專利名稱：IgG抗體穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及抗體藥物制劑領(lǐng)域.。具體說，本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的高濃度液態(tài)抗體制劑。本發(fā)明穩(wěn)定的液態(tài)制劑示范例是Daclizumab，一種抗IL-2受體抗體；HAIL-12，一種抗IL-12人源化單克隆抗體；和HuEP5C7，一種抗L-選擇蛋白的人源化單克隆抗體的穩(wěn)定性液態(tài)制劑。
背景技術(shù)：
許多人用蛋白制品在應(yīng)用之前需要穩(wěn)定劑來防止蛋白質(zhì)變性、凝聚和其它變化。不穩(wěn)定性表現(xiàn)為形成可溶/不可溶性顆粒，在蛋白制品貯藏和運(yùn)輸期間這種不穩(wěn)定性常會增加。開發(fā)蛋白質(zhì)藥物制劑的主要目標(biāo)是維持蛋白質(zhì)的可溶性、穩(wěn)定性和生物活性。
具體說，免疫球蛋白被視為具有在溶液中傾向于形成凝聚物和顆粒的特性，因此許多免疫球蛋白在用于靜脈內(nèi)或皮下注射之前需要過濾。蛋白質(zhì)形成凝聚物和顆粒一直是開發(fā)非胃腸道給藥免疫球蛋白產(chǎn)品的一個難題，特別當(dāng)以高濃度配制免疫球蛋白時。SynagisTM(MedImmune)是一種用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的人源化IgGl單克隆抗體，針對呼吸道合胞病毒(RSV)T蛋白的A抗原部位中的某表位。SynagisTM由人(90％)和鼠(10％)抗體序列組成。SynagisTM以無菌凍干產(chǎn)品提供，注射時需用無菌水重建。重建的SynagisTM只能肌肉內(nèi)注射給藥。重建時SynagisTM含有以下賦形劑每安瓿47mM組氨酸、3.0mM甘氨酸、5.6％甘露糖醇和濃度100mg/小瓶的活性成分IgGl抗體。重建的SynagisTM必須在重建6小時內(nèi)給予。
WO89/11297公開了一種凍干單克隆抗體制劑，含有凍干的l-25mg/ml IgG單克隆抗體、2-10％麥芽糖以及乙酸鈉、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液，pH3.0-6.0。
WO97/45140公開了一種抗CD-4抗體水溶液制品，以100mM檸檬酸鈉、0.05mMEDTA，pH6.0配成濃度約100mg/ml。申請者說抗體濃縮后，渾濁度輕度升高可能反映蛋白質(zhì)凝聚。去除這種凝聚物需要加入聚山梨酯(Polysorbate)80和除菌過濾。
WO90/11091公開了一種可注射的組合物水溶液，其含有約5mg/ml IgM、2.5-5％(w/v)人血清白蛋白，溶于8-20mM磷酸緩沖液、270mM氯化鈉、pH6.8-7.4。
美國專利6,171,586公開了一種穩(wěn)定的藥物水溶液制劑，其含有治療有效量的不預(yù)先凍干的抗體、pH約4.8-5.5的醋酸緩沖液、表面活性劑和多元醇，其中該制劑不會等滲所需數(shù)量的氯化鈉。
美國專利申請出版物US2001/0014326A1公開了一種凍干的抗體制劑，其含有25mg/ml抗IgE抗體、5mM組氨酸、pH6.0、85mM蔗糖、0.01％聚山梨酯20。
美國專利5,744,132公開了一種組合物，含有1-1000μg/ml IL-12抗體、2％蔗糖、4.15％甘露糖醇、10mM琥珀酸鈉、和約0.02％Tween20，pH5.6。
美國專利6,267,958公開了一種重建的制劑，在20mM組氨酸、pH6.0、340mM蔗糖、0.04％聚山梨酯20和0.9％芐醇中含有100mg/ml rhuMab E25。
美國專利6,165,467公開了一種穩(wěn)定由雜交瘤細(xì)胞系(登錄號HB8307)產(chǎn)生的人單克隆抗體組合物的方法，該方法包括以pH7.2-7.4的磷酸鹽穩(wěn)定的緩沖液透析人單克隆抗體；所述緩沖液含1-20mg D-甘露糖醇/mg單抗、0.005-0.2mM甘氨酸/mg單抗、和能穩(wěn)定所述溶液pH的量的使pH穩(wěn)定化的磷酸鹽。
因此需要一種給予人的穩(wěn)定的液態(tài)抗體制品，其中抗體的濃度為50mg/ml或更高，這種制品適合于非胃腸道給藥，包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種含有高濃度，例如50mg/ml以上濃度的抗體的穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，該抗體溶于20-60mM琥珀酸緩沖液，或30-70mM組氨酸緩沖液(pH約5.5-6.5)、滲透修飾劑和約0.01-0.1％聚山梨酯中。此配方保留了抗體的理化和生物學(xué)穩(wěn)定性，并能在免疫球蛋白給予病人之前防止其最終產(chǎn)品中形成凝聚物和顆粒。本發(fā)明優(yōu)選的抗體包括Daclizumab，一種人源化抗IL-2受體單克隆抗體；HAIL-12，一種抗IL-12人源化單克隆抗體；和HuEP5C7，一種抗L-選擇蛋白的人源化單克隆抗體和Flintozumab，一種抗γ干擾素的人源化單克隆抗體。
這種液體抗體制劑在冷藏溫度(2-8℃)下至少能穩(wěn)定1年，優(yōu)選2年。此液體制劑在室溫(23-27℃)下也能穩(wěn)定至少6個月。此液體制劑適合于皮下注射。
附圖簡要說明

圖1A顯示形成的水解物(clips)的百分率。圖1B顯示用SEC-HPLC評估樣品于不同pH水平在45℃保溫4周后凝聚物的百分率.。
圖2顯示樣品于不同pH水平在45℃保溫4周后，用cIEF評估得出的降解百分率。
圖3樣品于不同pH水平在45℃保溫4周后，用Promega IsoQuant試劑盒評估形成的異天門冬氨酸(iso-asparticaeid)的百分率.。
圖4顯示不同緩沖液對制劑37℃保溫不同時間后效價的影響。
發(fā)明詳述I.定義本文中術(shù)語“緩沖劑”包括那些能維持溶液pH在可接受范圍的試劑，包括琥珀酸鹽(鈉)、組氨酸、磷酸(鉀或鈉)、Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺等。本發(fā)明的緩沖液pH范圍在約5.5-6.5，優(yōu)選pH為6.0。能將pH控制在此范圍內(nèi)的緩沖液例子包括琥珀酸鹽(如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽和其它有機(jī)酸緩沖液。
“藥學(xué)上可接受的賦形劑”(載體，添加劑)是那些適合給予患病哺乳動物并能提供有效劑量的活性成分的惰性物質(zhì)。將這些物質(zhì)加到制劑中能穩(wěn)定抗體的理化和生物結(jié)構(gòu)。該術(shù)語也指適合預(yù)定給藥方式獲得等滲制劑可能需要的添加劑。
術(shù)語“藥物制劑”指其劑型能明確發(fā)揮活性成分的生物活性，且不含有對于給予制品的患者有毒性的其它成分的制品。
“穩(wěn)定的”制劑是蛋白質(zhì)于其中在貯藏期能基本上保持其物理穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物活性的制劑。測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)可參見Peptide andProtein Drug Delivery，247-310，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.1029-90(1993)。可測定在所選溫度所選時間內(nèi)的穩(wěn)定性。
“穩(wěn)定的”液態(tài)抗體制劑是一種在冷藏溫度下(2-8℃)至少12個月，優(yōu)選2年，更優(yōu)選3年；或在室溫下(23-27℃)至少3個月，優(yōu)選6個月，更優(yōu)選1年未觀察到顯著變化的液態(tài)抗體制劑。穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)如下。如SEC-HPLC檢測顯示，只有不到10％，優(yōu)選不到5％的抗體單體降解。此溶液肉眼觀察無色、或澄清至輕度乳白色。該制劑的濃度、pH和滲透壓變化不到±10％。效價為對照的70-130％，優(yōu)選80-120％。觀察到的水解不到10％，優(yōu)選5％。形成的凝聚物不到10％，優(yōu)選5％。
