納米酶、制備納米酶的方法、以及使用納米酶的方法
【專利摘要】本公開內容的實施方案提供了具有核/殼納米顆粒的納米酶、中空納米酶、包含治療劑的中空納米酶、制備納米酶的方法、使用納米酶的方法等。
【專利說明】納米酶、制備納米酶的方法、以及使用納米酶的方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2013年8月14日提交的、具有序列號61/865，650的、標題為aNANOZYMES, METHODS OF MAKING NANOZYMES, AND METHODS OF USING NANOZYMES”的共同未決的美國臨時申請的優(yōu)先權，該美國臨時申請通過引用并入本文。
[0003]背景
[0004]至今，酶已被廣泛應用于醫(yī)藥中。大多數(shù)酶被細胞外使用，用于局部應用(例如，膠原酶)、毒性物質的去除(例如，硫氰酸生成酶)、以及血液循環(huán)系統(tǒng)內的紊亂(例如，尿激酶)。另外，酶在癌癥的治療中具有主要的潛在應用，例如，淋巴細胞性白血病的治療中的天冬酰胺酶(asparagenase)。然而，醫(yī)藥中的酶應用受到很多局限性的限制并具有很多局限性。因此，存在克服與酶相關的局限性的需求。
[0005]概述
[0006]本公開內容的實施方案包括具有核/殼納米顆粒的納米酶(nanozyme)、中空納米酶、包含治療劑的中空納米酶、制備納米酶的方法、使用納米酶的方法，等等。
[0007]納米酶的一個示例性實施方案，除了其他的以外，包括:核/殼納米顆粒、酶、和識別部分，酶和識別部分各自附著至納米顆粒的表面，其中納米顆粒是Fe3O4Au核/殼納米顆粒。在一個實施方案中，酶不與附著至核/殼納米顆粒的識別部分和保護部分發(fā)生反應。在一個實施方案中，納米酶可包括保護部分，其中保護部分附著至核/殼納米顆粒。在一個實施方案中，納米酶可包括治療劑。在一個實施方案中，核/殼納米顆粒的Fe3O4可起顯像劑的作用。在一個實施方案中，核/殼納米顆粒的金可起光熱治療劑(photothermal therapyagent)的作用。在一個實施方案中，納米酶可包括附著至核/殼納米顆粒的細胞間和細胞內的運輸引導部分(traffic guiding moiety)。在一個實施方案中，納米酶可包括附著至核/殼納米顆粒的變構官能部分。
[0008]中空納米酶的一個示例性實施方案，除了其他的以外，包括:圍繞中空的核(hollow core)的聚合物層，其中聚合物層包括酶、識別部分、和保護部分，其中酶、識別部分、和保護部分各自在聚合物層的外表面上，其中中空的核具有約Inm至5000nm的直徑。在一個實施方案中，聚合物層包括穿過聚合物層的多個孔。在一個實施方案中，中空納米酶可包括配置在中空核中的治療劑。
[0009]形成中空納米酶的方法的一個示例性實施方案，除了其他的以外，包括:提供具有納米顆粒核的納米酶，其中酶、識別部分、和保護部分附著至納米顆粒核的表面；由以下的一種或更多種的部分形成聚合物層:酶、識別部分、和保護部分，其中聚合物層在以下的一種或更多種的一端形成:酶、識別部分、和保護部分，使得聚合物層圍繞納米顆粒核；以及去除納米顆粒核，保留圍繞中空的核的聚合物層。
[0010]裝載中空納米酶的方法的一個示例性實施方案，除了其他的以外，包括:提供中空納米酶，其中中空納米酶包括圍繞中空的核的聚合物層，其中聚合物層包括酶和識別部分，其中酶和識別部分各自在聚合物層的外表面上，其中聚合物層包括多個孔，其中中空的核具有約Inm至5000nm的直徑；將治療劑通過聚合物層的孔配置入中空納米酶中；以及將保護部分配置在聚合物層上，其中保護部分基本上封閉孔使得治療劑不會退出孔。
[0011]施用治療劑的方法的一個示例性實施方案，除了其他的以外，包括:向具有狀況的受試者施用中空納米酶，其中中空納米酶包括圍繞中空的核的聚合物層，其中聚合物層包括酶、識別部分、和保護部分，其中酶、識別部分、和保護部分各自在聚合物層的外表面上，其中中空的核具有約Inm至5000nm的直徑，其中將治療劑配置在中空的核中，其中治療劑以藥學上有效量存在以治療狀況，其中中空納米酶在聚合物層中具有孔，其中由于基本上封閉孔的聚合物層上的保護部分，治療劑不會通過孔逃逸；其中中空納米酶進入受試者的細胞，其中在進入細胞后，保護部分從聚合物層上釋放并將治療劑釋放進入細胞。在一個實施方案中，待治療的狀況可包括病毒性疾病和癌癥治療，特別是HBV、HCV和HPV疾病，和肝癌。
[0012]附圖簡述
[0013]本公開內容的許多方面可參考以下附圖被更好地理解。附圖中的組分不一定按比例繪制，而將重點放在清楚地說明本公開內容的原理上。此外，在附圖中，相似的參考數(shù)字指示貫穿數(shù)個圖的相應部分。
[0014]圖1A示出了用于在Fe3O4納米顆粒上的兩步生長金殼(gold shell)的方案:(1)薄金殼在氯仿中的生長，以及(2)較厚的金殼在水溶液中的生長。圖1B示出了 10-nm Fe3O4納米顆粒的典型的TEM圖像。圖1C示出了所得的具有2.5nm的殼厚度的Fe304/Au核/殼納米顆粒的典型的TEM圖像。
[0015]圖2示出了制備包含納米酶的Fe3O4Au的方案:(I)裝載核糖核酸酶，⑵用ss-DNA寡核苷酸的混合物表面官能化，且ss-DNA寡核苷酸使用PEG間隔物與AS1411和TSLlla的DNA適體交聯(lián)，以及(3)用PEG-嵌段-聚(L-賴氨酸氫溴酸鹽)共聚物表面官能化。
[0016]圖3示出了用于從核糖核酸酶官能化的金納米顆粒合成中空納米酶的方案:步驟1:用燒基硫醇-封端的、炔丙基修飾的ss-DNA寡核苷酸的混合物的表面官能化，且ss-DNA寡核苷酸使用PEG間隔物與AS1411和TSLlla的DNA適體交聯(lián)。對于步驟I’，將血清白蛋白與ss-DNA寡核苷酸共官能化。步驟2和2’:將金納米顆粒的表面上的炔丙基基團交聯(lián)。步驟3和3’:使用KCN溶液去除金納米顆粒支架。
