專利名稱：一種綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1及其編碼序列的基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學領域，尤其是一種綠臭蛙抗菌肽及編碼序列的基因與應用。
背景技術：
隨著青霉素等傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模和不恰當使用，微生物對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生了越來越強的耐受性，在臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了大量能夠完全耐受青霉素等傳統(tǒng)抗生素的微生物，已有的抗生素對這些病原微生物無能為力?？咕氖且环N新型的抗微生物多肽，大多數(shù)抗菌肽分子量小于10000 Da，帶正電，富含疏水堿基，能夠形成兩親性的結構。抗菌肽的殺菌機制主要是通過靜電相互作用吸引并結合到帶負電的細菌細胞膜表面，進一步在細菌細胞膜上形成跨膜的孔洞，導致細菌細胞內(nèi)容物的外泄，從而導致細菌細胞的死亡。而傳統(tǒng)抗生素主要是作用于細菌細胞內(nèi)的一些酶類。正是由于作用方式的不同，抗菌肽介導的殺菌作用遠遠快于傳統(tǒng)抗生素，并且不易使細菌產(chǎn)生耐受性。除此之外，越來越多的文獻報道表明抗菌肽還具有其他的殺 菌機制，如抑制細菌細胞壁合成、改變細菌細胞質(zhì)膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細胞內(nèi)酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等。兩棲動物皮膚抗菌肽具有高效、廣譜、不易產(chǎn)生耐藥性等特點。這使其在耐抗生素病原菌株大量涌現(xiàn)的今天有望成為新一代的臨床抗菌藥物。抗菌肽可以識別革蘭氏陰性菌脂多糖、革蘭氏陽性菌胞壁酸和細菌未甲基化CpG DNA等細菌信號分子，并因為其特殊的氨基酸結構、兩親性、陽離子特性及小分子特征等，可以較為容易粘附磷脂雙分子層，并以“桶-板模式”、“覆毯模式”、“膠束模式”等方式插入細菌的細胞膜，從而在細胞膜上形成穿膜孔道，引起胞內(nèi)物質(zhì)外漏，最終導致菌體的死亡。研究表明，兩棲類皮膚抗菌肽odorranain-H家族對金黃色葡萄球菌等細菌有一定得抑制效果,可通過多種不同的機制發(fā)揮作用，如有的在細菌內(nèi)形成片層樣的囊泡狀結構，有些可能導致細胞質(zhì)壁的分離，有些在細菌的膜上形成穿孔，有些則導致了細菌染色質(zhì)的固縮。因此，在醫(yī)藥領域和食品防腐具有一定的開發(fā)前景。兩棲類動物作為水生和陸生動物的中間類群，其生活環(huán)境惡劣，容易滋生各種病原微生物。為了避免微生物感染，兩棲類動物進化出強大的先天免疫系統(tǒng)，用以抵抗病原微生物的侵襲。其中抗菌肽是兩棲類動物先天免疫系統(tǒng)中的重要組分，在兩棲類動物抵御外界微生物侵襲過程中發(fā)揮了重要的作用。到目前為止，已從各種兩棲類動物中發(fā)現(xiàn)大量抗菌肽，這些抗菌肽具有不同的結構和抗菌活性，是新型多肽類抗微生物藥物開發(fā)的優(yōu)良模板庫。目前，國外對多種兩棲類抗菌肽進行了研究開發(fā)，已有多種進入臨床試驗階段。如來源于非洲爪蟾抗菌肽magainin的改造體MS1-78對糖尿病患者的足部潰瘍有顯著療效且副作用小，已進入臨床III期試驗階段。綠臭娃iRana margaratae)屬于兩棲綱無尾目娃科臭娃屬。目前關于綠臭娃形態(tài)、發(fā)育和分子進化已有報道，但是關于綠臭蛙抗菌肽的研究還沒有報道。

發(fā)明內(nèi)容
技術要求
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述蛋白的編碼序列。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述蛋白在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的應用。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:一種綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl,它是具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl為環(huán)狀多肽，含有21個氨基酸殘基，分子量為2044.58 Da，等電點為 8.90。綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基因,它是下列核苷酸之一:
(1)序列表中SEQID NO:1所不的核昔酸序列；
(2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸；
(3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl在制備抗微生物藥物中的應用。有益效果
本發(fā)明克隆得到綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基因，并利用化學合成的方法合成了 odorranain-H-OMl。該抗菌肽分子量小,對奇異變形桿菌、屎腸球菌和耐氨節(jié)青霉素大腸桿菌、光滑念珠菌具有強的殺滅作用。此外還具有低的溶血活性。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。本發(fā)明的實施例1:綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl基因克隆。I)綠臭蛙皮膚總 RNA提取:
①取300 mg綠臭蛙皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP管中，加入Iml總RNA提取緩沖液(Trizol，美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，充分混勻，而后于4°C，12000rpm 離心 10 min。②離心取上清，加入0.2 ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C，12000 rpm離心10分鐘，棄除沉淀。③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000 rpm離心10分鐘，收集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為綠臭蛙皮膚總RNA。
2)綠臭蛙皮膚cDNA文庫構建:采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(l)cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄):
①經(jīng)DEPC處理(DEPC處理是在含0.1% (V/V) DEPC的水浸泡過夜，高壓滅菌，烘干)的離心管中加入I Ul綠臭娃皮膚總RNA、1 V-1 3’端一鏈合成引物(3’In-Fusion SMARTerCDS Primer)和2.5 yl經(jīng)DEPC處理(DEPC處理是將含0.1%(V/V) DEPC的水，放置過夜，高壓滅菌)的水使總體積達到4.5 Ul，混勻后短暫離心(2000 rpm, 30 S)，離心后于72°C保溫3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵育2分鐘。②在上述離心管中加入以下試劑(均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)，2.0 u I 5 X第一鏈緩沖液、0.25 u I 100 mM DTT、1.0 u I 10 mM dNTP Mix、1.0 u I SMARTer
VOligonucleotide、。.25 U I RNase Inhibitor 和 1.0 U I SMARTScribe ReverseTranscriptase反轉(zhuǎn)錄酶,混合離心管中試劑并短暫離心(2000 rpm, 30 s),在42°C保溫90 min，然后68°C保溫10 min。保溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2 ill所合成的cDNA第一鏈備用。(2)采用長末端聚合酶鏈式反應(LD- PCR)方法擴增第二鏈(所用試劑均為CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)
①將 2 u I cDNA 第一鏈(mRNA 反轉(zhuǎn)錄)、80 U I 去離子水、10 U I IOXAdvantage 2PCR 緩沖液、2 u I 50XdNTP 混合物、2 U I 5’PCR 引物、2 u I CDS ni/3，PCR 引物以