如果肉眼檢查抗體的顏色和/或澄清度，或經(jīng)UV光散射測定、尺寸排阻層析(SEC-HPLC)和動態(tài)光散射(DLS)檢測，抗體的凝聚、沉淀和/或變性無顯著增加，則說藥物制劑中的抗體“保持了其物理穩(wěn)定性”。此外蛋白質(zhì)的構(gòu)象不改變。蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變可采用能測定蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的熒光分光光度法，以及能測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的FTIR分光光度法來評價。
如果藥物制劑中的抗體未顯示顯著的化學(xué)變化，則說此抗體“保持了其化學(xué)穩(wěn)定性”?？赏ㄟ^檢測和定量測定化學(xué)上發(fā)生改變的蛋白質(zhì)形式評估其化學(xué)穩(wěn)定性。常常能改變蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的降解過程包括水解(可用尺寸排阻層析和SDS-PAGE等方法評價)、氧化(例如可通過肽圖，聯(lián)合質(zhì)譜或MALD/TOF/MS等方法評價)、脫酰胺(可用離子交換層析、毛細(xì)管等電聚焦、肽圖、異天冬氨酸測定等方法評價)和異構(gòu)化(可通過測定異天冬氨酸含量、肽圖等評價)。
如果在給定時間內(nèi)，藥物制劑中抗體的生物學(xué)活性仍在該藥劑制備時顯示的生物學(xué)活性范圍內(nèi)，則說此抗體“保持了其生物學(xué)活性”。抗體的生物學(xué)活性可通過例如抗原結(jié)合ELISA試驗(yàn)檢測。
術(shù)語“等滲”指感興趣的制劑具有基本上與人血相同的滲透壓。等滲制劑具有的滲透壓通常為約270-328mOsm。滲透壓略低為250-269mOsm；滲透壓略高為328-350mOsm。例如，可用蒸氣壓或冰凍型滲透壓計測定滲透壓。
“滲透修飾劑”是可加入制劑中以提供該制劑等滲性的那些藥學(xué)上可接受的惰性物質(zhì)。適用于本發(fā)明的滲透修飾劑包括鹽和氨基酸。
II.分析方法以下標(biāo)準(zhǔn)對開發(fā)穩(wěn)定的藥物抗體制劑很重要?？贵w制劑含有藥學(xué)上可接受的賦形劑?？贵w制劑配制時應(yīng)保持其理化和生物學(xué)活性?？贵w制劑在冷藏溫度(2-8℃)下宜穩(wěn)定至少一年，在室溫(23-27℃)下宜穩(wěn)定6個月。
評價產(chǎn)品穩(wěn)定性的分析方法包括尺寸排阻層析(SEC-HPLC)、動態(tài)光散射(DLS)、差示掃描量熱法(DSC)、異天冬氨酸定量法、效價、340nmUV和UV分光光度法。SEC(J.Pharm.Scien.，831645-50，1994Pharm.Res.，11485，1994；J.Pharm.Bio.Anal.，151928，1997；J.Pharm.Bio.Anal.，141133-40，1986)可測定抗體制品中的單體百分率，得到可溶性水解物數(shù)量和絮凝物的信息。DSC(Pharm.Res.，15200，1998；Pharm.Res.，9109，1982)可得到蛋白變性溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的信息。DLS(American Lab.，Nov.1991)可測定平均擴(kuò)散系數(shù)，得到可溶性和不溶性凝聚物含量的信息。340nmUV可測定340nm散射光的強(qiáng)度，得到可溶性和不溶性凝聚物含量的信息。UV分光光度法可測定278nm吸光值得到蛋白質(zhì)濃度的信息。
樣品中異天冬氨酸含量的測定可采用Isoquant異天冬氨酸檢測試劑盒(Promega)。該試劑盒采用酶蛋白異天冬?；谆D(zhuǎn)移酶(PIMT)來特異性檢測靶蛋白中異天冬氨酸殘基的存在。此過程中，PIMT能催化S-腺苷基-L-甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到異天冬氨酸的α-羧基位點(diǎn)，產(chǎn)生S-腺苷基-L-同型半胱氨酸(SAH)。其是一種較小的分子，可用該試劑盒中的SAH HPLC標(biāo)準(zhǔn)品以反相HPLC分離和定量測定。
抗體的效價或生物學(xué)活性可通過其結(jié)合于其抗原的能力來測定?？贵w與其抗原的特異性結(jié)合可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))等免疫測定法來定量檢測。
III.抗體的制備本發(fā)明涉及含有抗體的穩(wěn)定的液態(tài)制劑。該制劑中的抗體可用本領(lǐng)域現(xiàn)有的產(chǎn)生抗體的技術(shù)來制備，其示范性的方法在以下章節(jié)中有更詳細(xì)說明。
所述抗體針對感興趣的抗原。優(yōu)選該抗原是生物學(xué)上的重要多肽，將該抗體給予哺乳動物可預(yù)防和治療疾病。然而也可考慮抗非多肽抗原(如腫瘤相關(guān)糖脂抗原，見美國專利5,091,178)的抗體。
當(dāng)抗原是一種多肽時，它可能是一種跨膜分子(如受體)或配體如生長因子?？乖睦影I素；生長激素包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；副甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈、胰島素B-鏈、胰島素原；促濾泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如第8因子、第9因子、組織因子和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白C；心鈉素；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α和β；腦啡肽酶；RANTES(活化后可調(diào)節(jié)的正常T細(xì)胞表達(dá)并分泌的因子)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏抑制物；松弛素A鏈；松弛素B鏈；前松弛素；小鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物蛋白如β-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE；細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)如CTLA-4；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子如骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)；神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)；或神經(jīng)生長因子如NGF-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長因子如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)如IL-1到IL-12；IL-1到IL-12的受體；選擇蛋白如L，E和P-選擇蛋白；超氧化物歧化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原如AIDS包膜部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素(addressins)；調(diào)節(jié)蛋白；整合蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18和ICAM，VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原如HER2、HER3或HER4受體；以及任一上述多肽的片段。
