專利名稱：磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase，SOD)，別名肝蛋白、奧谷蛋白， 簡(jiǎn)稱S0D，是1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到的。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動(dòng)物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)；現(xiàn)已證實(shí)，由氧自由基引發(fā)的疾病多達(dá)60多種。它可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原自由基造成的對(duì)細(xì)胞傷害。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運(yùn)動(dòng)都會(huì)造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化機(jī)制中SOD的地位越來(lái)越重要。SOD具有非均化分解作為富于反應(yīng)性的游離活性氧的超氧化物陰離子自由基的活性。期待可以將SOD用于抗風(fēng)濕藥物、自身免疫性疾病治療劑、心肌梗塞治療劑和臟器移植，以及用于除去腦梗塞后的抗血栓劑使用時(shí)在生物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，還可期待將其用于各種炎癥等(參照日本專利第3070980號(hào)公報(bào))。SOD體內(nèi)半衰期短(6-lOmin)、穩(wěn)定性差、難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、與細(xì)胞膜親和力小、具有抗原性，直接藥用存在療效差和有一定的副作用等缺點(diǎn)，有必要進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造。 對(duì)SOD的分子修飾包括化學(xué)修飾和酶切修飾。目前國(guó)內(nèi)外大多采用一些不具有免疫原性的水溶性高分子化合物對(duì)SOD的非活性部位的氨基酸殘基進(jìn)行修飾。修飾劑主要有聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、聚蔗糖、藥用淀粉、粘多糖等。經(jīng)過(guò)不同手段修飾后的SOD保留了天然酶活性，而且顯示出體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)、穩(wěn)定性增加、抗原性降低、毒副作用降低等優(yōu)點(diǎn) (Shimizu T, Iwanaga M, Yasunaga A. Protective role of glutathione synthesis on radiation-induce DNA damage in rabbit brain [J].CeIl-MoI-Neurobiol, 1998,18(3) 299-310)。磷脂是膜的主要組成成分，對(duì)膜的結(jié)構(gòu)完整、膜的離子傳輸和分子識(shí)別等功能的正常發(fā)揮以及依賴于磷脂的蛋白質(zhì)系統(tǒng)的活性等都起著決定作用。人體所有細(xì)胞中都含有磷脂，它是維持生命活動(dòng)的基礎(chǔ)物質(zhì)。磷脂對(duì)活化細(xì)胞，維持新陳代謝，基礎(chǔ)代謝及荷爾蒙的均衡分泌，增強(qiáng)人體的免疫力和再生力，都能發(fā)揮重大的作用。概括的講磷脂的基本功用是增強(qiáng)腦力，安定神經(jīng)，平衡內(nèi)分泌，提高免疫力和再生力，解毒利尿，清潔血液，健美肌膚，保持年輕，延緩衰老。磷脂酰乙醇胺(PE，phosphatidyl ethanolamine)，又名腦磷脂，是磷脂的一種，由甘油、脂肪酸、磷酸和乙醇胺組成的一種磷脂。存在于腦、神經(jīng)、大豆等中。新鮮制品是無(wú)色固體，空氣中易變?yōu)榧t棕色。有吸濕性。不溶于水和丙酮，微溶于乙醇，溶于氯仿和乙醚。由于其含有極性部分和非極性部分，極適宜在體內(nèi)降解，無(wú)毒性，無(wú)免疫原性。作為載體有降低藥物毒性、提高療效、減少副作用和藥物劑量的作用。也可用作抗氧劑。
本發(fā)明使用磷脂酰乙醇胺對(duì)SOD進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以提高SOD的穩(wěn)定性和活性，增強(qiáng) SOD的細(xì)胞親和力，降低抗原性和毒副作用，為SOD的臨床應(yīng)用提供支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶(PE-SOD)組合物的結(jié)構(gòu)如下式⑴所
示，
權(quán)利要求
1.一種磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，如下式(I)所示，
2.如權(quán)利要求1所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，其特征在于，η為1 4的整數(shù)，η的平均值為1. 5 2. 4，該組合物由25 40摩爾％的η = 1的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，35 50摩爾％的η = 2的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，10 20摩爾％的η = 3的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，5 15摩爾％的η = 4的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組成。
