專利名稱：殼聚糖-dna納米顆粒復合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖-DNA納米顆粒復合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
基因治療一直是人們關(guān)注的熱點之一，它可以通過填補缺失的基因、替換有缺陷的基因或沉默不需要的基因來治療遺傳性和非遺傳性疾病。但裸露的基因在體內(nèi)很容易被核酸酶降解，轉(zhuǎn)染效率很低。因此，發(fā)展安全高效的基因載體成為基因治療成功的先決條件。近年來，主要的基因載體系統(tǒng)分為病毒和非病毒載體兩種。雖然病毒載體在體內(nèi)有較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在可能的毒性、易引起免疫反應及產(chǎn)生炎癥的風險。非病毒載體包括脂質(zhì)體和陽離子復合物，脂質(zhì)體目前雖被廣泛應用于細胞轉(zhuǎn)染，但其包封率低、貯存穩(wěn)定性差、容易被血液中的成分清除，使其在生物整體的應用受到限制。因此，人們將目光轉(zhuǎn)向了非病毒載體中富含陽離子且骨架包含氨基的聚合物。其中，殼聚糖作為一種聚陽離子基因載體正受到人們的廣泛關(guān)注。甲殼素在脫乙酰度達50%-100%之間時，成為殼聚糖(Chitosan，CS)，系統(tǒng)名 (1，4) -2-氨基-2-脫氧-β -D-葡聚糖，可溶于酸性水溶液形成自身帶正電荷的大分子。殼聚糖大分子能夠與DNA相互作用形成殼聚糖-DNA納米顆粒復合物(CNPs-DNA)，且此復合物對DNA有一定的保護作用，使其免受核酸酶的降解，并具有黏膜附著劑的性質(zhì)。除此之外， 殼聚糖納米顆粒DNA復合物的粒徑大小適于細胞吞噬，且表面帶有適量正電荷可與帶負電的細胞膜產(chǎn)生靜電吸附作用，進而打開上皮細胞之間的緊密連接使大分子物質(zhì)通過細胞間隙運輸，對細胞無毒副作用。因而可作為良好的基因載體用于基因轉(zhuǎn)染。影響殼聚糖納米粒體外基因轉(zhuǎn)染效率的因素很多，主要包括殼聚糖的分子量、脫乙酰度、殼聚糖氨基與DNA磷酸基比例(N/P)、DNA濃度、pH值、離子強度、溫度等。因此，研究殼聚糖的各種影響因素對轉(zhuǎn)染效率的影響，探尋最有效的CNPs-DNA，對提高目標基因的轉(zhuǎn)染效率有重要意義，為基因治療奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種殼聚糖-DNA納米顆粒復合物(CNPs-DNA)。本發(fā)明的目的之二在于提供該復合物的制備方法。為達以上目的，本發(fā)明通過下述方案實現(xiàn)
一種殼聚糖-DNA納米顆粒復合物，其特征在于該復合物為殼聚糖上的氨基質(zhì)子化為一NH3+,與熒光蛋白質(zhì)粒DNA上的磷酸基以靜電作用結(jié)合而形成，其中N:P的摩爾比為 4-8。上述的熒光蛋白質(zhì)粒為綠色熒光蛋白質(zhì)粒。上述的綠色熒光蛋白質(zhì)粒為pEGFP_Cl。一種制備上述的殼聚糖-DNA納米顆粒復合物的方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.將經(jīng)純化的殼聚糖溶于10%醋酸中配制成濃度為2g/L的溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6，得殼聚糖原液，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除菌；
b.將步驟a所得殼聚糖原液稀釋成0.2-0. 8g/L，調(diào)pH為6_8，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除菌備用；
c.將熒光蛋白質(zhì)粒DNA用濃度為25-75mmol/L的Na2SO4水溶液稀釋為100—400 μ g/ ml的溶液；
d將步驟b和步驟c所得的殼聚糖稀釋液和質(zhì)粒溶液置于55°C保溫30 min ； e.按M孔板每孔以IOul殼聚糖溶液與10ul、400ug/ml質(zhì)粒溶液的比例混合30 s，室溫下靜置1小時。本發(fā)明的復合物能保護DNA免受核酸酶的降解，并與帶負電的細胞膜產(chǎn)生靜電吸附作用，促進細胞的內(nèi)吞作用，實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)染。該復合物細胞毒性低，因而可作為良好的基因載體用于基因轉(zhuǎn)染。實現(xiàn)了目標基因的轉(zhuǎn)染，為基因治療的應用提供了有力的條件。


圖1為本發(fā)明的凝膠阻滯實驗，其中A，A’為裸質(zhì)粒DNA;B，B’為CS ;C_I分別為 N/P=10、8、6、4、2、l、l/2 的 CNPs-DNA。圖2為本發(fā)明的DNaseI消化后，其中A，A’為裸質(zhì)粒DNA ；B, B’為CS ；C-I分別為 N/P=10、8、6、4、2、l、l/2 的 CNPs-DNA。圖3為倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況，其中A為裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；B為 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染組；C、D、E 分別為 N/P=8、6、4 的 CNPs-DNA 轉(zhuǎn)染組)。圖4為本發(fā)明的流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，其中A為裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；B為 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染組；C、D、E 分別為 N/P=8、6、4 的 CNPs-DNA 轉(zhuǎn)染組。圖5為CNPs-DNA的細胞毒性實驗。