[0017]圖4示出了用于通過琥泊酰亞胺基-6-肼基煙酰胺(succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide)交聯(lián)RNA酶和琥?白酰亞胺基-4-甲?；郊柞０?succinimidyl-4-formylbenzamide) DNA 寡核苷酸的不意圖。
[0018]圖5示出了用PEG-嵌段-聚(L-賴氨酸氫溴酸鹽)共聚物表面官能化DNA-RNA酶中空納米結構，產生“成熟的”納米酶。
[0019]圖6Α和6Β示出了用乙酸雙氧鈾負染色的“成熟的”中空納米酶的透射電子顯微鏡圖像。
[0020]圖7示出了用于制備裝載有索拉非尼的納米酶的方案:(I)將索拉非尼裝載進納米酶中，以及⑵用PEG-嵌段-聚(L-賴氨酸氫溴酸鹽)共聚物表面官能化，產生“成熟的”納米酶。
[0021]詳述
[0022]在本公開內容被更詳細描述之前，應當理解，本公開內容不限于描述的特定實施方案，因為此特定實施方案當然可發(fā)生變化。還應當理解，本文使用的術語僅用于描述特定實施方案的目的，并不旨在限制，因為本公開內容的范圍將僅由所附的權利要求來限定。
[0023]在提供數(shù)值范圍的情況下，應理解，在該范圍的上限和下限之間的每個中間值，至下限的單位的十分之一(除非上下文另有明確規(guī)定)，以及任何其他所述或在所述范圍內的中間值，都包括在本公開內容之內。這些較小范圍的上限和下限可獨立地被包括在較小范圍內并且也被包括在本公開內容內，并滿足所述范圍內任何特定排除的限值。在所述范圍包括一個或兩個限值時，排除那些包括的限值的任一個或兩個的范圍也被包括在本公開內谷內。
[0024]除非另有定義，本文使用的所有技術術語和科學術語具有與本公開內容所屬領域中的普通技術人員通常理解的相同的含義。現(xiàn)描述優(yōu)選的方法和材料，盡管與本文描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料也可被用于實踐或測試本公開內容。
[0025]如對本領域技術人員而言在閱讀本公開內容后將明顯的是，本文所述和所示的單個實施方案的每一個都具有離散的組分和特征，其可與任何其他數(shù)個實施方案的特征容易地分離或組合，而不偏離本公開內容的范圍或精神。任何列舉的方法都可以以列舉的事件的順序或以邏輯上可能的任何其他順序來進行。
[0026]除非另有指明，本公開內容的實施方案將采用成像、化學、合成有機化學、生物化學、生物學、分子生物學、微生物學等的技術，其在本領域的技術范圍內。這些技術在文獻中被充分說明。
[0027]闡述以下實施例以便為本領域普通技術人員提供如何進行本文公開和要求保護的方法以及使用本文公開和要求保護的組合物和化合物的完整的公開內容和描述。已作出努力以確保關于數(shù)字(例如，量、溫度等)的準確性，但應予以考慮一些誤差和偏差。除非另有指明，份數(shù)是按重量計算的份數(shù)，溫度以。C計，并且壓力為大氣壓或接近大氣壓。標準溫度和壓力被定義為20°c和I個大氣壓。
[0028]在本公開內容的實施方案被詳細描述之前，應當理解，除非另有指明，本公開內容不限于特定的材料、試劑、反應材料、制造工藝等，因為這些可發(fā)生改變。還應當理解，本文使用的術語僅用于描述特定實施方案的目的，并不旨在限制。步驟可以以邏輯上可能的不同順序被執(zhí)行，這在本公開內容中也是可能的。
[0029]必須指明的是，除非上下文另有明確規(guī)定，如在說明書和所附的權利要求中使用的，單數(shù)形式“一(a)”，“一(an)”和“該(the) ”包括復數(shù)指示物。因此，例如，提及“一個支持體”包括多個支持體。除非相反意圖是明顯的，在本說明書和隨后的權利要求中，將提及一些術語，其應被定義具有以下含義。
[0030]定義
[0031]在描述和要求保護公開的主題中，以下術語將根據(jù)下面闡述的定義來使用。
[0032]除非另有定義，本文使用的所有本領域的術語、符號和其他科學術語旨在具有本公開內容所屬領域的技術人員通常理解的含義。在一些情況下，具有通常理解的含義的術語在本文被定義以為了清楚起見和/或為了及時參考，并且此類定義在本文的包括不應必然地被解釋為表示實質上不同于本領域通常理解的術語的含義。本文描述或參考的技術和程序通常被本領域技術人員良好理解并由本領域技術人員使用常規(guī)方法學被通常采用。除非另有說明，如果適當?shù)脑?，涉及使用商購可得的試劑盒和試劑的程序通常根?jù)制造商確定的方案和/或參數(shù)來進行。
[0033]“施用”意指將本公開內容的納米酶引入受試者。可使用任何施用途徑，諸如靜脈內、口服、局部、皮下、腹膜內、動脈內、吸入、陰道、直腸、鼻、引入腦脊液、或滴注入身體隔室(body compartment)。
[0034]如本文使用的，術語“受試者”或“患者”包括人、哺乳動物(例如貓、狗、馬等)、家禽等。本公開內容的實施方案可施用至其的典型的受試者將是哺乳動物，特別是靈長類，尤其是人。對于獸醫(yī)應用，各種各樣的受試者將是合適的，例如家畜諸如牛、綿羊、山羊、奶牛、豬等；家禽諸如雞、鴨、鵝、火雞等；以及家養(yǎng)動物特別是寵物諸如狗和貓。對于診斷或研宄應用，各種各樣的哺乳動物將是合適的受試者，包括嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、倉鼠)、兔、靈長類和豬諸如近交的豬(inbred pig)等。此外，對于體外應用，諸如體外診斷和研宄應用，上述受試者的體液和細胞樣品將是適于使用的，諸如哺乳動物(特別是靈長類諸如人)的血液、尿液或組織樣品、或關于獸醫(yī)應用中提到的動物的血液、尿液、或組織樣品。術語“活的受試者”是指活著的以上指出的受試者。術語“活的受試者”是指整個受試者，并不僅僅是從活的受試者切除的部分(例如，肝或其他器官)。
[0035]術語“樣品”可指組織樣品、細胞樣品、液體樣品等。樣品可取自受試者。組織樣品可包括毛發(fā)(包括根部)、口腔拭樣、血液、唾液、精液、肌肉、或來自任何內臟器官。液體可以是，但不限于，尿液、血液、腹水、胸膜液、脊髓液等。身體組織可包括，但不限于，皮膚、肌肉、子宮內膜、子宮、和宮頸組織。在本公開內容中，樣品的來源不是關鍵。