當(dāng)采用重組技術(shù)時，可在細(xì)胞內(nèi)周質(zhì)間隙內(nèi)產(chǎn)生抗體，或直接分泌到培養(yǎng)液中。如果抗體產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，第一步用離心或超濾去除宿主或裂解細(xì)胞產(chǎn)生的顆粒碎片。當(dāng)抗體分泌到培養(yǎng)液中時，通?？刹捎檬惺鄣牡鞍诐饪s濾器如Amicon或MilliporePellicon超濾單元先濃縮該表達(dá)系統(tǒng)的上清液。可在上述步驟之一加入蛋白酶抑制劑如PMSF來抑制蛋白水解，可加入抗菌素來防止外來污染物的生長。
從細(xì)胞制備的抗體組合物可采用，例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化。親和層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。A蛋白用作親和配體的適用性取決于抗體中存在的免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。A蛋白可用于純化基于人γ1、γ2、或γ4重鏈的抗體(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.621-13，1983)。所有小鼠同種型和人γ3推薦用G蛋白(Guss et al.，EMBO J.51567-75，1986)。親和配體附著的基質(zhì)最常用瓊脂糖，但也可用其它基質(zhì)。機(jī)械性能穩(wěn)定的基質(zhì)如可控孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯能獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的處理時間。當(dāng)抗體含有CH3區(qū)時，可采用Bakerbond ABXTM樹脂來純化(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J)。根據(jù)要回收的抗體類型也可采用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，如離子交換柱分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅膠層析、肝素SEpHAROSETTM層析、陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬氨酸柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
本發(fā)明的優(yōu)選抗體包括Daclizumab(USAN，美國采用名)，一種人源化抗IL-2受體抗體。Daclizumab最近上市的商標(biāo)名為Zenapax，用于腎移植后預(yù)防器官排斥，經(jīng)靜脈給藥。Daclizumab也用于治療牛皮癬，為此宜采用皮下給藥途徑。為了皮下輸送抗體宜用高濃度抗體。Daclizumab是一種重組人源化單克隆抗體，屬IgGl亞類，其分子由二條相同的重鏈和二條相同的輕鏈亞基組成。二硫橋鍵連接了4條鏈。Daclizumab單體分子量約150,000道爾頓。Daclizumab能結(jié)合活化T細(xì)胞上表達(dá)的IL-2受體的p55亞基。此靶抗原稱為CD25。通過補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)，從含有重鏈和輕鏈基因的GS-NSO細(xì)胞系產(chǎn)生Daclizumab。生物反應(yīng)器收獲物經(jīng)處理去除細(xì)胞和碎片，用離子交換和凝膠過濾層析結(jié)合一系列超濾和過濾技術(shù)純化，產(chǎn)生含有95％以上單體抗體的藥物。
另一優(yōu)選抗體是抗白介素12(IL-12)抗體。IL-12是一種由抗原呈遞細(xì)胞合成的細(xì)胞因子，它含有二個亞基(p35和p40)，二者必須同時存在才有功能活性。功能性IL-12也稱為12p70。該細(xì)胞因子通過提高其增殖速率優(yōu)先作用于1型T輔助(Th1)淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。其一種下游作用是使Th1細(xì)胞分泌干擾素γ(IFNg)。這二種功能(增殖和產(chǎn)生IFNg)不難檢測，并可用于檢測樣品的IL-12活性。已報道某些抗IL-12抗體可“中和”上述活性。因?yàn)門h1細(xì)胞在各種疾病中起著中樞作用，具有中和特性的抗體應(yīng)具有潛在的治療價值。16G2(Hoffman La Roche)是一種鼠產(chǎn)生的抗IL-12p70抗體。已證明在人外周血(PBMC)活化T細(xì)胞的功能試驗(yàn)中，16G2以接近化學(xué)計量的量作用于IL-12，抑制活化T細(xì)胞的增殖。這是一種重要的特性，因?yàn)檠逯写嬖贗L-12的p40二聚體，需過量使用抗p40亞基抗體，才能中和給定量的IL-12的增殖能力。Protein Design Labs Inc.(Fremont，CA)人源化的16G2是針對HAIL-12的(人源化抗IL-12，IgGl抗體)。
另一優(yōu)選抗體是抗L-選擇蛋白抗體。已發(fā)現(xiàn)選擇蛋白如L、E和P-選擇蛋白與局部缺血和再灌注時組織損傷有關(guān)。此種聯(lián)系中中性白細(xì)胞起著重要作用。推測中性白細(xì)胞的募集需要選擇蛋白。L-選擇蛋白對于骨骼肌和肺中損傷的完全出現(xiàn)很重要(Seekamp et al.，Am.J.Pathol.11592-98，1994；Mulligan et al.，J.Immunol.151832-40，1994；)HuEP5C7(SMART抗L-選擇蛋白)是一種人源化的抗L-選擇蛋白單克隆抗體，含有突變的IgG2 Fc，可與人E-和P-選擇蛋白抗原起交叉反應(yīng)。它是Protein DesignLabs Inc.最近開發(fā)的，可用于多種疾病，如哮喘、中風(fēng)、創(chuàng)傷和某些自身免疫病。
另一優(yōu)選抗體是Flintozumab，一種抗γ-干擾素抗體。Flintozumab是Protein DesignLabs Inc.開發(fā)的一種人源化IgG1單克隆抗體，用于治療由γ-干擾素(IFN-g，一種促炎癥細(xì)胞因子)介導(dǎo)的免疫疾病。IFN-g可誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類和II類(HLA-DR)抗原的表達(dá)，提高自然殺傷細(xì)胞的溶細(xì)胞活性，活化巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)體液應(yīng)答的免疫球蛋白的同種型模式。作為淋巴因子，IFN-g也促進(jìn)1型T輔助細(xì)胞(Th1)的發(fā)育，同時抑制2型T輔助細(xì)胞(Th2)的發(fā)育。Th1/Th2比率異常意味著各種自身免疫病。
IV.制劑的制備如上所述制備了所述抗體后，即可制備含該抗體的藥物制劑。該制劑生產(chǎn)的方法如下選擇最佳溶液pH，選擇緩沖劑種類和濃度，評價各種賦形劑對液體穩(wěn)定性的作用，用I-優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(Statistics for ExperimentersAn Introduction to Design，DataAnalysis，and Model Building，Box，George E.P.et al.，John Wiley and Sons，Inc.，1978)來優(yōu)化所選賦形劑的濃度。
