專利名稱：一種蒿屬花粉變應原疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于預防和治療蒿屬花粉誘發(fā)過敏性鼻炎、哮喘、變應性皮炎特異性免疫治療的疫苗及其制備方法。
背景技術：
人們對于變態(tài)反應疾病的認識始于“花粉熱”，1911年科學家noon和freeman首次利用花粉提取液來治療花粉熱，變應原疾病治療的歷史從此開始。我國變應原的發(fā)展是 1956年協(xié)和醫(yī)院耳鼻喉科主任張慶松教授從美國引進，并取得了突破性進展，發(fā)現(xiàn)了中國最重要的秋季型致敏花粉是蒿屬(Artemisia)植物花粉，為發(fā)展中國自己的變應原，實現(xiàn)變應原本土化的道路提供依據(jù)。上世紀八十年代由葉世泰、喬秉善牽頭全國數(shù)十家醫(yī)院完成的中國氣傳致敏花粉調查顯示，很多地區(qū)夏秋季空氣中花粉含量最多的為蒿屬花粉。趙京等在北京地區(qū)13 14歲兒童呼吸道過敏性疾病流行病學調查中發(fā)現(xiàn)蒿屬花粉敏感者為 5. 7%。蒿屬(Artemisia)植物為1、2或多年生草本，稀灌木，常具濃烈香氣，多有根狀頸和營養(yǎng)枝。莖多直立，部分叢生狀，有明顯縱棱；植物常被絨毛；葉互生，絕大部分羽毛狀分裂；頭狀花序小，基部常有小苞片；花異性，邊緣花雌性，中央花兩性。蒿屬的花粉特征具有高度一致性，主要體現(xiàn)在花粉呈球形或近球形，極面觀呈三裂圓形具三孔溝，赤道面觀為圓形或橢圓形。多數(shù)種的染色體數(shù)目為2n = 18，少數(shù)種的染色體數(shù)目為2n = 36。其產(chǎn)于亞洲、歐洲及北美洲的溫帶、寒溫帶及亞熱帶地區(qū)。在北美洲和歐洲主要過敏的蒿屬花粉為艾蒿花粉，我國蒿屬花粉有186種44變種，遍布全國，西北，華北，東北及西南省區(qū)最多，華東， 華中，華南略少，多生于荒坡、曠野及路旁。我國各地區(qū)對我國蒿屬花粉過敏開展大量的臨床流行病學調查，見如下段志堅《呼和浩特市過敏原分布情況及臨床分析》中顯示呼和浩特市誘導過敏性鼻炎的主要變應原為蒿屬花粉。張克生《呼和浩特地區(qū)氣傳與致敏花粉的探討》結果顯示呼和浩特地區(qū)的主要致敏花粉為蒿屬花粉。孟和寶力高《呼和浩特市區(qū)秋季過敏性鼻炎人群過敏原檢測分析》呼和浩特地區(qū)秋季主要過敏原為蒿屬植物，艾蒿花粉，對塵螨、粉塵螨過敏者占一定比例。劉光輝《武漢城區(qū)花粉癥患者主要致敏花粉的研究》；劉光輝、祝絨飛 《武漢地區(qū)蒿屬花粉分布及對過敏性鼻炎患者氣道反應性的影響》蒿屬花粉是武漢城區(qū)秋季主要致敏花粉之一。楊炯《武昌地區(qū)空氣中主要致敏花粉調查》蒿屬花粉為本地區(qū)夏秋季主要致敏花粉。董尚雄《湖北省荊門地區(qū)氣傳花粉與過敏性哮喘相關性》荊門市主要秋季致敏花粉為蒿屬花粉。張宏譽《北京市氣傳蒿屬花粉濃度調查》北京地區(qū)在蒿屬花粉臨床季節(jié)內，日平均濃度在100g/m3。趙艷《阿羅格點刺試驗在變應性鼻炎病原診斷中的應用》蒿屬花粉為荊門地區(qū)變應性鼻炎常見過敏原。曹綏平《變態(tài)反應性疾病201例致敏原分析》陜西省榆林地區(qū)主要致敏花粉為蒿屬花粉。西安醫(yī)科大學二附院呼吸內科《西安地區(qū)氣傳花粉動態(tài)的初步調查》:西安地區(qū)秋季主要致敏花粉為蒿屬花粉。山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院魏秀蘭《山西省1298例次變應原測定結果分析》蒿屬花粉為山西地區(qū)兒童哮喘變態(tài)反應原主要因素。大同市第三人民醫(yī)院變態(tài)反應科李國琴《大同地區(qū)240例花粉癥抗原皮試及臨床分析》大同地區(qū)致敏花粉源中蒿屬花粉居首。軍區(qū)蘭州總醫(yī)院變態(tài)反應室張興勇 《蘭州地區(qū)2M例變應性鼻炎皮試結果分析》；《蘭州地區(qū)87例花粉癥分析》；《空軍某部群發(fā)性變態(tài)反應性鼻炎調查報告》；蘭州軍區(qū)醫(yī)院胸內科陳琳《蘭州地區(qū)氣傳花粉初步調查》 蘭州地區(qū)主要致敏花粉為蒿屬花粉?！