[0036]術語“可檢測的”是指相對于背景信號檢測信號的能力。
[0037]術語“可檢測的信號”是源自非侵入性成像技術，諸如，但不限于，磁共振成像(MRI)或基于納米酶的結構的其他適當?shù)脑O備的信號?？蓹z測的信號是可檢測的并與可由受試者產生的其他背景信號是可區(qū)分的。換言之，在可檢測信號和背景之間存在可測量的且統(tǒng)計學上顯著的差異(例如，統(tǒng)計學上顯著的差異是足夠區(qū)分可檢測的信號和背景的差異，諸如，視情況而定，可檢測的信號和背景之間的約1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、或40%、或更多的差異)。標準和/或校準曲線可被用于確定聲學可檢測的信號和/或背景的相對強度。
[0038]如本文使用的，術語“單位劑型”是指適合作為用于人和/或動物受試者的單一劑量的物理上不連續(xù)的單位，每一單位都包含計算的以足夠產生期望的效果的量的預定量的化合物(例如，納米酶中使用的治療劑，如本文所述)與藥學上可接受的稀釋劑、載體或媒介物的聯(lián)合。用于單位劑型的規(guī)格取決于采用的特定化合物、施用的途徑和頻率、和待實現(xiàn)的效果、以及與受試者中每一化合物相關的藥效學。
[0039]術語“治療有效量”和“有效量”在本文可互換使用并且是指待施用的足以產生預期的應用，包括但不限于狀況或疾病治療的治療劑或包含治療劑的納米酶的量。例如，有效量的治療劑在某種程度上將減輕疾病的一個或更多個癥狀，即，在某種程度上，減輕狀況或疾病的一個或更多個癥狀。治療有效量可取決于預期的應用(體外或體內)、或待治療的受試者和狀況例如受試者的體重和年齡、狀況的嚴重程度、施用的方式等而不同，其可由本領域普通技術人員容易地確定。術語還適用于將引起靶細胞或組織中特定反應的劑量。具體劑量將取決于所選的特定治療劑、遵循的給藥方案、其是否與其他劑組合施用、施用的時間選擇、所施用的細胞或組織、以及其中其攜帶的物理遞送系統(tǒng)而不同。
[0040]總體討論
[0041]本公開內容的實施方案提供了具有核/殼納米顆粒的納米酶、中空納米酶、包含治療劑的中空納米酶、制備納米酶的方法、使用納米酶的方法等。本公開內容的一個或更多個實施方案可以是有利的，因為其相對于基于其他酶的產品，可被設計為是選擇性的、可不產生引起免疫應答、可具有延長的壽命、可持續(xù)更長的時間段是穩(wěn)定的、和/或可遞送治療劑。本公開內容的實施方案可被用于成像、檢測、研宄、監(jiān)測(例如，存活)、評價和/或使用納米酶或中空納米酶的實施方案治療狀況諸如疾病。本公開內容的實施方案可被用于治療病毒性疾病以及用于癌癥治療，特別是HBV、HCV和HPV疾病，和肝癌。另外的詳細內容在實施例中描述。
[0042]一般而言，本文描述了納米酶的三個實施方案，其中每個都可包括許多變化。示例性實施方案包括具有核/殼納米顆粒諸如Fe3O4Au納米顆粒支架的核/殼納米酶。在一個實施方案中，F(xiàn)e304/Au納米顆粒的超順磁特性使得使用磁共振成像(MRI)體內追蹤相應納米酶成為可能。此外，本公開內容的實施方案連同納米酶的其他性能可被用于光熱治療(例如，通過金殼)和磁共振成像(例如，鐵核(iron core))。
[0043]另一個示例性實施方案包括不包含無機納米顆粒(例如，其中納米顆粒本來將被定位的中空的區(qū)域或核)的中空納米酶。在一個實施方案中，中空納米酶可包括用于成像的標記物(例如，染料標記物)。沒有無機納米顆粒的中空納米酶顯示出中空的核(其中納米顆粒是先前存在的)，其中納米顆粒的去除消除了可由無機納米顆粒誘導的潛在的長期毒性。另外，標記有染料諸如熒光素的中空納米酶，可使用熒光顯微術進行追蹤。
[0044]另一個示例性實施方案包括包含配置在中空納米酶的中空區(qū)域內的治療劑(例如，小分子藥物)的中空納米酶。裝載了小分子藥物的中空納米酶預期具有增強的抗癌效力。
[0045]在一個實施方案中，核/殼納米酶或中空納米酶可包括兩種或更多種類型的ss-DNA寡核苷酸，并且該設計允許納米酶具有在不同位置處降解生存素的mRNA(或bcl2mRNA或其他mRNA)或這兩種蛋白的mRNA的多靶向能力。
[0046]由于納米酶(和中空納米酶)的結構，其酶促活性和靶序列特異性可通過以下參數(shù)的一個或更多個的優(yōu)化被最大化:納米顆粒支架的尺寸、RNA核酸內切酶的密度和組成、ssDNA寡核苷酸的密度和/或序列和長度。本文描述的納米酶的各種實施方案的細胞類型靶向特異性可通過基于DNA-適體的引導組分的密度和基于PEG的保護組分的密度來確定。納米酶的內涵體逃逸能力(endosomal escape capability)取決于內涵體逃逸增強組分的密度和組成。另外，這些參數(shù)還在納米酶細胞進入、穩(wěn)定性和/或毒性的效力中起作用。
[0047]現(xiàn)在提及核/殼納米顆粒，核/殼納米顆粒納米酶可包括納米顆粒、酶、和識別部分。酶和識別部分各自附著(例如，直接地、通過接頭(例如，化合物或蛋白)等間接地)至核/殼納米顆粒納米酶的表面的聚合物層或納米顆粒。在一個實施方案中，核/殼納米顆粒納米酶可包括兩種或更多種類型(例如，具有不同功能)的酶和/或識別部分。在一個實施方案中，納米酶還可包括保護部分、細胞間和細胞內的運輸引導部分、和/或變構官能部分。
[0048]在一個實施方案中，核/殼納米顆?？勺鳛橛糜谄渌M分附著的支架起作用。在一個實施方案中，核/殼納米顆粒還可作為可檢測的納米顆粒(例如，具有或能夠產生可檢測的信號)起作用，該可檢測的納米顆粒可使用成像方法諸如MRI被檢測，或作為用于疾病(例如，癌癥)治療的光熱治療劑起作用。在一個實施方案中，納米顆粒包括核和配置在核上的殼。在一個實施方案中，核/殼納米顆粒可包括Fe304/Au核/殼納米顆粒、Fe2Mn04/Au核/殼納米顆粒、Fe2ZnO4Au核/殼納米顆粒、或FePt/Au核/殼納米顆粒。