本發(fā)明的組合物最大程度地減少了抗體凝聚和顆粒的形成，確保抗體在用時保持其生物活性。該組合物是一種含有高濃度抗體的藥學(xué)上可接受的液態(tài)制劑，并含有中性或微酸性pH(pH5.5-6.5)的緩沖液、表面活性劑和滲透修飾劑。
該組合物中的抗體濃度高達(dá)50mg/ml或以上，優(yōu)選100mg/ml或以上。本發(fā)明的優(yōu)選組合物含有Daclizumab，一種人源化的抗IL-12受體抗體；HAIL-12，一種人源化的抗IL-12抗體；HuEP5C7，一種抗L-選擇蛋白抗體；和Flintozumab，一種人源化抗γ-干擾素抗體。
本發(fā)明組合物所用的緩沖液pH為5.5-6.5。優(yōu)選pH6.0-6.5的緩沖液。能將pH控制在此范圍的緩沖液的例子包括琥珀酸鹽(如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽和其它有機(jī)酸緩沖液。琥珀酸(pKa 5.63)是皮下注射優(yōu)選的緩沖液。組氨酸(pK5.97)次優(yōu)選因?yàn)樗子谘趸m然可通過用N2置換小瓶頂部空間或加入抗氧化劑阻止其氧化。檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖液更不優(yōu)選，因其皮下注射時引起疼痛反應(yīng)。優(yōu)選的緩沖液含有20-60mM的琥珀酸鈉。另一優(yōu)選的緩沖液是以過量N2復(fù)蓋的30-70mM組氨酸緩沖液。
抗體制劑中也可加入表面活性劑。示范性表面活性劑包括非離子表面活性劑如聚山梨酯(如聚山梨酯20，80，如Tween20，Tween80)和poloxamers(如poloxamer188)。加入的表面活性劑量應(yīng)能減少抗體制劑的凝聚，和/或最大程度減少該制劑中形成顆粒，和/或減少吸附。該制劑中存在的表面活性劑量為約0.005％-0.5％，優(yōu)選約0.01％-0.1％，更優(yōu)選約0.01％-0.05％，最優(yōu)選約0.02％-0.04％。
可將能影響該制劑等滲性的滲透修飾劑加入此組合物中。本發(fā)明所用的滲透修飾劑包括鹽和氨基酸。藥學(xué)上可接受的可用于本發(fā)明的鹽包括氯化鈉、琥珀酸鈉、硫酸鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂和氯化鈣。本發(fā)明優(yōu)選的鹽是NaCl和MgCl2。MgCl2還可保護(hù)蛋白質(zhì)避免脫酰胺而提高抗體的穩(wěn)定性。NaCl的優(yōu)選濃度為約75-150mM。MgCl2的優(yōu)選濃度為約1-100mM。藥學(xué)上可接受的可用于本發(fā)明的氨基酸包括脯氨酸、丙氨酸、L-精氨酸、天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、賴氨酸和組氨酸。本發(fā)明優(yōu)選的氨基酸是脯氨酸。脯氨酸的優(yōu)選濃度為約200mM。
該制劑中也可加入常用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)制劑的EDTA。EDTA作為螯合劑可抑制金屬催化的巰基氧化，從而減少二硫鏈凝聚物的形成。EDTA的優(yōu)選濃度為0.01-O.2％。
示范性液態(tài)組合物是含有約100mg/ml或更高濃度的抗體、約20-60mM琥珀酸鈉(pH6)、約0.01-0.1％聚山梨酯20或80、約75-150mM NaCl的制劑。此制劑保持了單克隆抗體生物活性的穩(wěn)定，并可防止給予人的免疫球蛋白最終產(chǎn)品中發(fā)生理化和生物學(xué)降解。
本發(fā)明的液態(tài)抗體制劑適宜胃腸道外給藥，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射，尤其適合皮下注射。
本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明，這不構(gòu)成將本發(fā)明限制于所述具體方法的范圍內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1 pH的優(yōu)化為了確定最佳制劑的pH范圍和確定主要的降解途徑，進(jìn)行了pH特點(diǎn)研究。用三種緩沖液pH4.0或5.0的50mM乙酸鈉緩沖液；pH5.5，6.0或6.5的50mM組氨酸；pH7.0或8.5的50mM磷酸鈉緩沖液，分別配制含5mg/ml抗IL2受體抗體(Daclizumab)的樣品制劑。將各制劑于5℃或45℃以100RPM振蕩保溫4周。於0周和4周用以下分析方法評估各樣品的理化穩(wěn)定性pH和肉眼觀察分析、340nmUV分光光度法、尺寸排阻層析(SEC-HPLC)、熒光分光光度法、動態(tài)光散射(DLS)、差示掃描量熱法(DSC)、Promega IsoQuant試驗(yàn)、毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)、SDS-PAGE(還原和非還原)和生物活性評估(ELISA)。
45℃保溫4周后對樣品進(jìn)行SEC-HPLC，顯示水解是該液態(tài)制劑的主要降解途徑。圖1A顯示不同pH水平時用SEC所發(fā)現(xiàn)的水解物百分率。中間范圍5.5-6.5pH值時，SEC測定的水解物百分率和凝聚物百分率(圖1B)均降低。
圖2顯示45℃保溫樣品4周后進(jìn)行cIEF評估不同pH水平時所得的降解百分率。PH值約5.5時降解最少。
圖3顯示45℃保溫樣品4周后用Promega IsoQuant試劑盒評估不同pH水平形成的異天冬氨酸的百分率。pH6.0或6.5時異天冬氨酸形成(脫酰胺)最少，pH8.0時急速增加。
此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH5.5-6.5，優(yōu)選pH6.0-6.5，是抗體降解和凝聚最少的優(yōu)選pH。
實(shí)施例2 緩沖液的優(yōu)選此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中含5.0mg/ml Daclizumab抗體的各制劑用pH6.0的50mM琥珀酸鈉；和pH6.0的50mM組氨酸配制，充氮?dú)饣虿怀?。不包括檸檬酸鈉緩沖液因?yàn)閳蟾嬲f皮下注射疼痛。用包被了重組人IL2α受體(IL-2 sRα)抗原的微量培養(yǎng)板和羊抗人IgG-HRP偶聯(lián)物進(jìn)行ELISA，檢測0時刻和37℃保溫4、8和12周后的生物學(xué)活性(效價)。
圖4顯示37℃保溫后不同緩沖液對不同時間效價的影響。用pH6.0 50mM琥珀酸鈉緩沖液在8周期間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了該抗體制劑的最高穩(wěn)定性。單用組氨酸的制劑由于緩沖液氧化而迅速(少于8周)失去其效價。用琥珀酸鈉緩沖液或充N2氣以預(yù)防氧化的組氨酸緩沖液配的該制劑的效價可保持在80％以上至少12周。
實(shí)施例3 篩選賦形劑目的進(jìn)行此項(xiàng)研究以篩選用于50mg/ml的Daclizumab抗體制劑的各種賦形劑。從以上(實(shí)施例1)pH優(yōu)化研究可知，該制劑在pH6.0-6.5時穩(wěn)定性最好。因此此研究中，以二種緩沖液pH6.5的50mM磷酸鹽和pH6.0的50mM琥珀酸鹽來篩選賦形劑。在5℃或45℃，以100RPM振蕩3周，監(jiān)測二種緩沖液中50mg/ml濃度的抗體穩(wěn)定性。受檢的賦形劑包括表面活性劑(Tween80和Tween20)；鹽(NaCl和MgCl2)；抗氧化劑(EDTA和甲硫氨酸)；氨基酸(甘氨酸、絲氨酸、賴氨酸和脯氨酸)；和助溶劑(甘油和乙醇)。采用不同分析技術(shù)(澄清度、pH、SEC-HPLC、UV-Vis和cIEF)來分析含賦形劑的制劑。