堵尻柺袇^(qū)360例花粉癥患者變應原分析》河南科技大學第三附屬醫(yī)院變態(tài)反應室，洛陽地區(qū)秋季誘導花粉癥和哮喘癥狀的主要致敏花粉為蒿屬花粉。十九冶醫(yī)院賀鴻珍《馬鞍山地區(qū)100例過敏性鼻炎病人的抗原及脫敏療效觀察》 馬鞍山地區(qū)過敏性鼻炎致敏原主要吸入物為室內塵土、粉塵螨、蒿屬花粉囊與多價霉菌。孫娟《氣傳致敏花粉區(qū)域性調查現(xiàn)狀》我國八大地區(qū)均有蒿屬花粉過敏。李全文《山東省三市空氣中氣傳及致敏花粉調查》山東省濟南、濰坊和煙臺主要致敏花粉為蒿屬花粉。以上蒿屬花粉流行病學調查研究顯示，蒿屬花粉過敏廣泛分布我國各個地區(qū)，在北方地區(qū)蒿屬花粉是過敏性鼻炎和哮喘主要致病因素。協(xié)和醫(yī)院變應原制備中心制備的大籽蒿花粉變應原注射液、黃花蒿花粉變應原注射液在國內各地數(shù)百家醫(yī)院使用了幾十年，有效的抑制了我國蒿屬花粉過敏性鼻炎向過敏性哮喘的轉變，有效的減輕了我國蒿屬花粉過敏性病人哮喘的癥狀。現(xiàn)在變應原特異免疫治療的方法主要分為皮下注射給藥免疫治療和舌下給藥免疫治療。皮下注射給藥免疫治療已有100年的歷史，其安全性和有效性已經(jīng)被得到證明。上世紀90年代初，變應原舌下滴劑疫苗誕生，1998年，WHO宣布了變應原舌下滴劑疫苗安全和有效。但是舌下給藥免疫脫敏的方式相比皮下注射免疫給藥，治療周期長，短時間內療效不顯著，平均脫敏周期3 5年。在一個治療周期中，舌下給藥方式免疫脫敏給藥的劑量是皮下注射給藥量的100倍。所以皮下注射給藥免疫脫敏的方式相比舌下給藥，雖然病人依從性差，但治療周期短，見效快，治療費用低。所以兩種給藥方式是相輔相成。Al(OH)3K 劑廣泛用于生物制品中，已被證明安全有效。Al (OH)3K劑是最早用于變應原疫苗中，也是目前在變應原疫苗使用最廣泛的佐劑。其跟變應原吸附，使變應原在體內緩釋，提高了治療的有效性。含有氫氧化鋁佐劑的變應原疫苗，雖然鋁鹽具有極佳的安全性和佐劑活性的追蹤記錄，但是在應用鋁鹽時仍然存在一定的問題。這些問題包括局部反應如紅斑、接觸性過敏、皮下小結、以及肉芽腫性炎癥、在實驗動物和人類中特定的和總的IgE抗體反應增加 (在某些病原情況下如過敏反應中出現(xiàn)不希望出現(xiàn)的抗體類型)。此外，已經(jīng)報道了鋁鹽作為佐劑時對某些抗原無效。也有一些研究報道，鋁鹽能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)實驗性的變性病癥。雖然仍沒有關于包括鋁的疫苗與人類的神經(jīng)變性病癥如阿爾茨海默氏疾病的發(fā)展有關臨床證據(jù)，但是已經(jīng)推定他們之間有聯(lián)系并且由此引發(fā)了廣泛的爭論。在過敏性疾病的治療過程中，不同于預防用疫苗，需要反復給藥，治療周期長達三年之久，在人體內累積的鋁含量是不可忽視的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種蒿屬花粉變應原疫苗及其制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種蒿屬花粉變應原注射用疫苗，其含有蒿屬花粉變應原和L-酪氨酸(L-tyrosine)佐劑，其中蒿屬花粉變應原為大籽蒿(Artemisia sieversiana ffilld)花粉、黃花蒿(Artemisia annua L)花粉禾口艾蒿(Artemisia argyi Levl.et Vant)花粉變應原。其中，大籽蒿花粉變應原的活性為1 1000AU/ml，黃花蒿花粉變應原的活性為 1 1000AU/ml，艾蒿花粉變應原的活性為1 1000AU/ml。其中，所述疫苗中L-酪氨酸的含量為10 40mg/ml。本發(fā)明提供的蒿屬花粉變應原注射用疫苗，其還可含有NaCl、磷酸鹽緩沖液和苯酚。疫苗中，NaCl的濃度優(yōu)選為0. 