[0049]在一個實施方案中，可使納米顆粒成各向同性形狀，諸如球形、立方體、四面體、多面體，或成各向異性形狀諸如納米片、納米棒、納米線(nanowire)以及納米棱柱(nanoprism)。在一個實施方案中，核/殼納米顆粒的尺寸可為約Inm至510nmJt Inm至lOOOnm、或約Inm至500nm，以球形或近球形納米顆粒的直徑(或沿納米顆粒的橫截面的最長距離)計。在一個實施方案中，核可具有約1.0]11]1至20111]1或約20nm至5000nm的直徑。在一個實施方案中，殼可具有約1.0nm至5.0nm或約5.0nm至10nm的厚度。
[0050]在一個實施方案中，酶可行使功能以對核苷酸(例如，DNA、RNA、或更小的核苷酸)或肽(例如，蛋白質)起作用。在一個實施方案中，酶功能包括水解、甲基化、去甲基化、磷酸化、去磷酸化、泛素化、氧化、還原、核酸編輯、縮合，或用于DNA、RNA、蛋白、肽、寡糖、多糖、或小分子諸如神經元遞質的其他類似的酶促修飾。在一個實施方案中，當附著至納米顆粒(或中空納米酶的聚合物層)時，酶不與識別部分和保護部分發(fā)生反應，或當附著至納米顆粒(或中空納米酶的聚合物層)時，基本上不與識別部分和保護部分發(fā)生反應(例如，可以以一定的速率與識別部分和/或保護部分發(fā)生反應，使得納米酶可被用于實現(xiàn)期望的目標和/或執(zhí)行納米酶的期望的功能)。
[0051]在一個實施方案中，酶可包括核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸內切酶、蛋白內切酶、或其組合。在一個實施方案中，核糖核酸內切酶可包括:RNA酶A、RNA酶II1、RNA酶H、RNA酶P、或RNA酶Tl。在一個實施方案中，脫氧核糖核酸內切酶可包括:脫氧核糖核酸酶11、脫氧核糖核酸酶IV、限制性內切酶和UvrABC核酸內切酶。在一個實施方案中，蛋白內切酶可包括:蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶、和內肽酶V8。在一個實施方案中，納米酶可包括附著至納米顆?；蛑锌占{米酶的聚合物層的I至200種酶。
[0052]在一個實施方案中，識別部分可起作用以使納米酶(本文描述的任何納米酶)與分子相互作用。在一個實施方案中，識別部分可具有對可與狀況、疾病、或感興趣的相關的生物事件相關的細胞、組織、蛋白、DNA、RNA、抗體、抗原等的親和力。特別地，識別部分可起作用以靶向感興趣的特定的DNA、RNA和/或蛋白。識別部分可包括，但不限于具有對以下的親和力的多肽(例如，蛋白，諸如但不限于，抗體(單克隆或多克隆))、抗原、核酸(單體和寡聚的兩者)、多糖、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、配體、適體、小分子、配體、或其組合:狀況，疾病，或狀況、疾病的相關的生物事件或其他化學、生物化學、和/或生物事件，或生物事件。在一個實施方案中，識別部分可包括:序列特異性DNA寡核苷酸、鎖核酸(LNA)、和肽核酸(PM)、抗體、和小分子蛋白受體。在一個實施方案中，納米酶(本文描述的任何實施方案)可包括附著至納米顆粒或中空納米酶的聚合物層的I至2000種識別部分。在一個實施方案中，識別部分還可包括保護部分、和/或細胞間和細胞內的運輸引導部分的功能，使得識別部分具有多重(例如，三重)功能。本文描述了保護部分的功能。
[0053]在一個實施方案中，納米酶(本文描述的任何實施方案)還可包括保護部分。保護部分可附著(例如，直接地、通過接頭(例如，化合物或蛋白)、或納米酶的聚合物層等間接地)至納米顆粒或中空納米酶的聚合物層。在一個實施方案中，保護部分可起作用以控制細胞內的穩(wěn)定性、分散性、細胞攝取效率和/或選擇性細胞進入效率?？蛇x地或另外地，保護部分可實質上減少(例如，相對于不包括保護基團，減少約70%或更多、約80%或更多、約90%或更多、約95%或更多、或約99%或更多)或消除納米酶的毒性和/或實質上減少(例如，相對于不包括保護基團，減少約70 %或更多、約80 %或更多、約90 %或更多、約95 %或更多、或約99%或更多)或消除納米酶的免疫原性，或其組合。在一個實施方案中，保護部分可減少(例如，相對于不包括保護基團，減少約70%或更多、約80%或更多、約90%或更多、約95%或更多、或約99%或更多)或消除非靶分子靠近納米酶的酶，并且可保護納米酶的酶部分免于酶(例如，蛋白酶)的降解。
[0054]在一個實施方案中，保護部分可包括:DNA寡核苷酸、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(丙烯延胡索酸酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))、聚丙烯酰胺、多肽、聚-N-取代的甘氨酸寡聚物(類多肽(polypeptoid))、透明質酸(HA)、藻酸鹽/醋、殼聚糖、瓊脂糖、膠原、纖維蛋白、明膠、葡聚糖、及其任何組合，以及這些配體各自的衍生物等。在一個實施方案中，納米酶(本文描述的任何納米酶)可包括附著至納米顆?；蛑锌占{米酶的聚合物層的I至2000種保護部分。在一個實施方案中，納米酶可包括兩種或更多種類型(例如，具有不同功能)的酶、保護部分、和/或識別部分。
[0055]在一個實施方案中，細胞間和細胞內的運輸引導部分可將納米酶(本文描述的任何納米酶)引導進入特定器官(諸如肝)、細胞類型(諸如肝細胞)、亞細胞細胞器、和細胞核。細胞間和細胞內的運輸引導部分可附著(例如，直接地、通過接頭(例如，化合物或蛋白)或納米酶的聚合物層等間接地)至納米顆粒或中空納米酶的聚合物層。在一個實施方案中，細胞間和細胞內的運輸引導部分可包括DNA寡核苷酸、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、環(huán)糊精、聚合物、TransFectin，及其任何組合，以及這些配體各自的衍生物等。在一個實施方案中，納米酶可包括附著至納米顆?；蛑锌占{米酶的聚合物層的I至2000種細胞間和細胞內的運輸引導部分。在一個實施方案中，納米酶可包括兩種或更多種類型(例如，具有不同功能)的酶、保護部分、和/或識別部分、和/或細胞間和細胞內的運輸引導部分。