樣品制備Daclizumab抗體以67mM磷酸鈉溶液(不加Tween80)配成6.6mg/ml濃度，將其在Pellicon II(Millipore)單元中濃縮至約30mg/ml，然后用50ml amicon攪拌裝置(stir cell)(Millipore)將緩沖液換成二種所選緩沖液pH6.5的50mM磷酸鈉和pH6.0的50mM琥珀酸鈉。在第三步和最后一步緩沖液交換時，將該抗體濃縮至最終濃度約125mg/ml。最后，通過0.8μm膜(Uniflo)過濾此抗體，測定過濾后的蛋白質(zhì)濃度磷酸鹽緩沖液樣品為約100mg/ml；琥珀酸鈉緩沖液樣品約為97mg/ml。
表1顯示它們篩選出的賦形劑的目標(biāo)濃度。通過秤取所需量的賦形劑直接加入小瓶(如所有的氨基酸)，或配制濃的賦形劑儲備溶液制備制劑。將賦形劑加入到0.5ml合適的緩沖液中，用1N HCl或10％NaOH調(diào)節(jié)至所需的pH值，然后加入以適當(dāng)緩沖液配的0.5ml濃縮抗體溶液以獲得目標(biāo)濃度50mg/ml.。采取此法以預(yù)防因直接接觸濃賦形劑而致的蛋白降解。將1ml溶液分成兩小瓶，各0.5ml。一瓶用作初始T＝0分析，然后于2-8℃保存于3周時間點(diǎn)作2-8℃分析。另一瓶45℃ 100RPM振蕩保溫3周，結(jié)束時進(jìn)行分析。
表 1此項(xiàng)研究所用賦形劑及其濃度表#賦形劑 目標(biāo)濃度1Tween80 0.05％2EDTA0.05％3NaCl150mM4甲硫氨酸100mM5甘氨酸 200mM6絲氨酸 200mM7脯氨酸 200mM8賴氨酸 200mM9MgCl2100mM10Tween 20 0.05％11甘油 5.0％12乙醇 5.0％分析方法用各種分析技術(shù)分析二個時間點(diǎn)時的樣品。拿住樣品小管對著黑色背景在熒光燈下肉眼觀察溶液澄清度。檢查溶液中的不溶性物質(zhì)并記錄顏色變化。用二極管陣列檢測和二根串聯(lián)的Tosohaas柱作Perkin Elmer HPLC進(jìn)行尺寸排阻層析。樣品用相應(yīng)的緩沖液稀釋約5倍至濃度約1mg/ml，取100μl樣品注入此柱。以Perkin ElmerLambda Bio 40分光光度計用UV分光光度法檢測樣品濃度。
在BioRad CE(BioFocus 3000)系統(tǒng)上進(jìn)行毛細(xì)管等電聚焦分析3周時間點(diǎn)的樣品。用水將所有樣品稀釋至0.25mg/ml，用含有TEMED和二個內(nèi)部pI標(biāo)記8.4和10.1的藥物(pharmalyte)溶解液作1∶1稀釋(最終濃度為0.125mg/ml)。所用毛細(xì)管是含中性涂層的eCAP(Beckmann，56cm長，50μm ID)。
在5℃和45℃保溫3周后測定用含賦形劑Tween-80、EDTA、NaCl和MgCl2的琥珀酸鹽緩沖液所配樣品的效價。此生物試驗(yàn)包括KIT-225-K6細(xì)胞。
結(jié)果在時間點(diǎn)T＝0時，監(jiān)測24份樣品，涉及二種不同緩沖劑中的12種賦形劑。在經(jīng)3周時間后有48份樣品要分析(12種不同賦形劑量×2種溫度×2種緩沖液＝48)。試驗(yàn)包括用UV-Vis測濃度，測pH，澄清度，SEC-HPLC和ClEF。
(a)樣品澄清度表2顯示樣品外觀。二種緩沖液中的所有樣品在起始時刻T＝0時均澄清。3周后，5℃時磷酸鹽緩沖液中的所有樣品除含賴氨酸的以外均澄清。45℃時同一緩沖液中含氨基酸(甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸和賴氨酸)的樣品外觀澄清，但小瓶中有線狀漂浮物。含MgCl2的樣品有沉于瓶底的透明結(jié)晶。
琥珀酸鹽緩沖液中，除含氨基酸的制劑外，所有樣品5℃保溫3周后均澄清。含脯氨酸和賴氨酸的樣品最混濁。45℃時3周后琥珀酸鹽緩沖液中的所有樣品均澄清。
表 25℃和45℃在琥珀酸鈉(pH6.0)和磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中，T＝0和T＝4周時用熒光檢測的樣品澄清度樣品 磷酸T＝0 磷酸T-3周 磷酸T＝3周 琥珀酸T＝0 琥珀酸T＝3周 琥珀酸T＝3周澄清度 澄清度5℃ 澄清度45℃澄清度 澄清度5℃ 澄清度45℃Tween-80澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清EDTA澄清 清 澄清澄清 澄清 澄清NaCl澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清甲硫氨酸澄清 澄清澄清澄清 混濁 澄清甘氨酸 澄清 澄清澄清澄清 混濁 澄清絲氨酸 澄清 澄清澄清澄清 混濁 澄清脯氨酸 澄清 澄清澄清澄清 混濁 澄清賴氨酸 澄清 混濁澄清澄清 混濁 澄清MgCl2澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清Tween-20澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清甘油澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清乙醇澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清
(b)SEC-HPLC表3(A-C)顯示SEC-HPLC的結(jié)果。表3A表明該項(xiàng)研究檢測的所有樣品中單體的百分比。T＝0時所有樣品的單體的百分比均≥99％。三周時，二種緩沖液中5℃樣品的單體百分比未見顯著改變。然而在45℃所有樣品的單體百分比顯示輕度下降(＜5％)。用磷酸鹽緩沖液配的樣品單體百分比在94.08(甲硫氨酸)至97.29(脯氨酸)之間；而用琥珀酸鹽緩沖液配的樣品單體百分比在95.86(甲硫氨酸)至97.55(Tween-80)之間。二種緩沖液中含甲硫氨酸和甘氨酸的制劑單體百分比下降最明顯。單體百分比下降主要是由于水解物的形成。
表3B列出了此項(xiàng)研究所檢測的所有樣品中凝聚物形成的百分比。這些結(jié)果表明3周內(nèi)凝聚物形成的增加在二種緩沖液中于5℃時所有樣品都極少。45℃保溫3周后磷酸鹽緩沖液中的樣品顯示凝聚物百分率增加為0.4％(EDTA)到2.4％(甘氨酸)范圍。保溫3周后琥珀酸鹽緩沖液中凝聚物形成略低，范圍從0.7％(甲硫氨酸)至1.09％(甘氨酸)。支持這些結(jié)果的一種假設(shè)是，如果凝聚物形成是由于氧化，其在琥珀酸鹽緩沖液中較慢是由于琥珀酸鹽緩沖液的金屬螯合性能。
表3C列出了此項(xiàng)研究所檢測的所有樣品中水解物形成的百分比。起始時刻水解物的百分比范圍所有樣品為約0.2-0.4％.在5℃保溫三周，所有樣品水解物增加的百分比不顯著。在45℃觀察到水解物形成的速度明顯升高。磷酸鹽緩沖液配的樣品水解物百分比在4.7％(甲硫氨酸)至1.5％(脯氨酸、甘油和乙醇)，而琥珀酸鹽緩沖液為1.48％(Tween-80)至3.44％(甲硫氨酸)?？傊诤被岬闹苿┲杏^察到水解物形成增加。此外，水解物形成速度在磷酸鹽緩沖液中較快。這可能歸因于琥珀酸鈉和磷酸鈉緩沖液的pH差異(分別為pH6.0和6.5)，表明堿催化水解是水解物形成的主要原因。