5 1%，磷酸鹽緩沖液的濃度優(yōu)選為2mM 200mM，苯酚的濃度優(yōu)選為0.2 0.5%。本發(fā)明還提供所述疫苗的制備方法，其為將大籽蒿花粉變應原液、黃花蒿花粉變應原原液、艾蒿花粉變應原原液0.5 2 0.5 2 0.5 2的活性比混合，同時加入 L-酪氨酸溶液，維持pH7. 0-8. 0，在攪拌條件下滴定至L-酪氨酸的終濃度為10 40mg/ml。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，可先將制備的蒿屬花粉變應原液進行凍干，在制備疫苗時，將獲得的蒿屬花粉變應原原液的凍干粉溶于2mM 200mM的磷酸鹽緩沖液中，得到蒿屬花粉變應原原液的復溶液，用所得的復溶液制備疫苗。本發(fā)明還提供蒿屬花粉變應原原液的制備方法如下1)通過機械(吸塵器)采集或水培法收集蒿屬花粉，然后使用200 300目網(wǎng)篩除去灰塵等雜質，并對所收集花粉進行純度檢測，形態(tài)學與分子生物學鑒定。2)將1)所得到的花粉連續(xù)用丙酮浸泡攪拌脫脂，將脫脂后的固體物自然干燥。3)將脫脂后的蒿屬花粉以投料比1 10 1 50(W V)加入50mM 500mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，4°C攪拌4 Mh。4)將提取后的提取液，6000rpm，4°C離心15min。取上清8000rpm，4°C，離心30min
后取上清。5)將提取結束后的提取液用8 μ m濾膜澄清過濾，再將粗提液經(jīng)0. 45 μ m、0. 22 μ m 濾膜依次過濾。6)將幻過濾后的提取液，用5KD超濾膜衡濾，直到濾出液上清為無色或濾出液的電導與超濾用緩沖液一致。用RSAT競爭免疫抑制法測定原液活性，其活性不低于2000AU/ ml ο本發(fā)明還提供蒿屬花粉變應原原液的凍干方法，其包括將超濾濃縮后蒿屬花粉變應原原液加入終濃度為-10%甘露醇溶液后，按照凍干工藝條件，-45°c凍結，在 lOPa-151^真空壓力下，_30°C干燥，控制水分含量彡3%。本發(fā)明的疫苗的制備方法，還可包括加入終濃度為0. 5 的NaCl和終濃度為 0. 2 0. 5%的苯酚。本發(fā)明提供的疫苗可用于制備治療過敏性疾病的藥物，其中所述的過敏性疾病選自過敏性哮喘、變應性鼻炎、過敏性皮炎和慢性蕁麻疹。本發(fā)明選用的三種蒿屬花粉變應原大籽蒿花粉變應原、黃花蒿花粉變應原和艾蒿花粉變應原是我國主要致敏的三種蒿屬花粉變應原，三種蒿屬花粉變應原存在交叉免疫性，但是在變應原組成上還是存在差異性。三種蒿屬花粉變應原聯(lián)合疫苗覆蓋了我國過敏蒿屬花粉的主要變應原，其有效性高于單一的蒿屬花粉變應原。三種蒿屬花粉變應原聯(lián)合的疫苗囊括了我國致敏蒿屬花粉的主要變應原。吸附到L-酪氨酸佐劑上，在體內起到了緩釋的作用，提高了用藥的有效性和安全性。酪氨酸是人血液中的正常組成成分，用于變應原疫苗中，相比其它佐劑，無毒副作用。變態(tài)反應疾病皮下注射免疫脫敏給藥方式，相比舌下含服滴劑給藥方式，見效快，治療周期短。本發(fā)明疫苗在整個治療周期中的給藥劑量遠小于舌下滴劑給藥劑量(約100倍)，其治療費用遠遠小于舌下滴劑給藥免疫脫敏，減輕患者的醫(yī)療負擔。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1大籽蒿花粉變應原原液的制備1)通過機械(吸塵器)采集大籽蒿花粉，然后使用300目網(wǎng)篩除去灰塵等雜質，并對所收集花粉進行純度檢測，形態(tài)學與分子生物學鑒定。2)將1)所得到的花粉以體積比1 5加入丙酮，在室溫間斷攪拌下脫脂，每次池， 脫脂后丙酮無色，將脫脂后的固體物自然干燥至無丙酮味。3)將脫脂后的大籽蒿花粉IOOOg以投料比1 25(W V)加入25000ml 200mM
pH8. 0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，4°C攪拌Mh。4)將提取后的提取液，6000rpm, 4°C，離心15min。取上清8000rpm，4°C，離心30min