[0056]另外，變構官能部分也可附著至納米酶。變構官能部分可附著(例如，直接地、通過接頭(例如，化合物或蛋白)或納米酶的聚合物層等間接地)至納米顆粒或中空納米酶的聚合物層。變構官能部分使納米酶具有響應于選擇的變構效應物諸如疾病相關的代謝通路中的特定產物或副產物(例如，葡萄糖)的開啟/關閉轉換成為可能。在一個實施方案中，變構官能部分可包括DNA、RNA、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、肽、蛋白、糖、脂質、小分子受體諸如生物素、環(huán)糊精、聚合物、TransFectin、及其組合，以及這些部分各自的衍生物等。
[0057]除了酶、識別部分、保護部分、和/或細胞間和細胞內的運輸引導部分之外，納米酶可包括可被用于治療感興趣的疾病或狀況的治療劑諸如藥物，所述治療劑附著至納米酶的表面。
[0058]在一個實施方案中，中空納米酶可包括圍繞中空的核的聚合物層。聚合物層的一個實施方案可包括和/或其上附著(例如，直接地或間接地)酶和識別部分。在一個實施方案中，酶和識別部分各自附著(例如，直接地、通過接頭(例如，化合物或蛋白)等間接地)至聚合物層。在一個實施方案中，中空納米酶可包括兩種或更多種類型(例如，具有不同功能)的酶和/或識別部分。在一個實施方案中，中空納米酶還可包括保護部分、細胞間和細胞內的運輸引導部分、和/或變構官能部分，其中各自可單獨地附著(例如，直接地或間接地)至聚合物層。關于中空納米酶描述的各個部分與以上關于核/殼納米顆粒納米酶的描述的那些是相同的或類似的。
[0059]在一個實施方案中，由聚合物層界定的中空的核可具有約Inm至5000nm、約Inm至lOOOnm、或約Inm至500nm的尺寸，以球形或近球形的納米顆粒的直徑(或沿納米顆粒的橫截面的最長距離)計。在一個實施方案中，聚合物層可具有約I至50的厚度。
[0060]在一個實施方案中，聚合物層可通過交聯(lián)以下的一種或更多種形成:酶、識別部分、和保護部分、或納米酶的其他部分。在一個實施方案中，交聯(lián)可在以下的一端或靠近一端處發(fā)生:酶、識別部分、保護部分、或其他部分，使得中空的核區(qū)域由聚合物層圍繞。在一個實施方案中，聚合物層可由以下組成:聚炔、聚烯烴、聚異戊二烯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚硅酮、這些的共聚物、這些的組合等。在一個實施方案中，聚烯烴的前體(例如，炔烴)可以是以下的一種或更多種的官能團的一部分:酶、識別部分、保護部分、或其他部分，其中將前體配置在或靠近最接近中空區(qū)域(或在中空區(qū)域之前的納米顆粒)的一端。在一個實施方案中，酶、識別部分、保護部分、或其他部分的一種或更多種可在聚合物層形成后或形成過程中分別附著至聚合物層。
[0061]在一個實施方案中，聚合物層包括穿過聚合物層的多個孔。孔可具有約0.2nm至1nm或5nm至200nm的直徑?？讖娇上嗤虿煌?br> [0062]在一個實施方案中，顯像劑可附著至中空納米酶。在一個實施方案中，顯像劑可包括染料、金屬氧化物納米顆粒、金屬納米顆粒、半導體納米顆粒量子點、和金剛石納米顆粒。在一個實施方案中，顯像劑可附著(例如，直接地或間接地)至中空納米酶或在中空的核內。合適的檢測系統(tǒng)可被用于檢測或成像納米酶。
[0063]如以上提及的，可將治療劑配置在中空的核中。如本文更詳細地描述的，可通過孔將治療劑配置在中空的核中。然后，部分諸如保護部分可被用于基本上防止或防止治療劑從中空的核釋放，直到與狀況或疾病所涉及的靶細胞相互作用為止。
[0064]在一個實施方案中，包括在中空的核中的治療劑的量可以是約I至115個分子。然而，量可基于中空的核的尺寸、待治療的狀況或疾病、中空納米酶上存在的其他部分(在某些情況下，治療劑和部分可協(xié)同起作用)等被調整。
[0065]在一個實施方案中，治療劑可以是小分子藥物、基于肽的藥物、基于蛋白的藥物諸如干擾素、基于核酸的藥物諸如短干擾RNA、和聚合物藥物偶聯(lián)物等。
[0066]在一個實施方案中，中空納米酶可由具有納米顆粒的納米酶制成。在一個實施方案中，納米酶包括可被去除以產生中空的核的納米顆粒核。在一個實施方案中，納米顆粒可包括金屬(例如，金和銀)、金屬氧化物(例如，氧化鐵和氧化鋅)、或半導體(例如，CdSe和InP)。
[0067]在一個實施方案中，方法包括具有納米顆粒核的納米酶，其中酶、識別部分、和保護部分、以及本文討論的其他可能的部分(例如，保護部分、細胞間和細胞內的運輸引導部分、和/或變構官能部分)附著(例如，各自獨立地，直接或間接地)至納米顆粒核的表面。聚合物層可由以下的一種或更多種的部分來形成:酶、識別部分、保護部分等。在一個實施方案中，聚合物層可在以下的一端或靠近一端處形成:酶、識別部分、保護部分等，使得聚合物層圍繞納米顆粒核。關于聚合物層的另外的詳細內容在以上描述。形成聚合物層后，納米顆粒核可被去除，留下圍繞中空的核的聚合物層。
[0068]在一個實施方案中，納米酶可包括孔形成部分。在一個實施方案中，在形成聚合物層之前，將孔形成部分配置在納米顆粒的表面(以下描述)。聚合物層可圍繞孔形成部分形成，使得去除孔形成部分后，孔穿過聚合物層而形成。在一個實施方案中，孔形成部分可通過去除納米顆粒被去除。在一個實施方案中，孔形成部分可獨立于納米顆粒的去除被去除。在一個實施方案中，孔形成部分可包括蛋白、聚合物、納米顆粒、膠束、脂質體、及其組合。在一個實施方案中，可將約I個至5000個孔形成部分配置在納米顆粒的表面。
