專利名稱：馬錢子總堿的提取分離純化方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種中藥有效成分的提取方法，特別是涉及一種從中藥馬錢子中提取馬錢子總生物堿的方法，屬于藥物技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
馬錢子又名番木鱉，始載于《本早綱目》，味苦，寒性，有大毒，歸肝，脾經(jīng)，功效為通絡止痛，散結(jié)消腫。臨床上用與風濕頑痹，麻木癱瘓，跌打損傷，癰疽腫痛，小兒麻痹后遺癥， 類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾?。坏哂袆《镜奶匦試乐赜绊懫湓谂R床上的應用，所謂“毒藥猛劑善起沉疴”。馬錢子的治療量為O. 3-0. 6g，過量易出現(xiàn)中毒，如何合理安全使用馬錢子，成為近年的研究熱點之一。
研究表明，總生物堿是馬錢子中最主要的有效部位，包括馬錢子堿、士的寧、番木鱉次堿、馬錢子新堿、番木鱉甙、依卡精等，其中馬錢子中的主要生物堿成分中馬錢子堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，而其中士的寧是中樞神經(jīng)興奮劑，主要在臨床上治療面癱，神經(jīng)麻痹等， 同時其為主要的毒性成分，基本無抗炎、鎮(zhèn)痛作用；文獻報道小鼠灌服士的寧、馬錢子堿、馬錢子仁的LD50分別為3. 27mg/kg、233mg/kg和234. 5mg/kg ;小鼠腹腔注射上述藥物的LD50 分別為1. 53mg/kg、69. 77mg/kg和76mg/kg，其口服中毒劑量成人為5 10mg，口服致死量為30mg。表明士的寧是馬錢子中的主要毒性成分。有文獻報道，分別用士的寧和馬錢子堿給小鼠灌胃，兩者的LD50分別為3. 27mg/kg和233mg/kg，由此可以得知士的寧的安全性很低，如果能除去馬錢子總生物堿中的部分士的寧，則既能降低其毒性，又能保留其原有的抗炎鎮(zhèn)痛的藥理活性，提高臨床用藥的安全性。因此，現(xiàn)代研究中需要一種能降低士的寧含量的馬錢子總堿的提取方法。有文獻報道，分別用士的寧和馬錢子堿給小鼠灌胃，兩者的LD50 分別為3. 27mg/kg和233mg/kg，由此可以得知士的寧的安全性很低，如果能除去馬錢子總堿中的部分士的寧，則既能降低其毒性，又能保留其原有的抗炎鎮(zhèn)痛的藥理活性，提高臨床用藥的安全性。因此，現(xiàn)代研究中需要一種能降低士的寧含量的馬錢子 總堿的提取方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種安全、成本低、收率高、能有效降低士的寧含量的馬錢子總生物堿的提取方法。主要是利用馬錢子堿在多種溶劑中的溶解度大于士的寧，因此可以通過不同的溶劑提取達到馬錢子堿和士的寧分離的效果。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
方法一
(I)酸水提取-有機溶劑萃取法取馬錢子粉碎成粗粉，加酸液提取，合并提取液， 過濾，濾液調(diào)整PH值至10-11，堿化后的溶液用有機溶劑萃取，合并萃取液，減壓回收有機溶劑，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿粗品；
(2)溶劑-分步萃取法步驟⑴中得到的馬錢子總堿粗品加溶劑溶解提取，提取液過濾，濾液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓回收乙酸乙酯，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿。
方法二
酸水提取-有機溶劑萃取法可以用醇提取-有機溶劑萃取法代替。
醇提取-有機溶劑萃取法步驟為取馬錢子粉碎成粗粉，加乙醇回流提取，合并提取液，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，調(diào)整pH值至10-11,堿化后的溶液用有機溶劑萃取，合并萃取液，減壓回收有機溶劑，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿粗品。
純化方法仍采用溶劑-分步萃取法，操作同方法一。
方法三
酸水提取-有機溶劑萃取法還可以用堿化-有機溶劑萃取法代替。
堿化-有機溶劑萃取法步驟為取馬錢子粉碎成粗粉，加堿液提取，合并提取液， 過濾，濾液用有機溶劑萃取，合并萃取液，減壓回收有機溶劑，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿粗品；其中，堿液是指氫氧化I丐溶液、氫氧化鈉溶液、碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、稀氨水溶液中的一種。
