuSCN、10% Tris的水溶液，溶液Wl為含有10%GuSCN、P/oEDTA、25%無水乙醇的水溶液，溶液W2為含有75%無水乙醇的水溶液，TE洗脫液為含有l(wèi)%Tris、1%EDTA的水溶液，以上溶液除無水乙醇是體積濃度外，其他的皆為質量百分比濃度。本發(fā)明采用過柱法的提取DNA，操作簡單，快速省時，獲得的DNA純度高。血斑標本可在常溫保存，耐運輸，方便送檢，可代替抗凝全血作為基因診斷的DNA提取標本。


圖I為本發(fā)明所采用的血樣標本采集卡。圖2為采集卡干血斑。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。實施例
一、對22個成年人進行本發(fā)明的血斑標本采集和處理 I.靜脈采血用檸檬酸鈉抗凝管靜脈血，采集的抗凝全血用移液器移取80ul全血，對準如圖I所示的血樣標本采集卡采血圈中心緩慢將血液滴加在采集卡上，形成血斑，避免氣泡產生；采集3個血圈；2.采集卡血斑處理
血樣采集完畢后，將制成的采集卡在干燥桌面放置4小時風干，形成如圖2所示的干血
斑；
3.采集卡干血斑的保存
采集卡風干后，將每張采集卡分裝入封口袋中，并在封口袋中放入干燥劑，輕輕將封口袋的空氣擠壓出去在封口，遵循一袋一卡的原則，以避免交叉污染；
4.采集卡干血斑的遞送
準確填寫樣本信息卡后，將采集卡和信息卡一同放入大信封，采用常溫運輸。 上述采集卡干血斑DNA提取
1.將采集卡上的2個圓形的血斑剪下后，剪為3*3mm的樣品，置于I. 5ml離心管中(每處理完一個樣本后，剪刀均需用75%乙醇擦拭，晾干后在酒精燈上燒熱)；
2.加入300ul的Tissue Lysis Buffer,加入20ul蛋白酶K,震蕩混勻；
3.56°C溫浴lh，期間顛倒混勻4次；
4.取200ul上清液轉入新的I.5ml離心管中，加入200ul的溶液L，70°C溫浴lOmin，期間顛倒3次；
5.加入200ul4°C的無水乙醇，室溫放置5min ；
6.將液體轉入帶硅膠柱的2ml離心管中，IOOOOrpm離心lmin，倒掉離心管的收集管中的廢液，將硅膠柱放入收集管中；
7.在硅膠柱中加入500ul溶液Wl (使用前先檢查是否加入無水乙醇)，IOOOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將硅膠柱放入收集管中；
8.在硅膠柱中加入500ul溶液W2 (使用前先檢查是否加入無水乙醇)，IOOOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液；
9.重復步聚8；
10.將硅膠柱放入收集管中，12000rpm空管離心3min，倒掉收集管中的廢液；
11.將硅膠柱放入新的I.5ml離心管中，開蓋靜置2min，往硅膠柱中心加入60ul的TE洗脫液(55°C預熱)，靜置5min，12000rpm離心2min，棄柱得血斑DNA。二、對上述22個成年人進行傳統(tǒng)的抗凝全血DNA采集和處理
使用傳統(tǒng)檢測手段對同樣的22個成年人進行抗凝全血DNA的采集和處理，得到抗凝全血 DNA。三、樣品檢測
將上述提取的血斑DNA和抗凝全血DNA采用潮州凱普生物化學有限公司生產的α -和β-地中海貧血基因檢測試劑盒進行地貧基因檢測。22例抗凝全血DNA和血斑DNA的地貧基因檢測結果如下
權利要求
1.一種血斑標本采集和處理方法，包括以下步驟 (1)米血 X .嬰兒采血 G )用熱毛巾溫浴采血部位不超過41°C，3 5分鐘； Gi)酒精消毒，用無菌紗布墊擦干； Gii)針刺,無菌紗布墊擦去第一滴血； (IV )用血樣標本采集卡蘸取單個血滴，讓血滴充分浸潤采血圈，形成血斑；至少采集3個米血圈； 上述嬰兒米血，6周 4月或小于5kg的嬰兒米用腳后跟米血法；4 10月或5 IOkg的嬰兒采用腳大拇指采血；大于10月或大于IOkg的嬰兒采用手指采血； I ·采用靜脈采血，用檸檬酸鈉或EDTA抗凝管靜脈血，采集的抗凝全血用移液器移取75 80ul全血，對準血樣標本采集卡采血圈中心緩慢將血液滴加在采集卡上，形成血斑，避免氣泡產生；至少采集3個血圈； 上述靜脈采血用于嬰兒之外的人群； (2)采集卡血斑處理 血樣采集完畢后，將制成的采集卡在干燥桌面放置3 4小時風干，形成干血斑； (3)采集卡干血斑的保存 采集卡風干后，將每張采集卡分裝入封口袋中，并在封口袋中放入干燥劑，輕輕將封口袋的空氣擠壓出去在封口，遵循一袋一卡的原則，以避免交叉污染； (4)采集卡干血斑的遞送 準確填寫樣本信息卡后，將采集卡和信息卡一同放入大信封，采用常溫運輸。
2.權利要求I所述采集卡干血斑DNA提取方法，包括以下步驟 (1)將采集卡上的2個或以上血斑用打孔器打孔3*3mm，或將圓形的血斑剪下后，剪為3*3_的樣品，置于I. 5ml離心管中； (2)加入300 400ul的TissueLysis Buffer,加入20ul蛋白酶K，震蕩混勻； (3)56°C溫浴lh，期間顛倒混勻3 5次； (4)取200ul上清液轉入新的I.5ml離心管中，加入200ul的溶液L，70°C溫浴IOmin,期間顛倒2 3次； (5)加入200ul4°C的無水乙醇，室溫放置5min ； (6)將液體轉入帶硅膠柱的2ml離心管中，IOOOOrpm離心lmin，倒掉離心管的收集管中的廢液，將硅膠柱放入收集管中； (7)在硅膠柱中加入500ul溶液Wl，10000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將硅膠柱放入收集管中； (8)在娃膠柱中加入500ul溶液W2,IOOOOrpm離心lmin,倒掉收集管中的廢液； (9)重復步聚8； (10)將硅膠柱放入收集管中，12000rpm空管離心3min，倒掉收集管中的廢液； (11)將硅膠柱放入新的I.5ml離心管中，開蓋靜置I 2min，往硅膠柱中心加入60ul的TE洗脫液,靜置2 5min, 12000rpm離心2min,棄柱得DNA ； 所述溶 液L為含有10% GuSCN、10% Tris的水溶液，溶液Wl為含有10%GuSCN、P/oEDTA、25%無水乙醇的水溶液，溶液W2為含有75%無水乙醇的水溶液，TE洗脫液為含有l(wèi)%Tris、1%EDTA的水溶液，以上溶液除無水乙醇是體積濃度外，其他的皆為質量百分比濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血斑標本采集和處理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法。所述血斑標本采集和處理方法，包括以下步驟(1)采血；(2)采集卡血斑處理；(3)采集卡干血斑的保存；(4)采集卡干血斑的遞送。本發(fā)明的血斑標本可在常溫保存，耐運輸，方便送檢，可代替抗凝全血作為基因診斷的DNA提取標本。
文檔編號A61B5/153GK102866038SQ20121036429
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權日2012年9月26日
發(fā)明者蘇彬峰, 邱美蘭, 盧敏 申請人:廣東凱普生物科技股份有限公司