[0069]在一個實施方案中，中空納米酶可通過在包含治療劑的溶液中處理包括孔的中空納米酶來裝載。在一個實施方案中，治療劑可通過孔被配置(例如，流)入中空區(qū)域。治療劑在中空納米酶的中空區(qū)域內之后，可將保護部分配置到聚合物層上。保護部分基本上封閉孔使得治療劑不退出孔。在一個實施方案中，當中空納米酶進入感興趣的細胞后，可去除保護部分，并且當去除保護部分后，治療劑被釋放進入細胞。在一個實施方案中，保護部分可在出現(xiàn)在某些類型的細胞(例如，癌細胞)、病毒(例如，HCV)等的周圍的某些劑的存在(例如，由其產生)下被去除。
[0070]如以上提到的，中空納米酶可包括顯像劑，使得中空納米酶的位置可被確定。
[0071]試劑盒
[0072]本公開內容包括試劑盒，其包括，但不限于，納米酶、和說明書(關于其使用的書面說明)。納米酶的組分可根據(jù)特定疾病、狀況或甚至待研宄和/或治療的特定疾病、狀況來定制。試劑盒還可包括用于向宿主細胞或宿主生物體施用以上所列的組分的各種組合的本領域已知的適當?shù)木彌_液和試劑。
實施例
[0073]現(xiàn)在已描述了本公開內容的實施方案，一般而言，實施例描述了一些另外的實施方案。雖然本公開內容的實施方案連同實施例和相應文字和附圖被描述，但沒有任何意圖將本公開內容的實施方案限于這些描述。相反，意圖是覆蓋包括在本公開內容的實施方案的精神和范圍內的所有替代形式、變化形式、以及等同物。
[0074]實施例:
[0075]實施例1.Fe3O4Au核/殼納米顆粒的合成。
[0076]Fe3O4Au核/殼納米顆粒展現(xiàn)出核的超順磁特性、Au殼的表面等離子共振吸收、和Au殼的表面官能化化學。這些納米顆粒具有低毒性，并且其是用于MRI的T2造影劑和用于透射電子顯微鏡(TEM)的造影劑。Fe3O4納米顆粒核可通過油酸鐵在從約280°C至340°C范圍的高溫下的熱分解合成，并且我們的初步研宄顯示，所得鐵氧化物納米顆粒的尺寸通過反應溫度容易決定。1
[0077]金外殼在兩步法中生長(圖1)。在第一步驟中，薄殼(?Inm)于50°C下在含油胺的氯仿溶液中生長在Fe3O4納米顆粒核上。AuCl 3被用作金前體且油胺被用作還原劑和加帽配體。使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和檸檬酸鈉將所得納米顆粒轉移進水溶液中。在第二步驟中，HAuCl4被用作前體且抗壞血酸被用作還原劑。這些結果顯示，兩步法允許均勻的金殼生長直至20nm厚。有趣的是，水溶性核/殼納米顆粒可在0.03M NaCl的存在下形成有序的單層(圖1C)。在本研宄中，由于其超順磁特性，我們選擇了小于14nm的Fe3O4納米顆粒核，并且我們已合成了具有6nm至45nm范圍尺寸的Fe3O4Au核/殼納米顆粒用于納米酶的優(yōu)化。每個步驟的產物使用各種技術包括UV-Vis吸收法、動態(tài)光散射、TEM,、X-射線衍射(XRD)、和超導量子干涉儀(SQUID)被充分鑒定。
[0078]實施例2.包含F(xiàn)eWiZAu納米顆粒的納米酶的合成。
[0079]納米酶可通過Fe304/Au納米顆粒的三步表面官能化合成:(i)用RNA核酸內切酶官能化，(ii)用具有一種或更多種RNA識別序列和包含適體的鏈的烷基硫醇封端的ssDNA寡核苷酸的混合物官能化，以及(iii)用PEG-嵌段-聚(L-賴氨酸氫溴酸鹽)的共聚物作為用于保護和內涵體逃逸增強兩者的組分官能化(圖2)。我們選擇RNA酶A或RNA酶A和RNA酶H的混合物用于納米顆粒修飾，并且這些酶通過非特異性相互作用結合至Fe3O4Au納米顆粒的金表面。2
[0080]在第二步驟中，烷基硫醇-封端的ssDNA寡核苷酸可使用金-硫醇結合化學被官能化至納米顆粒。ssDNA寡核苷酸的序列根據(jù)存活素和bcl 2的mRNA的反義序列來選擇。特別地，我們根據(jù)以下設計了用于制備納米酶的烷基硫醇官能化的寡核苷酸的序列:存活素 mRNA 的兩個反義序列(1)5，TGTAGAGATGCGGTGGTCC3 ’ (SEQ ID No:1)和
(2)5’GATGGCACGGCGCACTTTC3，，(SEQ ID No:2)和 bcl 2mRNA 的兩個反義序列:(1)5，GGTCTGCAGCGGCGAGGTCCTG3’ (SEQ ID No:3)和(2)5’GTCTGCAGCGGCGAGGTCCTG3’ (SEQ ID No:4)。另外，AS1411和TSLlla適體可用PEG間隔物在這些烷基硫醇官能化的寡核苷酸的5’端處進行交聯(lián)(圖2)。這些交聯(lián)的分子用來自Glen Research, Inc的商業(yè)化試劑使用DNA合成儀合成。調整裝載至納米顆粒的交聯(lián)的分子的數(shù)目和這些分子中PEG間隔物的數(shù)目以改進納米酶的穩(wěn)定性和細胞類型靶向特異性。
[0081]此外，納米酶上的寡核苷酸密度在合成中被控制，并且使用文獻方法定量測量。2通常，寡核苷酸的密度應足夠高，以阻斷酶接近非互補的ssRNA，然而，如果密度過高，寡核苷酸也可阻斷酶接近互補的ssRNA并降低納米酶的納米酶活性。此外，主要的技術困難是從納米酶樣品中去除未結合的RNA。這些未結合的酶顯著干擾納米酶的酶促活性和靶特異性的體外測試。在初步研宄中，我們已建立了克服該困難的程序。該程序包括使用親和層析和多重離心的分離。
[0082]在第三步驟中，甲氧基-PEG-嵌段-聚(L-賴氨酸氫溴酸鹽)共聚物被官能化至納米顆粒的表面，產生“成熟的”納米酶。這些共聚物通過帶正電荷的聚賴氨酸結構域和帶負電荷的寡核苷酸之間的靜電相互作用結合至納米顆粒的表面。這些共聚物的一些是從公司諸如Alamanda Polymers, Inc商購可得的。我們已調整了共聚物中L-賴氨酸單元重復的數(shù)目以優(yōu)化納米酶的內涵體逃逸能力和結構穩(wěn)定性，并已調整了乙二醇重復單元的數(shù)目以最小化納米酶的非特異性結合水平并最大化其在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性。
_3] 實施例3.沒有無機納米顆粒核的中空納米酶的合成。