純化方法仍采用溶劑-分步萃取法，操作同方法一。
方法四
溶劑-分步萃取法可以用硫酸鹽-鹽酸鹽分步結(jié)晶法代替。
硫酸鹽-鹽酸鹽分步結(jié)晶法步驟為步驟(I)中得到的馬錢子總堿粗品加硫酸鹽， 使士的寧形成結(jié)晶，濾除部分士的寧的母液加入鹽酸形成馬錢子堿鹽酸鹽，通過重結(jié)晶法純化馬錢子堿。
馬錢子總堿粗品由上述方法一或方法二或方法三記載的方法得到。
基于上述工藝過程，發(fā)明人又進行了進一步的研究，細化各步驟的參數(shù)，從而篩選出最優(yōu)方案，具體內(nèi)容如下
酸水提取-有機溶劑萃取法中的酸液是指O. 5mol/L-5mol/L的鹽酸、O. 5mol/ L-2mol/L的硫酸、O. 5mol/L-5mol/L鹽酸乙醇溶液、O. 5mol/L_2mol/L硫酸乙醇溶液中的一種；酸液用量為5-12倍量，加熱回流次數(shù)為1-3次，每次O. 5-2小時；提取方法為滲漉法， 回流法、攪拌法中的一種，優(yōu)選的方案是酸液是指lmol/L的鹽酸；加熱回流法；酸液用量10 倍量；加熱回流2次，每次1. 5小時。
溶劑-分步萃取法中提取馬錢子總堿粗品的溶劑是指甲醇、水、堿水、乙酸乙酯溶液中的一種；優(yōu)選堿水溶液，堿水溶液可用氫氧化鈣溶液、氫氧化鈉溶液、碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、稀氨水溶液中的一種或幾種；優(yōu)選氨水溶液。萃取溶劑為乙酸乙酯，其乙酸乙酯的用量為O. 5-4倍量；萃取次數(shù)為2-6次。優(yōu)選I倍量，萃取4次。
醇提取-有機溶劑萃取法步驟為取馬錢子粉碎成粗粉，加乙醇(50% -95%乙醇)提取(回流、滲漉、攪拌)，合并提取液，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，調(diào)整PH值至 10-11，堿化后的溶液用有機溶劑(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)萃取，合并萃取液，減壓回收有機溶劑(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿粗品。
其中優(yōu)選50 %乙醇，萃取溶劑優(yōu)選乙酸乙酯。
酸水提取-有機溶劑萃取法還可以用堿化-有機溶劑萃取法代替。
堿化-有機溶劑萃取法步驟為取馬錢子粉碎成粗粉，加堿液提取，合并提取液， 過濾，濾液用有機溶劑(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)萃取，合并萃取液，減壓回收有機溶劑(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿粗品。
其中，堿液是指氫氧化鈣溶液、氫氧化鈉溶液、碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、稀氨水溶液中的一種。優(yōu)選氨水提取。萃取溶劑優(yōu)選氯仿或乙酸乙酯。
溶劑-分步萃取法可以用硫酸鹽-鹽酸鹽分步結(jié)晶法代替。
硫酸鹽-鹽酸鹽分步結(jié)晶法步驟為步驟(I)中得到的馬錢子總堿粗品加硫酸鹽， 使士的寧形成結(jié)晶，濾除部分士的寧的母液加入鹽酸形成馬錢子堿鹽酸鹽，通過重結(jié)晶法純化得到馬錢子堿。
本發(fā)明中的有機溶劑是指甲苯、氯仿、乙酸乙酯中的一種。
通過以上方法制得的馬錢子總堿中的馬錢子堿含量≥ 80%。
本發(fā)明藥物的活性成分可以加入藥劑學上可接受的輔料按常規(guī)工藝制備成所需制劑。如可以制成常用的片劑(分散片、泡騰片、口腔崩解片、含片、咀嚼片、泡騰片)、膠囊劑(硬膠囊、軟膠囊劑)、顆粒劑、丸劑(滴丸劑)、散劑等固體制劑形式的口服藥物，也可以制成糖漿、口服液等液體制劑形式的口服藥物；還可以制成膏劑、凝膠劑、軟膏劑、巴布劑、 貼膏劑、搽劑、洗劑、涂膜劑等外用制劑形式的外用藥物。因此，該藥物組合物中除有效成分外，還可以含有藥學上可以接受的輔料。
這里所述的輔料，可以根據(jù)不同的制劑有所不同，如在片劑、膠囊劑、顆粒劑等固體制劑中常用的稀釋劑、崩解劑、賦形劑、粘合劑、潤滑劑、表面活性劑、填充劑等；在糖衆(zhòng)、 口服液等液體制劑形式中常用的表面活性劑、稀釋劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、矯味劑、增稠劑、助流劑等；在凝膠劑、軟膏劑等外用制劑形式中常用的藥用油性基質(zhì)、水性基質(zhì)、防腐劑、抗氧劑、保濕劑、透皮吸收促進劑、表面活性劑等。