表 3a5℃和45℃在琥珀酸鈉(pH6.0)和磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中T＝0和3周時用SEC測定的單體百分比樣品 磷酸T＝0 磷酸T-3周 磷酸T＝3周 琥珀酸T＝0 琥珀酸T＝3周 琥珀酸T＝3周單體％ 單體％5℃ 單體％45℃單體％ 單體％5℃單體％45℃Tween-8099.36 99.48 96.71 99.43 99.51 97.55EDTA99.37 99.42 96.43 99.42 99.53 97.51NaCl99.37 99.41 96.84 99.42 99.53 97.31甲硫氨酸99.42 99.42 94.08 99.47 99.53 95.86甘氨酸 99.41 99.42 95.90 99.46 99.53 96.46絲氨酸 99.41 99.45 96.15 99.45 99.53 97.29脯氨酸 99.40 99.43 97.29 99.45 99.52 97.06賴氨酸 99.34 99.62 95.45 99.45 99.57 96.28MgCl299.37 99.44 97.12 99.47 99.53 96.62Tween-2099.17 99.53 96.33 99.44 99.53 97.27甘油99.41 99.59 96.32 99.43 99.48 97.46乙醇99.41 99.42 97.24 99.31 99.19 97.42表 3B5℃和45℃在琥珀酸鈉(pH6.0)和磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中，T＝0和3周時用SEC測定的凝聚物百分比樣品 磷酸T＝0 磷酸T-3周磷酸T＝3周 琥珀酸T＝0 琥珀酸T＝3周 琥珀酸T＝3周凝聚物％ 凝聚物％5℃ 凝聚物％45℃ 凝聚物％凝聚物％5℃ 凝聚物％45℃Tween-800.410.00 1.61 0.36 0.36 0.96EDTA0.390.43 0.40 0.35 0.35 0.96NaCl0.400.43 1.23 0.33 0.34 0.85甲硫氨酸0.360.41 1.18 0.32 0.34 0.70甘氨酸 0.380.42 2.40 0.33 0.35 1.09絲氨酸 0.380.40 2.15 0.32 0.33 0.91脯氨酸 0.380.41 1.14 0.35 0.34 0.86賴氨酸 0.390.36 1.50 0.32 0.30 0.64MgCl20.380.42 0.60 0.32 0.34 0.82Tween-200.400.44 1.55 0.34 0.34 1.00甘油0.370.40 2.13 0.35 0.32 0.94乙醇0.370.43 1.26 0.28 0.38 0.91
表 3C5℃和45℃在琥珀酸鈉(pH6.0)和磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中，T＝0和3周時，用SEC測定的物百分比樣品 磷酸T＝0 磷酸T-3周磷酸T＝3周 琥珀酸T＝0 琥珀酸T＝3周 琥珀酸T＝3周水解物％ 水解物％5℃ 水解物％45℃ 水解物％ 水解物％5℃ 水解物％45℃Tween-800.21 0.52 1.670.22 0.11 1.48EDTA0.22 0.15 2.000.22 0.12 1.53NaCl0.24 0.16 1.930.21 0.12 1.85甲硫氨酸0.21 0.16 4.740.21 0.13 3.44甘氨酸 0.20 0.15 1.700.21 0.12 2.41絲氨酸 0.21 0.14 1.690.23 0.12 1.81脯氨酸 0.22 0.16 1.580.21 0.13 2.08賴氨酸 0.24 0.02 3.050.23 0.12 3.09MgCl20.21 0.14 2.280.21 0.13 2.55Tween-200.44 0.03 2.120.22 0.11 1.73甘油0.23 0.01 1.540.22 0.20 1.61乙醇0.22 0.14 1.510.41 0.40 1.67(b)毛細(xì)管電泳用BioRAD系統(tǒng)以毛細(xì)管電泳(cIEF)分析了此項(xiàng)研究的所有樣品。Daclizumab的典型cIEF圖顯示有4個峰。通常高溫時加速老化，主要的同種型峰面積下降，然后其它同種型峰上升，表明一種同種型轉(zhuǎn)變成另一種同種型。通過主要的同種型峰面積減少百分率計算出降解百分率 我們的結(jié)果表明，在45℃時，與琥珀酸鹽緩沖液(pH6.0)中的相似樣品相比，磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中的樣品降解更多。最佳載體電泳圖見于賦形劑EDTA、NaCl、賴氨酸和MgCl2。對于含Tween-80、Tween-20、絲氨酸和脯氨酸的樣品沒有計算在5℃和45℃時3周后的降解百分率，因?yàn)樗鼈兊妮d體電泳圖折疊，峰不可區(qū)別。
(c)效價根據(jù)此項(xiàng)研究結(jié)果，琥珀酸鈉緩沖液看來比磷酸鈉緩沖液更有應(yīng)用前景。因此只對琥珀酸鈉緩沖液和最穩(wěn)定的賦形劑進(jìn)行效價評估。這包括對含Tween-80、EDTA、NaCl和MgCl2的制劑進(jìn)行5℃和45℃保溫3周。結(jié)果(表4)顯示所有制劑的效價都在規(guī)格范圍內(nèi)，表明發(fā)生的化學(xué)和物理降解過程沒有顯著改變該蛋白質(zhì)的效價活性。
表4在5℃和45℃T＝3周時琥珀酸鹽緩沖液配制的一些制劑的效價測定結(jié)果樣品 pH ％效價Tween-80，5℃ 6.0 105Tween-80，45℃6.0 80EDTA，5℃ 6.0 103EDTA，45℃6.0 74NaCl，5℃ 6.0 105NaCl，45℃6.0 98MgCl2，5℃ 6.0 112MgCl2，45℃ 6.0 96討論根據(jù)此項(xiàng)研究的結(jié)果，制劑在琥珀酸鈉緩沖液(pH6.0)中的穩(wěn)定性比在磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中為高。這主要是因?yàn)樵谳^高pH6.5時堿催化的水解加速導(dǎo)致水解物形成速度加快。因此所有以下研究都選用pH6.0的琥珀酸鈉緩沖液。此項(xiàng)研究的結(jié)果也明確表明，在這二種緩沖液中，氨基酸(甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸)對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性不具有穩(wěn)定作用。如樣品澄清度數(shù)據(jù)所示，所有含氨基酸的制劑在45℃時都有不溶性凝聚物形成。
本研究選用賦形劑MgCl2是根據(jù)它可能保護(hù)蛋白質(zhì)避免脫酰胺基的推測。雖然據(jù)cIEF數(shù)據(jù)，MgCl2在磷酸鈉緩沖液中及在琥珀酸鈉緩沖液中沉淀，但MgCl2對蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定作用。乙醇也作為賦形劑包括在內(nèi)，測試它是否可通過降低溶液的介電常數(shù)穩(wěn)定蛋白質(zhì)避免脫酰胺基。然而結(jié)果不支持這個推測。最后最常用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)制劑的賦形劑Tween-80、EDTA和NaCl卻沒有顯示對二種緩沖液中的蛋白質(zhì)有任何不穩(wěn)定作用。
用pH6.0的琥珀酸鈉緩沖進(jìn)行了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)；進(jìn)一步檢驗(yàn)了賦形劑(MgCl2、Tween-80、NaCl和EDTA)對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用。結(jié)果表明用100mM NaCl配制100mg/ml的抗體，Tween-80的最佳濃度在0.02-0.03％范圍內(nèi)。結(jié)果還表明增加鹽濃度(100-150mM)能進(jìn)一步穩(wěn)定該制劑。因此有維持滲透性要求時應(yīng)使NaCl濃度最高。結(jié)果還表明，含Tween-80和NaCl的制劑的穩(wěn)定性可通過加入濃度為0.35-0.5％的EDTA而提高。在濃度范圍0-50mM內(nèi)加入MgCl2也能產(chǎn)生有利的作用。結(jié)果還表明，最穩(wěn)定制劑的賦形劑濃度為150mM NaCl，0.05％Tween-80，0.03-0.04％EDTA和60-70mM MgCl2，然而這些條件不實(shí)用，因?yàn)樗鼈儾荒芴峁┑葷B狀態(tài)。
實(shí)施例4在琥珀酸鹽緩沖液中的二種Daclizumab抗體制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)按照實(shí)施例3制備制劑1和2。