3.如權(quán)利要求1所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，其特征在于，R選自 Cn，C13 C15，C17 的烷基。
4.一種權(quán)利要求1 3任一所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，包括以下反應(yīng)步驟(1)乙二醇在二氯甲烷中與對(duì)硝基苯基氯甲酸酯以及吡啶反應(yīng)，生成化合物(II)，乙二醇對(duì)硝基苯基氯甲酸酯吡啶的摩爾比為1 2 4 4 8，反應(yīng)溫度為0 30°C， 反應(yīng)時(shí)間3 5小時(shí)；(2)惰性氣體保護(hù)條件下，化合物(III)與化合物(II)以氯仿為溶劑在三乙胺的作用下生成化合物(IV)，化合物(III)三乙胺化合物(II)的摩爾比為1 20 30 8 12，反應(yīng)溫度為20 40°C，反應(yīng)時(shí)間12 24h;(3)將SOD溶于適當(dāng)?shù)娜軇┇@得的SOD溶液，攪拌的同時(shí)向該溶液中添加磷脂酰乙醇胺衍生物(IV)，生成組合物(I)；(4)精制方法，將步驟(3)所得磷脂酰乙醇胺化超氧化物歧化酶組合物吸附于離子交換樹脂后，用溶液A洗脫除去未反應(yīng)的S0D，再用溶液B洗脫磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，濃縮洗脫液既得精制組合物(I)；
5.如權(quán)利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所用溶劑選自水或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑，優(yōu)選水和有機(jī)溶劑的混合溶劑，作為水，選自精制水、離子交換水、蒸餾水或注射用水，有機(jī)溶劑，選自異丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、環(huán)丁砜、二甲亞砜、丙酮、1，4_ 二噁烷、甲醇，優(yōu)選異丙醇。
6.如權(quán)利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟(3)中磷脂酰乙醇胺衍生物(IV)與SOD的摩爾比為1 0.05 0.4，優(yōu)選 1 0. 1 0. 25。
7.如權(quán)利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟⑶的反應(yīng)溫度為0 30°C，反應(yīng)時(shí)間為0. 5 72小時(shí)，優(yōu)選2 24小時(shí)。
8.如權(quán)利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟(3)的攪拌速度為50 500rpm，優(yōu)選100 300rpm。
9.如權(quán)利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，步驟(4)所用溶液A由無(wú)機(jī)鹽濃度為5 lOOmmol，pH6 9的緩沖液和有機(jī)溶劑組成，緩沖液為20 90體積％，有機(jī)溶劑為10 80體積％ ；溶液B由無(wú)機(jī)鹽濃度為150 400mmol, pH6 9的緩沖液和有機(jī)溶劑組成，緩沖液為20 90體積％，有機(jī)溶劑為10 80體積％。
10.如權(quán)利要求9所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的制備方法，其特征在于，溶液A、B所用有機(jī)溶劑選自異丙醇、N, N- 二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N, N- 二甲基乙酰胺、環(huán)丁砜、二甲亞砜、丙酮、1，4_ 二噁烷、甲醇，優(yōu)選甲醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及如式(I)所示的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其制備方法，超氧化物歧化酶(SOD)的一個(gè)以上的氨基被磷脂酰乙醇胺殘基取代，式中n為取代基個(gè)數(shù)，n為1～4的整數(shù)，n的平均值為1.5～2.4，式中的R為C11，C13，C15，C17的烷基。如式(I)所示的組合物由25～40摩爾％的n＝1的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，35～50摩爾％的n＝2的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，10～20摩爾％的n＝3的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，5～15摩爾％的n＝4的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶組成。經(jīng)過(guò)磷脂酰乙醇胺修飾后的SOD顯示出穩(wěn)定性增加、活性提高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102492670SQ20111045190
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者姜家妹, 宋華先, 徐慶春, 秦玉霞, 馬紅萍, 黃海 申請(qǐng)人:遼寧中?？瞪锼帢I(yè)有限公司