其常用輔料如淀粉、乳糖、糊精、糖粉、微晶纖維素、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣、改良淀粉、山梨醇、聚乙烯吡咯酮、重質(zhì)碳酸鎂、羧甲基纖維素鈉、 羥丙甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲淀粉鈉、羥丙基纖維素、聚維酮K30、白陶土、預膠化淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、甜葉菊苷、甜菜堿、阿司帕坦、甘草甜素、糖精鈉、枸櫞酸、碳酸氫鈉、碳酸鈉、卡拉膠、瓊脂、明膠、海藻酸鈉、黃原膠、瓜耳豆膠、西黃耆膠、 阿拉伯膠、槐豆膠、刺梧桐膠、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)型聚丙烯酸鈉、聚乙烯醇、卡波姆、山梨酸、山梨酸鉀、羥苯乙酯、苯甲醇、尼泊金、硫柳汞、二甲基亞砜、氮酮、 三乙醇胺、氫氧化鈉、甘油、丙二醇、BHT、BHA、十二烷基硫酸鈉、吐溫類、司盤類等。
馬錢子為馬錢科植物馬錢(Strychnos nux-vomica L.)的干燥成熟種子經(jīng)炮制所得制馬錢子，具有通絡止痛、消腫散結(jié)的功效，臨床用于治療風濕頑痹、麻木癱瘓、跌打損傷和癰疽腫痛等疾病。馬錢子主要活性成分為總生物堿，其中生物堿成分中馬錢子堿具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛的藥理活性，是馬錢子的主要有效成分，而另一含量較高的士的寧是強毒性成分，同時為無效成分，所以在提取過程中需要提高馬錢子堿的含量，降低士的寧的含量。
本發(fā)明人在前期的有效部位藥效篩選試驗(弗氏完全佐劑致大鼠足跖急性腫脹及痛反應指數(shù)的試驗)的結(jié)果表明，實驗發(fā)現(xiàn)A組(馬錢子堿含量90% ) QSmg.kg—lB組 (馬錢子堿士的寧=2 1) (25mg. kg-1)和陽性藥(扶他林)均可抑制由FCA引起的急性足跖腫脹和屈關(guān)節(jié)疼痛，而C組(馬錢子堿士的寧=1 2) (25mg. kg-1)山組(士的寧含量90% ) (25mg. kg-1)對其效果都不明顯，說明士的寧是抗炎、鎮(zhèn)痛的無效成分和主要毒性成分。該部分詳細試驗記載在同日提交的另一份文件中，在此不再重復描述。
所以本發(fā)明在前期研究的基礎上，進一步提純馬錢子堿的含量，降低士的寧的含量。對其工藝進行了進一步優(yōu)化。
馬錢子總堿中馬錢子堿、士的寧在水中溶解度小，但易溶于醇、氯仿等，提取時一般采用溶劑法。對不同種類不同濃度的酸水和不同濃度的酸乙醇溶液進行溶劑的篩選，選擇出馬錢子堿轉(zhuǎn)移率和含量較高而士的寧轉(zhuǎn)移率較低的溶劑，從而確定提取溶劑。然后再用優(yōu)選出的溶劑，對滲漉法、回流法和攪拌法進行比較，確定合適的提取方法。在確定了提取溶劑和提取方法的基礎上，為了全面考察影響提取效果的因素，對提取方法中影響提取效果的主要因素進行考察，對提取的條件進行優(yōu)選，確定提取工藝的最佳條件。
實驗例1:提取工藝技術(shù)條件的研究
本實驗中，對提取溶劑、提取方法、提取時間、提取次數(shù)、提取體積的考察方法與同日提交的馬錢子堿的提取工藝考核方法相同，實驗結(jié)果相同?？蓞⒖剂硪环菸募?br> 實驗例2 :馬錢子總堿分離純化工藝條件研究
2.1提取液pH值對馬錢子總堿的影響
取粉碎后的馬錢子100g，加入10倍量I %鹽酸加熱回流2次，每次1. 5小時將藥液過濾，濾液分四份加氫氧化鈉調(diào)至不同的PH，濃縮干燥。測定其中馬錢子堿和士的寧的量。實驗結(jié)果見表I。
表I提取液pH對馬錢子總堿的分離情況
權(quán)利要求
1.馬錢子總堿的提取分離純化方法，其特征在于，步驟如下 (1)酸水提取-有機溶劑萃取法取馬錢子粉碎成粗粉，加酸液提取，合并提取液，過濾，濾液調(diào)整PH值至10-11，堿化后的溶液用有機溶劑萃取，合并萃取液，減壓回收有機溶齊U，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿粗品； (2)溶劑-分步萃取法步驟(I)中得到的馬錢子總堿粗品加溶劑溶解提取，提取液過濾，濾液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓回收乙酸乙酯，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離純化方法，其特征在于，步驟(I)中的酸液是指0.5mol/L-5mol/L 的鹽酸、0. 