制劑1100mg/ml Daclizumab抗體、30mM琥珀酸鈉(pH6.0)、100mM NaCl和0.03％Tween-80。
制劑2與制劑1相同，另加0.05％EDTA。
在5℃、25℃和37℃，T＝0，2周，4周，8周，和12周時制劑1和2的穩(wěn)定性結(jié)果見表5。
表 5制劑1和2的穩(wěn)定性結(jié)果T＝0樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F1 澄清 98.27 0.770.96100F2 澄清 98.27 0.770.9690T＝2周樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F1-5c澄清 98.31 0.730.95NAF1-25c 澄清 98.03 0.821.14NAF1-37c 澄清 97.11 1.211.69NAF2-5c澄清 98.20 0.920.90NAF2-25c 澄清 97.90 1.091.06NA
T＝4周樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F1-5c澄清 98.30 0.740.9693F1-25c 澄清 97.80 0.921.2888F1-37c 澄清 96.20 1.772.0384F2-5C澄清 98.30 0.770.9394F2-25c 澄清 97.85 0.951.2092F2-37c 澄清 96.30 1.831.8780T＝8周樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F1-5c澄清 98.24 0.730.9596F1-25c 澄清 97.51 0.821.1496F1-37c 澄清 94.76 1.211.6990F2-5c澄清 98.34 0.780.8890F2-25c 澄清 97.42 1.201.3890F2-37c 澄清 94.63 3.062.3185T＝12周樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F1-5c澄清 98.25 0.731.0298F1-25c 澄清 97.07 1.261.6290F1-37c 澄清 93.31 3.882.8184F2-5c澄清 98.30 0.701.0094F2-25c 澄清 97.22 1.301.4888F2-37c 澄清 92.88 4.051.5482實(shí)施例5在組氨酸緩沖液中的二種Daclizumab抗體制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)按照實(shí)施例3制備制劑3和4。
制劑3100mg/ml Daclizumab抗體、50mM組氨酸(pH6.0)、115mM NaCl和0.03％Tween-80，充氮?dú)狻?br> 制劑4與制劑3相同，另加0.05％EDTA。
在5℃、25℃和37℃，T＝0，2周，4周，8周，和12周時制劑3和4的穩(wěn)定性結(jié)果見表6。
表 6制劑3和4的穩(wěn)定性結(jié)果T＝0樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F3 澄清 98.24 0.430.3379F4 澄清 98.01 0.680.3289T＝2周樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F3-5C澄清 98.24 0.380.38NDF3-25C 澄清 99.09 0.470.44NDF3-37C 澄清 98.32 1.010.67NDF4-5C澄清 99.19 0.440.37NDF4-25C 澄清 99.11 0.470.42NDF4-37C 澄清 98.41 0.930.66NDT＝4周樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F3-5C澄清 96.26 0.370.3591F3-25C 澄清 98.99 0.560.4576F3-37C 澄清 97.96 1.420.6283F4-5C澄清 99.28 0.380.3481F4-25C 澄清 99.00 0.560.4485F4-37C 澄清 97.94 1.440.6379
T＝8周樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F3-5C澄清 99.24 0.380.3886F3-25C 澄清 98.74 0.820.5482F3-37C 澄清 96.87 2.370.7675F4-5C澄清 99.23 0.390.3897F4-25C 澄清 98.71 0.750.5492F4-37C 澄清 96.90 2.340.7686T＝12周樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價F3-5C澄清 98.89 0.630.4999F3-25c 澄清 98.04 1.210.7596F3-37c 澄清 94.79 4.061.1790F4-5C澄清 98.92 0.600.4891F4-25C 澄清 98.06 1.230.7287F4-37c 澄清 95.02 3.831.1578實(shí)施例6 Daclizumab制劑在室溫保存一年的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)檢測了以30mM琥珀酸鈉(pH6.0)、100mM NaCl和0.03％Tween-80配制的100mg/ml Daclizumab液態(tài)抗體制劑在25℃保存一年后的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性結(jié)果表明該制劑在25℃穩(wěn)定至少一年。(表7)表 7Daclizumab制劑在25℃保存一年后的穩(wěn)定性結(jié)果樣品澄清度％單體％絮凝物％凝聚物 ％效價T＝0 澄清 98.27 0.770.96100T＝1年 澄清 94.32 3.142.5386實(shí)施例7 Daclizumab制劑在5℃保存18個月后的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)將以30mM琥珀酸鈉(pH6.0)、100mM NaCl和0.03％Tween-80配制的100mg/mlDaclizumab液態(tài)抗體制劑在5℃(2-8℃)保溫不同時間，測試其不同時間點(diǎn)的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性結(jié)果表明該制劑在冷藏溫度下至少可穩(wěn)定18個月。(表8)表 8Daclizumab在5℃時的穩(wěn)定性結(jié)果時間(月) ％單體 ％凝聚物0 99.0 N/A3 99.1 0.2％6 99.1 0.2％9 98.8 0.2％12 98.9 0.2％18 98.6 0.2％實(shí)施例8 HAIL-12(組氨酸緩沖液)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)以50mM組氨酸緩沖液(pH6.0)、120mM NaCl和0.03％Tween-80配制HAIL-12(抗IL-12抗體，50mg/ml)。正在進(jìn)行的穩(wěn)定性試驗(yàn)表明該制劑在5℃至少可穩(wěn)定9個月(表9)。
表 9HAIL-12在5℃時的穩(wěn)定性結(jié)果樣品 澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價T＝0澄清 99.47 0.180.3595T＝7個月澄清 98.90 0.650.45--T＝8個月------ --- --- - 100T＝9個月--- 98.52 ----- -- -實(shí)施例9 HAIL-12(琥珀酸鹽緩沖液)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)以40mM琥珀酸鈉緩沖液(pH6.0)、100mM NaCl和0.03％Tween-80配制HAIL-12(50和100mg/ml)。正在進(jìn)行的穩(wěn)定性試驗(yàn)表明該制劑在5、25和37℃至少可穩(wěn)定12周(表10和11)。