具體實施方案下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例一殼聚糖納米顆粒DNA復合物CNPs-DNA的制備
(1)稱20mg純化后的殼聚糖溶于10%的醋酸，可微微加熱(勿超42°C )，待殼聚糖顆粒完全溶解后，用IOM的NaOH溶液粗調(diào)pH為5. 5，得0. 2% (w/v)的殼聚糖原液，經(jīng)0. 22 μ m 濾膜過濾除菌。(2)取適量的殼聚糖原液稀釋成濃度為0. 08% (w/v)的殼聚糖溶液，用IOM的NaOH 溶液調(diào)PH為6. 5-7. 0之間，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除菌備用。(3)質(zhì)粒DNA (pEGFP-Cl)用蒸餾水稀釋為400 μ g/ml的DNA溶液，加入1/10體積 500mM的Na2SO4溶液(使其終濃度為50mM)。(4)將殼聚糖溶液與質(zhì)粒溶液分別置于55°C恒溫孵育器上保溫30 min。等體積混合后，迅速于渦旋器上混合30s，室溫下靜置lh，即得殼聚糖納米顆粒DNA復合物CNPs-DNA， 可用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗。實施例二 對CNPs-DNA物理性質(zhì)的測定
41.凝膠電泳阻滯和DNase I的消化實驗請具體說明凝膠電泳阻滯消化實驗的具體步
驟，
(1)凝膠電泳阻滯實驗=CNPs-DNA經(jīng)1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳60V，40min，由于殼聚糖包裹DNA后掩蓋了 DNA本身的負電荷，使其無法在電泳中從負極向正極移動而被阻滯于上樣孔中。(2) DNase I 的消化實驗=CNPs-DNA 中加入 0. 5U DNase I (lU/ul)，37°C溫浴 lh, 經(jīng)1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳60V，40min,被包裹的DNA滯留在上樣孔中，未被包裹的DNA被 DNase I消化降解。以此來判斷殼聚糖納米顆粒對DNA的保護能力。參見圖1和圖2，說明 CNPs-DNA能夠有效保護DNA免受DNase I的消化。的粒徑和kta電位測定使用ktasizerfOOOHS粒度及電位分析儀測定其平均粒徑和kta電位。參見表1
表1 不同N/P的CS-DNA粒徑及kta分布情況
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖-DNA納米顆粒復合物，其特征在于該復合物為殼聚糖上的氨基質(zhì)子化為一NH3+,與熒光蛋白質(zhì)粒DNA上的磷酸基以靜電作用結(jié)合而形成，其中N:P的摩爾比為 4-8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-DNA納米顆粒復合物，其特征在于所述的熒光蛋白質(zhì)粒為綠色熒光蛋白質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-DNA納米顆粒復合物，其特征在于所述的綠色熒光蛋白質(zhì)粒為pEGFP-Cl。
4.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-DNA納米顆粒復合物的方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.將經(jīng)純化的殼聚糖溶于10%醋酸中配制成濃度為2g/L的溶液，調(diào)節(jié)pH為5-6，得殼聚糖原液，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除菌；b.將步驟a所得殼聚糖原液稀釋成0.2-0. 8g/L，調(diào)pH為6_8，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除菌備用；c.將熒光蛋白質(zhì)粒DNA用濃度為25-75mmol/L的Na2SO4水溶液稀釋為100—400 μ g/ ml的溶液；d將步驟b和步驟c所得的殼聚糖稀釋液和質(zhì)粒溶液置于55°C保溫30 min ；e.按M孔板每孔以IOul殼聚糖溶液與10ul、400ug/ml質(zhì)粒溶液的比例混合30 s，室溫下靜置1小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖-DNA納米顆粒復合物及其制備方法。該復合物為該復合物為殼聚糖上的氨基質(zhì)子化為—NH3+，與銀光蛋白質(zhì)粒DNA上的磷酸基以靜電作用結(jié)合而形成，其中N:P的摩爾比為4-8。本發(fā)明的復合物能保護DNA免受核酸酶的降解，并與帶負電的細胞膜產(chǎn)生靜電吸附作用，促進細胞的內(nèi)吞作用，實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)染。該復合物細胞毒性低，因而可作為良好的基因載體用于基因轉(zhuǎn)染。實現(xiàn)了目標基因的轉(zhuǎn)染，為基因治療的應用提供了有力的條件。
文檔編號A61K47/36GK102205134SQ20111013065
公開日2011年10月5日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者劉芳, 文鐵橋, 霍一楠 申請人:上海大學