5mol/L_2mol/L 的硫酸、0. 5mol/L_5mol/L 鹽酸乙醇溶液、0.5mol/L_2mol/L硫酸乙醇溶液中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取分離純化方法，其特征在于，步驟(I)中的酸液是指Imo I/L的鹽酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離純化方法，其特征在于，步驟(I)中酸液用量為5-12倍量，加熱回流次數(shù)為1-3次，每次0. 5-2小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離純化方法，其特征在于，步驟(2)中提取馬錢子總堿粗品的溶劑是指甲醇、水、堿水溶液中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取分離純化方法，其特征在于，步驟(2)中提取馬錢子總堿粗品的溶劑是指堿水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離純化方法，其特征在于，步驟(2)中乙酸乙酯的用量為0. 5-3倍量；萃取次數(shù)為2-6次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離純化方法，其特征在于，步驟(I)的酸水提取-有機溶劑萃取法用醇提取-有機溶劑萃取法代替，具體是指取馬錢子粉碎成粗粉，加乙醇回流提取，合并提取液，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，調(diào)整PH值至10-11，堿化后的溶液用有機溶劑萃取，合并萃取液，減壓回收有機溶劑，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿粗品。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離純化方法，其特征在于，步驟(I)的酸水提取-有機溶劑萃取法用堿化-有機溶劑萃取法代替，具體是指取馬錢子粉碎成粗粉，加堿液提取，合并提取液，過濾，濾液用有機溶劑萃取，合并萃取液，減壓回收有機溶劑，并繼續(xù)減壓干燥，粉碎，即得馬錢子總堿粗品。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或8或9所述的提取分離純化方法，其特征在于，所述的有機溶劑是指甲苯、氯仿、乙酸乙酯中的一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的提取分離純化方法，其特征在于，所述的堿液是指氫氧化鈣溶液、氫氧化鈉溶液、碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、稀氨水溶液中的一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離純化方法，其特征在于，步驟(2)的溶劑-分步萃取法用硫酸鹽-鹽酸鹽分步結(jié)晶法代替，具體是指步驟⑴中得到的馬錢子總堿粗品加硫酸鹽，使士的寧形成結(jié)晶，濾除部分士的寧的母液加入鹽酸形成馬錢子堿鹽酸鹽，通過重結(jié)晶法純化得到馬錢子堿。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或8或9或12所述的提取分離純化方法，其特征在于，制得的馬錢子總堿中的馬錢子堿含量> 80*%。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或8或9或12所述的一種馬錢子總堿的提取分離純化方法，其特征在于，將所制得的馬錢子總堿加入適量輔料按常規(guī)工藝制成藥劑學上可接受的制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種馬錢子總堿的提取分離純化方法，屬于藥品的技術(shù)領域。該方法包括將馬錢子粗粉經(jīng)酸水提取-有機溶劑萃取法或堿化-有機溶劑萃取法或醇提取-有機溶劑萃取法處理后得到其粗品，粗品進一步經(jīng)過溶劑-分步萃取法或硫酸鹽-鹽酸鹽分步結(jié)晶法等純化步驟去除士的寧，制備得到純度在80％以上的馬錢子堿。
文檔編號A61P29/00GK103027947SQ201110297528
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者張保獻, 胡杰 申請人:北京因科瑞斯醫(yī)藥科技有限公司