專利名稱：：一種蒲葵子多糖提取物及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥提取物,具體涉及一種蒲葵子多糖提取物制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蒲葵子，為植物棕櫚科蒲葵LivistonachinensisR.Br.(別名扇葉葵子、葵扇木子、蒲葵子)的種子。蒲葵為棕櫚科葵屬常綠喬木，一種野生或人工栽培的常綠喬木。它主產(chǎn)于福建、臺灣、廣東等地。秋冬果實成熟時采收、曬干，生用?！稁X南釆藥錄》、《廣州植物志》、《廣西中獸醫(yī)藥植》、《陸川本草》等均有收載，其性味平、淡，具有敗毒抗癌、消瘀止血之功效。研究表明已知的化學(xué)成分山萘酚-4'-甲醚、牡荊素、e—谷^醇、豆甾醇、正二十六碳醇(劉志平等，廣西植物，2007，27(1):140-142)。薯蕷皂苷元、e—胡蘿卜苷、小麥黃素、芹菜素(劉志平等，中草藥，2007,38(2):178-180)。陳屏等人首次分離得到以下五種化合物表緬茄兒茶精、表兒茶素、正三十一烷醇、去氫紫堇堿(陳屏等，中草藥，2007，38(5):665-667)。目前蒲葵子多糖的研究尚未見報道，存在物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，質(zhì)量不可控等弊端，缺乏多糖活性成分含量高，成分明確，藥效活性顯著的文獻及專利報道。而且，市面上也未見關(guān)于蒲葵子的藥物或藥物組合物的出現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種蒲葵子多糖提取物。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述蒲葵子多糖提取物的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供一種含有以上蒲葵子多糖提取物的藥物或藥物組合物。本發(fā)明還提供了含有該蒲葵子多糖提取物的制劑及該提取物的用途。本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案本發(fā)明的蒲葵子多糖提取物中主要含有多糖。其中，以重量百分比計，多糖的含量為50%以上，優(yōu)選的，多糖的含量為53%-55%。本發(fā)明所述蒲葵子多糖的制備方法，包括以下步驟(l)脫脂將自然晾干的蒲葵子粉碎后，用8~15倍量有機溶劑浸泡后回流1~3次，過濾，揮干有機溶劑得藥渣；將蒲葵子提取后的藥渣，IOO'C水煎提取，提取液過濾得濾液；(2)活性炭脫色往上述濾液中加入0.5~2.0%的活性炭，408(TC水浴保溫15~50分鐘，過濾并濃縮至總體積的1/1(M/3;(3)醇沉向上述濃縮液中加入適量乙醇，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品I;(4)除蛋白取上述多糖提取物粗品I適量溶于水中，加入適量氯仿及正丁醇，攪拌后分層，上層重復(fù)操作48次后，加入適量乙醇，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得多糖提取物粗品II;(5)除單糖及寡糖取上述多糖提取物粗品II適量溶于水中，用透析膜(截止分子量8000-14000)透析2天后，取出透析袋內(nèi)液體加入適量乙醇，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品III:(6)凝膠柱純化將上述多糖提取物粗品m用凝膠色譜柱純化，用硫酸苯酚法跟蹤餾分，收集主峰合并后，加入適量乙醇，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得蒲葵子多糖精品。本發(fā)明所述蒲葵子多糖提取物可以作為活性成分，加入藥劑學(xué)上可以接受的輔料，按照藥劑學(xué)上記載的制劑的制備方法制成制劑。本發(fā)明所述蒲葵子多糖提取物還可以作為活性成分之一，加入藥劑學(xué)上接受的輔料，按照藥劑學(xué)上記載的制劑的制備方法制成制劑。所述的制劑包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、散劑、口服劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩劑、微丸等。本發(fā)明的蒲葵子多糖提取物及其制劑可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。本發(fā)明具有的有益效果是提取精制方法是一種工藝簡單易行、提取率高、能規(guī)?；a(chǎn)。具體實施例方式下面將結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容和有益效果，該實施例僅用于說明本發(fā)明而非對本發(fā)明的限制。實施例一蒲葵子多糖提取物的制備(1)脫脂將自然晾干的蒲葵子粉碎后，用8倍量乙醇浸泡后回流2次，過濾，揮干乙醇得藥渣；將蒲葵子提取后的藥渣，加入10倍量水，10(TC水煎提取3次，每次1小時，提取液過濾得濾液；(2)活性炭脫色往上述濾液中加入0.5%的活性炭，408(TC水浴保溫20分鐘，過濾并濃縮至總體積的1/5;(3)醇沉向上述濃縮液中加入適量乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品I:(4)除蛋白取上述多糖提取物粗品I適量溶于水中，加入適量氯仿及正丁醇，攪拌后分層，上層重復(fù)操作5次后，加入適量乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得多糖提取物粗品Ih(5)除單糖及寡糖取上述多糖提取物粗品II適量溶于水中，用透析膜(截止分子量8000-14000)透析2天后，取出透析袋內(nèi)液體加入適量乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品III;(6)凝膠柱純化將上述多糖提取物粗品III用凝膠色譜柱純化，用硫酸苯酚法跟蹤餾分，收集主峰合并后，加入適量乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得蒲葵子多糖精品。