[0084]無機納米顆粒核的去除可有效地消除由核引起的納米酶的潛在的長期毒性，并創(chuàng)建用于裝載和遞送用于癌癥治療的小分子藥物(諸如索拉非尼)的腔。為了制備核可去除的納米酶，我們修飾了 RNA核酸內切酶和識別ss-DNA寡核苷酸:用炔丙基醚基團修飾燒基硫醇封端的聚胸腺哺唆(T)喊基的序列，所述塊丙基釀基團通過氣基己基丙稀基氣基(amidohexylacrylamido)接頭連接至T堿基的5位置，和隨后是用于靈活性和剩余部分的可及性的六個未修飾的T堿基的間隔物。具有單個烷基硫醇封端的、炔丙基醚修飾的聚胸腺嘧啶⑴序列的RNA核酸內切酶，使用來自Solulink，Inc的標準蛋白-寡核苷酸綴合試劑盒合成，并使用凝膠電泳進行純化(圖4)。
[0085]已合成了兩種類型的中空納米酶:具有連續(xù)殼的中空納米酶(圖3(上圖))和具有多孔殼的中空納米酶(圖3(底部))。合成以烷基硫醇封端的和炔丙基-醚-修飾的RNA核酸內切酶通過金/硫醇連接化學反應的表面修飾開始。純化后，將所得納米顆粒在以下三個步驟中進一步處理以產生中空納米結構(圖3)。
[0086]在第一步驟中，將RNA酶修飾的金納米顆粒用包含炔丙基醚的烷基硫醇-封端的寡核苷酸通過金/硫醇連接化學反應官能化，或對于可裝載并遞送小分子藥物的具有多孔殼的中空納米酶，用特定蛋白(例如，人血清白蛋白)共官能化。蛋白用作“造孔劑”;其通過非特異性相互作用結合至金納米顆粒的表面，在金納米顆粒表面創(chuàng)建沒有烷基硫醇-封端的、炔丙基醚修飾的聚胸腺嘧啶(T)序列的區(qū)域，導致具有多孔殼的中空納米酶的形成(圖3)?？讖酵ㄟ^造孔蛋白分子的大小控制。
[0087]在第二步驟中，在室溫以磷酸鹽緩沖鹽水(0.15M)溫育期間，在金納米顆粒的表面和沿著修飾的T堿基的炔丙基基團之間發(fā)生交聯(lián)，在金納米顆粒的表面產生密集包裹的、交聯(lián)的DNA殼。在第三步驟中，用KCN水溶液(IyM)去除金納米顆粒支架3，并將所得中空納米結構通過多重離心分離來純化。由于血清白蛋白隨著金納米顆粒支架的去除，在最初步驟用血清白蛋白官能化制成的中空納米結構預期在DNA殼上具有孔(圖3)。所得納米結構的結構穩(wěn)定性已通過微調納米顆粒表面的炔丙基-醚修飾的聚胸腺嘧啶(T)序列的密度被優(yōu)化。原則上，沒有無機納米顆粒支架的這些中空納米結構，應展現(xiàn)出更多的結構靈活性，并且因此，我們將期望，與包含無機納米顆粒支架的那些納米結構相比，這些納米結構可具有針對RNA靶的高的酶促活性。酶促活性和靶特異性通過體外和體內測試進行評價。
[0088]無孔的中空納米結構用甲氧基-PEG-嵌段-聚(L-賴氨酸氫溴酸鹽)聚合物進一步官能化，產生“成熟的”納米酶(圖5、圖6)。用于制備這些納米酶的寡核苷酸可在使用熒光素亞磷酰胺的固態(tài)DNA合成期間用熒光素修飾。因此，這些所得納米酶可被用于用內涵體標記染料使用熒光顯微術評價其內涵體逃逸能力。
[0089]另外，我們已確定具有表面孔的中空納米結構用于裝載小分子藥物(諸如抗癌、抗病毒和抗細菌藥物，圖7)的能力。由于索拉非尼對肝癌細胞的已知的抗癌效應，我們選擇索拉非尼作為模型。原則上，索拉非尼以氫鍵鍵合和π -31相互作用結合至納米酶的密集包裹的和交聯(lián)的胸腺嘧啶區(qū)域，并因此索拉非尼可被裝載進納米酶的腔。由于氫鍵鍵合和31-31相互作用是非常弱的分子間相互作用，裝載的索拉非尼可從納米酶中釋放。由于納米酶的RNA降解功能，我們預期將需要非常低劑量的索拉非尼以在體外和體內產生針對肝癌細胞的強效抗癌效應。索拉非尼釋放是由于在內涵體逃逸期間，甲氧基-PEG-嵌段-聚(L-賴氨酸氫溴酸鹽)聚合物從納米酶的松開。此外，索拉非尼裝載能力和釋放速率取決于pH，其中索拉非尼是在高pH(例如，8.5)下裝載，并在低pH(例如，6.0)下釋放，該低pH是內涵體pH。索拉非尼載量能力和釋放速率作為pH的函數(shù)，使用基于光譜學的測定法進行評價。
[0090]實施例4.測試納米酶的活性和特異性。
[0091]我們已使用了包含F(xiàn)e3O4Au的納米酶評價并優(yōu)化酶促活性和靶向特異性。首先，納米酶的活性和特異性使用在一端包含熒光團且在另一端包含猝滅劑的特異性RNA分子信標來測量。被納米酶裂解后，熒光團與猝滅劑分開，并發(fā)出被熒光計檢測到的強的熒光。來自這些分子信標實驗的結果被用作改進納米酶的設計和合成的初步指導。第二，納米酶的活性和特異性使用體外轉錄的HCV或存活素RNA作為底物以及體外轉錄的宿主管家基因GADPH作為對照被進一步確定。電泳和Northern印跡被用于量化納米酶活性和特異性。這些結果被用作改進納米酶的結構設計和合成的最初反饋。
[0092]參考文獻
[0093]1.Lynch, J.；Zhuang, J.；ffang, T.；LaMontagne, D.；ffu, H.；Cao, Y.C.“Gas-BubbleEffects on the Format1n of Colloidal Iron Oxide Nanocrystals,，，J.Am.Chem.Soc.2011，133，12664-12674.
[0094]2.Wang, Z.；Liu, H ；Yang, S.H ；ffang, T.；Liu, C.；Cao, Y.C.“Nanoparticle-basedArtificial RNA Silencing Machinery for Antiviral Therapy.”Proceedings of theNat1nal Academy of Sciences, 2012, 109, 12387-12392.
[0095]3.Cutler, J.1.；Zhang, K.；Zheng, D.；Auyeung, E.；Prigodich, A.E.；Mirkin, C.A.“Polyvalent Nucleic Acid Nanostructures, ’，，”J.Am.Chem.Soc.2011, 133, 9254-9257.