后取上清。5)將提取結束后的提取液用8 μ m濾膜澄清過濾，再將粗提液經(jīng)0. 45 μ m、0. 22 μ m 濾膜依次過濾。6)將幻過濾后的提取液，用5KD超濾膜衡濾，直到濾出液上清為無色或濾出液的電導與超濾用緩沖液一致。將提取液超濾濃縮到原體積1/5，用RSAT競爭免疫抑制法測定原液活性，其活性不低于2000AU/ml。7)將超濾濃縮后原液加入終濃度為-10%甘露醇溶液后，按照凍干工藝條件，_45°C凍結，在lOPa-151^真空壓力下，_30°C干燥，控制水分含量彡3%。實施例2黃花蒿花粉變應原原液的制備1)通過機械(吸塵器)采集黃花蒿花粉，然后使用300目網(wǎng)篩除去灰塵等雜質，并對所收集花粉進行純度檢測，形態(tài)學與分子生物學鑒定。2)將1)所得到的花粉以體積比1 5加入丙酮，在室溫間斷攪拌下脫脂，每次池， 脫脂后丙酮無色，將脫脂后的固體物自然干燥至無丙酮味。3)將脫脂后的黃花蒿花粉IOOOg以投料比1 25(W V)加入25000ml 200mM
pH8. 0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，4°C攪拌Mh。 4)將提取后的提取液，6000rpm, 4°C，離心15min。取上清8000rpm，4°C，離心30min
后取上清。5)將提取結束后的提取液用8 μ m濾膜澄清過濾，再將粗提液經(jīng)0. 45 μ m、0. 22 μ m 濾膜依次過濾。6)將幻過濾后的提取液，用5KD超濾膜衡濾，直到濾出液上清為無色或濾出液的電導與超濾用緩沖液一致。將提取液超濾濃縮到原來體積的1/5，用RSAT競爭免疫抑制法測定原液活性，其活性不低于2000AU/ml。
6)將超濾濃縮后原液加入終濃度為-10%甘露醇溶液后，按照凍干工藝條件，_45°C凍結，在lOPa-151^真空壓力下，_30°C干燥，控制水分含量彡3%。實施例3 艾蒿花粉變應原原液的制備1)通過機械(吸塵器)采集艾蒿花粉，然后使用300目網(wǎng)篩除去灰塵等雜質，并對所收集花粉進行純度檢測，形態(tài)學與分子生物學鑒定。2)將1)所得到的花粉以體積比1 5加入丙酮，在室溫間斷攪拌脫脂，每次3h， 直至脫脂后上清丙酮為無色，將脫脂后的固體物自然干燥至無丙酮味后稱重。3)將脫脂后的艾蒿花粉IOOOg以投料比1 25(W V)加入25000ml200mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，4°C攪拌Mh。4)將提取后的提取液，6000rpm，4°C離心15min。取上清8000rpm，4°C離心30min
后取上清。5)將提取結束后的提取液用8 μ m濾膜澄清過濾，再降粗提液經(jīng)0. 45 μ m、0. 22 μ m 濾膜依次過濾。6)將幻過濾后的提取液，用5KD超濾膜衡濾，直到濾出液上清為無色或濾出液的電導與超濾用緩沖液一致。將提取液超濾濃縮到原來體積的1/5，用RSAT競爭免疫抑制法測定原液活性，其活性不低于2000AU/ml。7)將超濾濃縮后原液加入終濃度為-10%甘露醇溶液后，按照凍干工藝條件，_45°C凍結，在lOPa-151^真空壓力下，_30°C干燥，控制水分含量彡3%。實施例4蒿屬花粉變應原注射用疫苗的制備1)半成品的配制將大籽蒿花粉變應原凍干品、黃花蒿花粉變應原凍干品、艾蒿花粉變應原凍干品分別用50mM pH8. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液溶解配制為不低于2000AU/ml后混合，配制為不低于2000AU/ml蒿屬花粉變應原原液，將L-酪氨酸用3. 9M鹽酸溶解配制為