苯酚硫酸法測定多糖的含量為51%。實施例二蒲葵子多糖提取物的制備(l)脫脂將自然晾干的蒲葵子粉碎后，用12倍量80%乙醇浸泡后回流2次，過濾，揮干乙醇得藥渣；將蒲葵子提取后的藥渣，加入8倍量水，IO(TC水煎提取3次，每次1小時，提取液過濾得濾液；(2)活性炭脫色往上述濾液中加入1%的活性炭，4(TC水浴保溫20分鐘，過濾并濃縮至總體積的1/3;(3)醇沉向上述濃縮液中加入適量乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品I;(4)除蛋白取上述多糖提取物粗品I適量溶于水中，加入適量氯仿及正丁醇，攪拌后分層，上層重復(fù)操作8次后，加入適量乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得多糖提取物粗品II;(5)除單糖及寡糖取上述多糖提取物粗品II適量溶于水中，用透析膜(截止分子量8000-14000)透析2天后，取出透析袋內(nèi)液體加入適量乙醇至乙醇含量為80%,置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品III;(6)凝膠柱純化將上述多糖提取物粗品m用凝膠色譜柱純化，用硫酸苯酚法跟蹤餾分，收集主峰合并后，加入適量乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得蒲葵子多糖精品。苯酚硫酸法測定多糖的含量為53%。實施例三蒲葵子多糖提取物的制備(1)脫脂將自然晾干的蒲葵子粉碎后，用8倍量80%乙醇(W/V)浸泡后回流3次，每次2小時，過濾，揮干乙醇得藥渣；將蒲葵子提取后的藥渣，加15倍量蒸餾水(W/V)，IO(TC水煎提取2小時，2次，四層紗布布氏漏斗過濾，收集濾液，合并，于60'C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至3000ml;(2)活性炭脫色往上述濾液中加入1.0%的活性炭，6(TC水浴保溫30分鐘，過濾并濃縮至總體積的1/3;(3)醇沉向上述濃縮液中加入適量無水乙醇至乙醇含量為80%，，置冰箱中冷藏過夜，出現(xiàn)絮狀沉淀，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品I;(4)除蛋白稱取上述多糖提取物粗品14.0g，溶于400ml蒸餾水中，加入CHCl390ml，正丁醇16ml，電動攪拌30分鐘，分液漏斗靜置20分鐘，分離棄去下層液，上層液重復(fù)脫蛋白操作7次。上層液加無水乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得多糖提取物粗品II;(5)除單糖及寡糖取上述多糖提取物粗品II適量溶于200ml蒸餾水中，用透析膜(截止分子量8000-14000)透析，透析袋外用磁力攪拌子勻速攪拌，每2小時換水1次，透析2天。2天后，取出透析袋內(nèi)液體加無水乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得灰白色沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品in;(6)凝膠柱純化將上述多糖提取物粗品III用DeaesepharoseFF凝膠色譜柱純化，用硫酸苯酚法跟蹤餾分，收集主峰合并后，加入適量乙醇至乙醇含量為80%，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得蒲葵子多糖精品。苯酚硫酸法測定多糖的含量為55%。實施例四抗腫瘤生物活性篩選試驗將對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞H印G-2、人白血病HL60、宮頸癌細(xì)胞Hela、人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7)用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含10%(體積百分含量)小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，并分別將各腫瘤稀釋至1.0X10s個/ml，再將其接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔200ul，于37°C，5%0)2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，然后傾去各孔培養(yǎng)液。將實施例1制得的蒲葵子多糖提取物配成終濃度為50，100，200ug/ml，同時設(shè)實驗組和空白對照組進行實驗。將以上各組的培養(yǎng)板同時置于37°C，5%<:02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天。2天后向每孔加入50ul新鮮配制的1mg/ml四甲基偶氮唑藍(MTT)溶液，并在37。C，5%0)2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h;小心棄上清，加入溶劑，充分溶解MTT還原產(chǎn)物；在酶標(biāo)儀上測定各孔在波長492nm處的光密度值(OD值)，按公式計算腫瘤細(xì)胞生長抑制率。抑制率(％)=1-(0D實驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)X100%。蒲葵子多糖提取物對人不同腫瘤細(xì)胞H印G-2、HL60、Hela、CNE_2、MCF-7的抑制作用的結(jié)果如表1所示。