及 2 U I 50 XAdvantage 2 Polymerase Mix 在 95°C預熱的 PCR 管中進行混合。②在PCR儀中按以下程序擴增:`
95°C, I min ;18 個循環(huán):95°C，15 sec, 65°C, 30 sec, 68°C, 6 min。循環(huán)結束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈一 80°C保存。(3)綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl基因克隆篩選:
根據(jù)蛙科抗菌肽信號肽區(qū)保守序列設計正向引物進行PCR擴增，其序列為5’ -CCAAAGATGITCACCTTGAAG-3’，PCR 另一擴增引物為 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列為S’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-S'PCR反應在如下條件下進行:94 °C 4 min,94 °C 30 sec,57°C 30 sec和72 V I min，30個循環(huán)。擴增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進行目的片段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體(Takara，大連)，轉(zhuǎn)化進CaCl2-MgCl2法制備好的DH5ci感受態(tài)細胞。涂板并進行氨芐青霉素和藍白斑雙重篩選，挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落,搖菌提取質(zhì)粒,使用Applied BiosystemsDNA sequencer, model ABI PRISM 377 進行核苷酸測序。測定結果:
編碼綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl前體的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No:1所示。綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl基因核苷酸的序列表為:序列長度為317個堿基，序列類型:核酸，鏈數(shù):單鏈，拓撲學:直鏈狀，序列種類:cDNA，來源:綠臭蛙皮膚。實施例2:綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的化學合成。1、綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl的化學合成方法:根據(jù)基因推導的成熟肽氨基酸序列，用自動多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽。I1、分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F)。II1、純化的綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl是綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl基因編碼的一種環(huán)狀多肽，含有二i 個氨基酸殘基，分子量2044.58Da,等電點8.90。綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl全序列如SEQ ID No:2所示。實施例3:綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl藥理實驗:
1、綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl抗菌活性檢測:
分別挑取保存于斜面上的試驗菌株(奇異變形桿菌、屎腸球菌、耐氨芐青霉素大腸桿菌和耐氨芐青霉素光滑念珠菌)均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術有限公司)平板上，將經(jīng)過滅菌的0.5 cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解于滅菌去離子水的2mg/ml的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl樣品溶液10 Ml,于37°C倒置培養(yǎng)18 — 20小時，觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會在濾紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明樣品抗菌活性越強。2、綠臭娃抗菌肽 O dorr ana i n-H-0M I 最小抑菌濃度(Minimum InhibitoryConcentration)測定:
試驗菌株(奇異變形桿菌、屎腸球菌、耐氨芐青霉素大腸桿菌和耐氨芐青霉素光滑念珠菌)接種到LB液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術有限公司)中，37°C振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長期，而后用新鮮LB液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的培養(yǎng)液稀釋到2 X IO5 cfu/ml待用。取1.9 mL上述稀釋的細菌培養(yǎng)液,加入經(jīng)0.22 ii m孔徑膜過濾的2 mg/ml的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl樣品溶液0.1 mL作為第一管，第一管混勻后取出I mL加入第2管中，依次倍比稀釋(參見表1)， 自第9管吸出I mL棄去，第10管系對照管。表I稀釋方法
權利要求
1.一種綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl,其特征在于:它是具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDNO:2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權利要求1所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl,其特征在于:所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl為環(huán)狀多肽，含有21個氨基酸殘基，分子量為2044.58 Da，等電點為 8.90。
3.—種如權利要求1所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基因,其特征在于:它是下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQID NO:I所不的核昔酸序列； (2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸； (3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基因,其特征在于:綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.—種如權 利要求1所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl在制備抗微生物藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1，它是具有序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQIDNO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQIDNO2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQIDNO2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明克隆得到綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的編碼基因，并利用化學合成的方法合成了odorranain-H-OM1。該抗菌肽分子量小，對奇異變形桿菌、屎腸球菌和耐氨芐青霉素大腸桿菌、光滑念珠菌具有強的殺滅作用。此外還具有低的溶血活性。
文檔編號A61K38/17GK103172723SQ20131013131
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月16日 優(yōu)先權日2013年4月16日
發(fā)明者周江, 凌桂英, 高久香, 李莉, 王義鵬 申請人:貴州師范大學