[0096]應當注意，比率、濃度、量和其他數(shù)值數(shù)據(jù)可在本文中以范圍格式來表示。應當理解，這樣的范圍格式被用于方便和簡潔的目的，并且因此，應當以靈活的方式解釋為不僅包括明確列舉的作為范圍限值的數(shù)值，而且還包括該范圍內包括的所有單個數(shù)值或子范圍，如同每個數(shù)值和子范圍被明確地列舉一樣。舉例來說，“約0.1%至約5%”的濃度范圍應當解釋為不僅包括約0.1被％至約5wt%的明確列舉的濃度，而且還包括指示的范圍之內的單獨濃度(例如，1%、2%、3%、和4% )和子范圍(例如，0.5%，1.1%、2.2%,3.3%、和4.4%)。在一個實施方案中，術語“約”可根據(jù)數(shù)值的有效數(shù)字包括傳統(tǒng)的舍入。另外，短語“約‘X’至‘Y’”包括“約‘X’至約‘Y’”。
[0097]應當強調的是，本公開內容的上述實施方案僅僅是實現(xiàn)本公開內容的原理的可能的實施例，并僅為了清楚理解本公開內容的原理而被闡述?？蓪Ρ竟_內容的上述實施方案做出許多變化和修改而基本上不偏離本公開內容的精神和原則。所有這些修改和變化在此預期被包括在本公開內容的范圍內。
【權利要求】
1.一種納米酶，所述納米酶包括: 核/殼納米顆粒、酶、和識別部分，所述酶和所述識別部分各自附著至所述納米顆粒的表面，其中所述納米顆粒是Fe304/Au核/殼納米顆粒。
2.如權利要求1所述的納米酶，其中所述酶不與附著至所述核/殼納米顆粒的所述識別部分和所述保護部分發(fā)生反應。
3.如權利要求1所述的納米酶，其中至少兩種不同類型的酶附著至所述核/殼納米顆粒。
4.如權利要求1所述的納米酶，其中所述酶選自由以下組成的組:核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸內切酶、蛋白內切酶、及其組合。
5.如權利要求1所述的納米酶，其中所述酶具有選自由以下組成的組的功能:水解、甲基化、去甲基化、磷酸化、氧化、還原、核酸編輯、和縮合。
6.如權利要求1所述的納米酶，其中所述識別部分選自由以下組成的組:序列特異性DNA寡核苷酸、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、抗體、和小分子蛋白受體。
7.如權利要求1所述的納米酶，其中所述識別部分具有選自由以下組成的組的功能:靶向DNA、靶向RNA、和靶向蛋白。
8.如權利要求1所述的納米酶，所述納米酶還包括保護部分，其中所述保護部分附著至所述核/殼納米顆粒。
9.如權利要求8所述的納米酶，其中所述保護部分選自由以下組成的組:DNA寡核苷酸、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(丙烯延胡索酸酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))、聚丙烯酰胺、多肽、聚-N-取代的甘氨酸寡聚物(類多肽)、透明質酸(HA)、藻酸鹽/酯、殼聚糖、瓊脂糖、膠原蛋白、纖維蛋白、明膠、葡聚糖、這些配體各自的衍生物、及其組合。
10.如權利要求9所述的納米酶，其中所述酶選自由以下組成的組:核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸內切酶、蛋白內切酶、及其組合；并且其中所述識別部分選自由以下組成的組:序列特異性DNA寡核苷酸、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、抗體、和小分子蛋白受體。
11.如權利要求9所述的納米酶，其中所述保護部分具有選自由以下組成的組的功能:細胞攝取效率、選擇性細胞進入效率、基本上無毒性、基本上無免疫原性、及其組合。
12.如權利要求1所述的納米酶，所述納米酶還包括治療劑。
13.如權利要求1所述的納米酶，其中所述核/殼納米顆粒的Fe304起顯像劑的作用。
14.如權利要求1所述的納米酶，其中所述核/殼納米顆粒的金起光熱治療劑的作用。
15.如權利要求1所述的納米酶，所述納米酶還包括附著至所述核/殼納米顆粒的細胞間和細胞內運輸引導部分。
16.如權利要求1所述的納米酶，所述納米酶還包括附著至所述核/殼納米顆粒的變構官能部分。
17.—種中空納米酶，所述中空納米酶包括: 圍繞中空的核的聚合物層，其中所述聚合物層包括酶、識別部分、和保護部分，其中所述酶、所述識別部分、和所述保護部分各自在所述聚合物層的外表面上，其中所述中空的核具有約Inm至5000nm的直徑。
18.如權利要求17所述的中空納米酶，其中所述聚合物層包括穿過所述聚合物層的多個孔。
19.如權利要求18所述的中空納米酶，其中所述孔的直徑為約0.2nm至200nm。
20.如權利要求17所述的中空納米酶，其中所述聚合物層由以下的一種或更多種的交聯(lián)形成:所述酶、所述識別部分、和所述保護部分，其中所述交聯(lián)在以下的一種或更多種的一端發(fā)生:所述酶、所述識別部分、和所述保護部分，使得所述中空的核區(qū)域被所述聚合物層圍繞。
21.如權利要求17所述的中空納米酶，其中所述聚合物層為聚烯烴。
22.如權利要求17所述的中空納米酶，所述中空納米酶還包括配置在所述中空的核中的治療劑。
23.如權利要求22所述的中空納米酶，其中所述治療劑是小分子藥物。
24.如權利要求17所述的中空納米酶，其中至少兩種不同類型的酶附著至所述聚合物層O
25.如權利要求17所述的中空納米酶，其中所述酶選自由以下組成的組:核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸內切酶、蛋白內切酶、及其組合。
26.如權利要求17所述的中空納米酶，其中所述酶具有選自由以下組成的組的功能:水解、甲基化、去甲基化、磷酸化、氧化、還原、核酸編輯、和縮合。
27.如權利要求17所述的中空納米酶，其中所述識別部分選自由以下組成的組:序列特異性DNA寡核苷酸、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、抗體、和小分子蛋白受體。
28.如權利要求17所述的中空納米酶，其中所述識別部分具有選自由以下組成的組的功能:革巴向DNA、靶向RNA、和靶向蛋白。
29.—種形成中空納米酶的方法，所述方法包括: 提供具有納米顆粒核的納米酶，其中酶、識別部分、和保護部分附著至所述納米顆粒核的表面； 由以下的一種或更多種的部分形成聚合物層:所述酶、所述識別部分、和所述保護部分，其中所述聚合物層在以下的一種或更多種的一端形成:所述酶、所述識別部分、和所述保護部分，使得所述聚合物層圍繞所述納米顆粒核；以及 去除所述納米顆粒核，保留圍繞中空的核的所述聚合物層。
30.如權利要求29所述的方法，其中形成所述聚合物層包括交聯(lián)以下的一種或更多種:所述酶、所述識別部分、和所述保護部分。
31.如權利要求29所述的方法，其中所述納米酶包括配置在所述納米顆粒表面的孔形成部分。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述孔形成部分選自由以下組成的組:蛋白、聚合物、納米顆粒、膠束、脂質體、及其組合。
33.如權利要求31所述的方法，其中去除包括去除所述孔形成部分以在所述聚合物層中形成孔。
34.一種裝載中空納米酶的方法，所述方法包括: 提供中空納米酶，其中所述中空納米酶包括圍繞中空的核的聚合物層，其中所述聚合物層包括酶和識別部分，其中所述酶和所述識別部分各自在所述聚合物層的外表面上，其中所述聚合物層包括多個孔，其中所述中空的核具有約Inm至5000nm的直徑； 將治療劑通過所述聚合物層的孔配置入所述中空納米酶；以及將保護部分配置在所述聚合物層上，其中所述保護部分基本上封閉所述孔使得所述治療劑不退出所述孔。
35.一種施用治療劑的方法，所述方法包括: 向具有狀況的受試者施用中空納米酶，其中所述中空納米酶包括圍繞中空的核的聚合物層，其中所述聚合物層包括酶、識別部分、和保護部分，其中所述酶、所述識別部分、和所述保護部分各自在所述聚合物層的外表面上，其中所述中空的核具有約Inm至5000nm的直徑，其中將治療劑配置在所述中空的核中，其中所述治療劑以藥學上有效量存在以治療所述狀況，其中所述中空納米酶在所述聚合物層中具有孔，其中由于基本上封閉所述孔的所述聚合物層上的所述保護部分，所述治療劑不會通過所述孔逃逸； 其中所述中空納米酶進入所述受試者的細胞，其中當進入所述細胞后所述保護部分從所述聚合物層釋放，并且所述治療劑被釋放進入所述細胞。
【文檔編號】A61K9/16GK104519875SQ201480000941
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權日:2013年8月14日
【發(fā)明者】云偉·查爾斯·曹, 辰·劉 申請人:佛羅里達大學研究基金會公司