的酪氨酸鹽酸溶液。在15L不低于2000AU/ml的蒿屬花粉原液中加入5L1M pH8. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，在攪拌的條件下緩慢滴入5L 的L-酪氨酸鹽酸溶液和5L 3. 2M NaOH維持pH7. 0-8. 0。將生成的沉淀離心，并用磷酸氫二鈉_磷酸二氫鈉緩沖液洗滌沉淀兩次，在沉淀中添加30L PBS，配制為1000AU/ml酪氨酸佐劑蒿屬花粉變應原懸浮液。用40mg/ml L-酪氨酸佐劑懸浮液(pH7. 0-8. 0)將1000AU/ml酪氨酸佐劑蒿屬花粉變應原懸浮液依次稀釋為100AU/ml、10AU/ml、lAU/ml，添加終濃度為0. 4%的苯酚、終濃度為0. 5%的氯化鈉，最終配制成1000AU/ml、100AU/ml、10AU/ml、lAU/ml四個濃度的半成品。2)半成品分裝將檢驗合格的四個濃度的半成品，在無菌條件下分裝到IOml西林瓶中。實施例5酪氨酸佐劑蒿屬花粉變應原注射用疫苗制備過程的分步檢測1、三種蒿屬花粉變應原原液、混合后原液、半成品的檢測結果三種蒿屬花粉變應原原液、混合后的原液、均為無異物、無沉淀的澄清液體，半成品為無異物的乳白色混懸液，無菌檢查均為陰性，無異常毒素，PH7. 0-8. 0(見表1)。表1三種蒿屬花粉變應原原液、混合后原液、半成品的檢測結果
權利要求
1.一種蒿屬花粉變應原注射用疫苗，其含有蒿屬花粉變應原和L-酪氨酸佐劑，其中蒿屬花粉變應原為大籽蒿花粉、黃花蒿花粉和艾蒿花粉變應原。
2.根據(jù)權利要求1所述的疫苗，其特征在于，其中，大籽蒿花粉變應原的活性為1 1000AU/ml，黃花蒿花粉變應原的活性為1 1000AU/ml，艾蒿花粉變應原的活性為1 1000AU/ml。
3.根據(jù)權利要求1所述的疫苗，其特征在于，其中，L-酪氨酸的含量為10 40mg/ml。
4.根據(jù)權利要求1 3任一項所述的疫苗，其特征在于，其還含有NaCl、磷酸鹽緩沖液和苯酚。
5.根據(jù)權利要求4所述的疫苗，其特征在于，其中NaCl的濃度為0.5 1%，磷酸鹽緩沖液的濃度為2mM 200mM，苯酚的濃度為0. 2 0. 5%。
6.權利要求1 5任一項所述的疫苗的制備方法，其為將大籽蒿花粉變應原原液、黃花蒿花粉變應原液、艾蒿花粉變應原液以0.5 2 0.5 2 0.5 2的活性比混合，同時加入L-酪氨酸溶液，維持pH7. 0-8. 0，在攪拌條件下滴定至L-酪氨酸的終濃度為10 40mg/ml。
7.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，還包括加入終濃度為0.5 1 %的 NaCl和終濃度為0. 2 0. 5%的苯酚。
8.權利要求1 5任一項所述的疫苗在制備治療過敏性疾病的藥物中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的過敏性疾病選自過敏性哮喘、變應性鼻炎、過敏性皮炎和慢性蕁麻疹。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蒿屬花粉變應原注射用疫苗，其含有蒿屬花粉變應原和L-酪氨酸佐劑，其中蒿屬花粉變應原為大籽蒿花粉、黃花蒿花粉和艾蒿花粉變應原。其中，大籽蒿花粉變應原的活性為1～1000AU/ml，黃花蒿花粉變應原的活性為1～1000AU/ml，艾蒿花粉變應原的活性為1～1000AU/ml。本發(fā)明還提供所述疫苗的制備方法以及其在制備治療過敏性疾病的藥物中的應用。本發(fā)明選用所述的三種蒿屬花粉變應原的有效性高于單一的蒿屬花粉變應原。吸附到L-酪氨酸佐劑上，在體內起到了緩釋的作用，提高了用藥的有效性和安全性。本發(fā)明疫苗在整個治療周期中的給藥劑量遠小于舌下滴劑給藥劑量(約100倍)，其治療費用遠遠小于舌下滴劑給藥免疫脫敏，減輕患者的醫(yī)療負擔。
文檔編號A61K39/35GK102512672SQ20111043365
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權日2011年12月21日
發(fā)明者喬秉善, 何立峰, 姜敏, 湯承祁, 牛占坡, 白彩明, 裴瀟竹 申請人:北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責任公司