表1蒲葵子多糖提取物對不同癌細(xì)胞株細(xì)胞生長的影響(T±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>~~與空白對照組比較，**P〈0.01蒲葵子多糖提取物對多種腫瘤細(xì)胞的抑制作用實驗結(jié)果表明(表l)，蒲葵子多糖提取物對人肝癌細(xì)胞H印G-2、人白血病HL60、宮頸癌細(xì)胞Hela、人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7均有一定程度的抑制作用，且存在一定的量效關(guān)系。因此，蒲葵子多糖提取物可以用于制備肝癌、白血病、宮頸癌、鼻咽癌、乳腺癌的藥物。實施例五滴丸劑的制備取蒲葵子多糖提取物0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6-8'C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實施例六凍干粉針劑的制備取降香油1.5g,加入到13ml飽和的羥丙基e-環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過，濾液低溫干燥得降香油和羥丙基p-環(huán)糊精的包合物粉水。除上述降香油合羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末外，再取蒲葵子多糖提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實施例七凍干粉針劑的制備取蒲葵子多糖提取物0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml,上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。權(quán)利要求1.一種蒲葵子多糖提取物，其特征在于所述多糖提取物是以蒲葵子脫脂后的藥渣作為起始原料提取的，其中多糖的含量達50％以上；優(yōu)選的，多糖的含量為53％-55％。2.—種蒲葵子多糖提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)脫脂將自然晾干的蒲葵子粉碎后，用815倍量有機溶劑浸泡后回流13次，過濾，揮干有機溶劑得藥渣；將蒲葵子提取后的藥渣，IO(TC水煎提取，提取液過濾得濾液；(2)活性炭脫色往上述濾液中加入0.5~2.0%的活性炭，4080。C水浴保溫15~50分鐘，過濾并濃縮至總體積的1/10~1/3;(3)醇沉向上述濃縮液中加入適量乙醇，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品I;(4)除蛋白取上述多糖提取物粗品I適量溶于水中，加入適量氯仿及正丁醇，攪拌后分層，上層重復(fù)操作48次后，加入適量乙醇，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得多糖提取物粗品II;(5)除單糖及寡糖取上述多糖提取物粗品II適量溶于水中，用透析膜(截止分子量8000-14000)透析2天后，取出透析袋內(nèi)液體加入適量乙醇，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥后得多糖提取物粗品III;(6)凝膠柱純化將上述多糖提取物粗品III用凝膠色譜柱純化，用硫酸苯酚法跟蹤餾分，收集主峰合并后，加入適量乙醇，置冰箱中冷藏過夜，經(jīng)離心得沉淀，沉淀冷凍干燥，得蒲葵子多糖精品。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述歩驟(1)中的有機溶劑為石油醚，乙酸乙酯，乙醇或高濃度乙醇水溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述歩驟(1)中水煎提取加水量為4-10倍量，優(yōu)選的為8-10倍量。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述歩驟(3)-(6)中，加入乙醇后乙醇含量為60%-85%，優(yōu)選的乙醇含量為70%-85%。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟(3)-(6)中，離心轉(zhuǎn)速為3000~10000。7.—種含有蒲葵子多糖提取物的藥物，其特征在于該藥物包括一定量的蒲葵子多糖提取物與藥學(xué)上可接受的載體。8.—種含有蒲葵子多糖提取物的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物包括一定量的蒲葵子多糖提取物與其他藥物及藥學(xué)上可接受的載體。9.根據(jù)權(quán)利要求7-8所述的藥物或藥物組合物，其特征在于該藥物或藥物組合物可制成任一種藥學(xué)上可接受的制劑。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述蒲葵子多糖提取物和權(quán)利要求7-8所述的藥物或藥物組合物，其特征在于該多糖提取物或藥物或藥物組合物可在制備抗腫瘤物中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種蒲葵子多糖提取物及其制備方法與用途。該方法將蒲葵子脫脂后的藥渣，水煎提取，提取液經(jīng)活性炭脫色，過濾濃縮后醇沉，經(jīng)離心得沉淀，沉淀經(jīng)冷凍干燥得到蒲葵子多糖粗品；蒲葵子多糖粗品經(jīng)除蛋白、除單糖和寡糖、凝膠柱純化得到蒲葵子多糖精品。該多糖提取物中多糖含量在50％以上，且得到的蒲葵子多糖精品通過藥劑學(xué)上的方法，可制成各種劑型。本發(fā)明提供的蒲葵子多糖提取物經(jīng)抗腫瘤生物活性的篩選實驗，證明其對抗腫瘤具有明顯的療效，可以在制備抗腫瘤藥物或藥物組合物中應(yīng)用。文檔編號A61K36/889GK101637550SQ20091011224公開日2010年2月3日申請日期2009年7月27日優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日發(fā)明者宏姚,李光文,李少光,林新華,羅紅斌,艷陳申請人:林新華;陳艷;姚宏