表 10不同溫度時HAIL-12(50mg/ml)的穩(wěn)定性結(jié)果T＝0樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價5℃ 澄清 99.27 0.270.4799T＝12周樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價5℃ 澄清 99.00 0.340.6710925℃ 澄清 98.05 0.921.047637℃ 澄清 93.86 4.251.9075T＝6個月樣品澄清度％單體％水解物％凝聚物％效價5℃ 澄清 98.63 0.610.769725℃ 澄清 97.1 1.671.2278表 11不同溫度時HAIL-12(10mg/ml)的穩(wěn)定性結(jié)果T＝0樣品 澄清度 ％單體 ％水解物 ％凝聚物5℃澄清99.2 0.31 0.49T＝12周樣品 澄清度 ％單體 ％水解物 ％凝聚物5℃澄清98.9 0.31 0.7825℃ 澄清97.670.95 1.3837℃ 澄清93.264.14 2.6實(shí)施例11 HuEP5C7的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)以50mM組氨酸緩沖液(pH6.0)、125mM NaCl和0.01％Tween-80配制HuEP5C7(抗L選擇蛋白抗體，50和100mg/ml)。正在進(jìn)行的穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該制劑在25℃和45℃可穩(wěn)定3個月，在5℃至少可穩(wěn)定9個月。5℃9個月穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果見表12。3個月加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表13。
表 12HuEP5C7在5℃時的穩(wěn)定性結(jié)果50mg/ml樣品％單體 ％水解物 ％凝聚物 ％效價T＝0 98.540.30 1.17 83T＝9個月 99.080 0.91 99100mg/ml樣品％單體 ％水解物 ％凝聚物 ％效價T＝0 98.560.23 1.21 79T＝9個月 98.5 0.03 1.47 90表 13HuEP5C7在不同溫度時的穩(wěn)定性結(jié)果T＝3個月樣品 ％單體 ％水解物 ％凝聚物 ％效價50mg/ml，5℃ 99.48 0.14 0.39 12150mg/ml，25℃ 98.81 0.31 0.88 7250mg/ml，45℃ 98.26 0.99 0.76 107100mg/ml，5℃ 99.03 0 0.97 93100mg/ml，25℃98.56 0.40 1.06 78100mg/ml，45℃97.88 0.92 1.20 91現(xiàn)已用完整、清楚、簡明和準(zhǔn)確的專業(yè)用語說明了本發(fā)明，以及制備及使用本發(fā)明制劑的方式和方法，從而使屬本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠制備和使用這些制劑。應(yīng)理解可對上述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行改進(jìn)，而不脫離本發(fā)明權(quán)利要求書所述的范圍。為特別指出和明確要求被看作本發(fā)明的主要內(nèi)容，此說明書以下列權(quán)利要求書結(jié)果中。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，其特征在于，該制劑含有pH約5.5-6.5的約20-60mM的琥珀酸緩沖液，約0.01％-0.1％的聚山梨酯，能增強(qiáng)該制劑等滲性的滲透修飾劑，和50mg/ml以上的抗體。
2.一種穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，其特征在于，該制劑含有pH約5.5-6.5約30-70mM的組氨酸緩沖液，約0.01％-0.1％的聚山梨酯，能增強(qiáng)該制劑等滲性的滲透修飾劑，和50mg/ml以上的抗體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的液態(tài)藥物制劑，其中所述抗體濃度高于100mg/ml。
4.如權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，其中所述滲透修飾劑是NaCl或MgCl2。
5.如權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，其中所述NaCl為75-150mM。
6.如權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，其中所述MgCl2為1-100mM。
7.如權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，其中所述pH約為6.0-6.5。
8.如權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，其中所述聚山梨酯的濃度約為0.02-0.04％。
9.如權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，所述制劑還含有0.01-0.5％的EDTA。
10.如權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，其中所述制劑在約2-8℃時可穩(wěn)定至少一年。
11.如權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的液態(tài)藥物制劑，其中所述制劑在約23-27℃時可穩(wěn)定至少6個月。
12.一種液態(tài)藥物制劑，其特征在于，該制劑含有pH約5.5-6.5的約20-60mM的琥珀酸緩沖液，約0.01％-0.05％的聚山梨酯，約75-150mM的氯化鈉和50mg/ml以上的選自Daclizumab、Flintozumab、HAIL-12和HuEP5C7的抗體。
13.一種液態(tài)藥物制劑，其特征在于，該制劑含有pH約5.5-6.5的約30-70mM的組氨酸緩沖液，約0.01％-0.05％的聚山梨酯，約75-150mM的氯化鈉和50mg/ml以上的選自Daclizumab、Flintozumab、HAIL-12和HuEP5C7的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的液體藥物制劑，該制劑含有pH約5.5－6.5的約20－60mM的琥珀酸緩沖液，或30－70mM的組氨酸緩沖液；約0.01％－0.1％的聚山梨酯(polysorbate)；和能增強(qiáng)該制劑等滲性的滲透修飾劑，以及高濃度如50mg/ml或以上的抗體。該液體制劑在冷藏溫度(2－8℃)下至少能穩(wěn)定一年，優(yōu)選二年。該液體制劑適合皮下注射。本發(fā)明的示范性抗體是Daclizumab，一種人源化抗IL－2受體單克隆抗體；HAIL－12，一種抗IL－12人源化單克隆抗體；HuEP5C7，一種抗L－選擇蛋白的人源化單克隆抗體和Flintozumab，一種抗γ干擾素的人源化單克隆抗體。
文檔編號A61K9/00GK1612689SQ02826727
公開日2005年5月4日 申請日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月8日
發(fā)明者E·A·凱舍瓦, S·古普塔, S·G·杜弗, M·薩布拉曼尼安 申請人:蛋白質(zhì)設(shè)計實(shí)驗(yàn)室股份有限公司