專利名稱：一種具有保肝降酶作用的中藥制劑及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域,涉及以火炭母(寥科植物火炭母Polygonum chinenseL.的全草)為原料制備中藥制劑的方法，以及該中藥制劑的抗乙肝病毒和保肝降酶藥效學(xué)試
驗結(jié)果。
背景技術(shù)：
火炭母為寥科植物火炭母Polygonum chinense L.的全草。其味辛、苦, 性涼,有毒，具有清熱利濕，涼血解毒，平肝明目，活血舒筋的功效；主治痢疾，泄瀉，咽喉腫痛，白喉，百日咳，肝炎，帶下，癰腫，濕疹，角膜云翳，跌打損傷等[國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草.第2卷.上海上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999 :647-649]?；鹛磕杆幉馁Y源豐富，我國中東部與西南各省均產(chǎn)，為民間常用的的中草藥之一。有關(guān)火炭母的藥理作用，現(xiàn)有研究文獻(xiàn)報道的不多。主要有抗菌作用[胡海濱.“耐藥菌株”中草藥篩選試驗的研究.廣東醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，1990，6 (I) :40-41]、抗腫瘤[韋金育等.50種廣西常用中草藥、壯藥抗腫瘤作用的篩選研究.廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003,6(4) 3-7]和抗病毒作用[張正等.60種中草藥抗乙型肝炎病毒的實(shí)驗研究.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1988，3 (20) :211-213]。至2012年4月26日，已公開的、與火炭母有關(guān)的專利文獻(xiàn)共計45條，其中發(fā)明專利44條，全部是復(fù)方中藥制劑。以火炭母為單方開發(fā)的中藥制劑，尚未見有專利文獻(xiàn)報道。綜上所述，本發(fā)明具有充分的新穎性、創(chuàng)造性和實(shí)用性。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人從火炭母中制備一種具有保肝降酶作用的乙醇提取部位，并將這一有效部位制備成中藥制劑，這在國內(nèi)尚未見有文獻(xiàn)報道過。本發(fā)明的技術(shù)方案述及了從火炭母中提取具有保肝降酶作用的有效部位的方法、將這一有效部位制備成中藥制劑的方法、以及對這一中藥制劑進(jìn)行保肝降酶動物試驗的方法和結(jié)果?；鹛磕副８谓得赣行Р课坏奶崛》椒?，尚未見有文獻(xiàn)報道。發(fā)明人通過科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，火炭母保肝降酶的有效成分溶解于65%以上的乙醇中，因此，發(fā)明中采用65% 95%的乙醇水溶液回流提取。因醇提液中含有大量的色素和葉綠素，本發(fā)明采用D3tll樹脂脫除。提取得到的有效部位，可制備成供口服的中藥制劑，如片劑、口服液、顆粒劑等，其制法與文獻(xiàn)記載的相應(yīng)劑型的制法是通用的。有效部位與藥用輔料的重量比例范圍如下制劑中含火炭母提取物0. 1% 99. 9%，余量為藥劑成型輔料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是首次公開了從火炭母中提取保肝降酶有效部位的方法、將該有效部位制備成片劑、口服液、顆粒劑的方法、以及對該中藥制劑進(jìn)行保肝降酶動物試驗的方法和結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例子用于舉例說明本發(fā)明，并不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的任何限制。一、下面是提取保肝降酶有效部位的實(shí)施例子提取實(shí)施例一火炭母全草，曬干，打成最粗粉，用12倍量70%乙醇水溶液回流提取2次，每次2小時；合并醇提液，濾過；濾液通過D3tll大孔樹脂柱(樹脂用量為藥材重量的3倍)，收集流出液，減壓濃縮至稀膏(藥材濃縮液=2:1，W/V)。提取實(shí)施例二 火炭母全草，曬干，打成最粗粉，用15倍量85%乙醇水溶液回流提取2次，每次2小時；合并醇提液，濾過；濾液通過D3tll大孔樹脂柱(樹脂用量為藥材重量的3倍)，收集流出液，減壓濃縮至稠膏(藥材濃縮液=4 1，W/V)，稠膏烘干，打成細(xì)粉(60-80 目)。 二、下面是將有效部位制備成藥物的實(shí)施例子藥物制劑實(shí)施例一按有效部位的得率計算，取相當(dāng)于IOOOg火炭母生藥的有效部位干膏細(xì)粉，約重24g，加淀粉至總量100g，制粒，壓成片劑，素片重0. 3g，每片含火炭母生藥3g。藥物制劑實(shí)施例二 按有效部位的得率計算，取相當(dāng)于IOOOg火炭母生藥的有效部位干膏細(xì)粉，約重35g,加糖粉至總量500g,制粒,得顆粒劑,分裝,每小包5g,每小包含火炭母生藥10g。藥物制劑實(shí)施例三按有效部位的得率計算，取相當(dāng)于IOOOg火炭母生藥的有效部位稀膏，體積約500ml，加白砂糖1200g，加熱溶解，最后加水到2000ml，過濾，得口服液，分裝，每支IOml,每支含火炭母生藥5g。三、下面是藥理作用試驗方法及結(jié)果藥理實(shí)驗一對急性肝損傷的保護(hù)作用I. I分組及給藥取“藥物制劑實(shí)施例一”所得的片劑(以下稱為“火炭母片”)為實(shí)驗對象。取SPF級健康SD大鼠25只，雌雄兼用，體重為200+20g，實(shí)驗室飼養(yǎng)穩(wěn)定2d后，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、火炭母片高劑量組和火炭母片低劑量組共5組，每組5只。各組均灌胃給藥，每日I次，連續(xù)7d?；鹛磕钙邉┝拷M和低劑量組灌胃劑量分別為2. Og kg'I. Og kg_i(按生藥量算)，陽性對照組聯(lián)苯雙酯劑量為0. 05g kg'空白對照組和模型組給予等體積蒸餾水。I. 2造模及取材末次給藥Ih后，空白對照組腹腔注射等體積花生油，其余各組分別皮下注射60%四氯化碳花生油溶5mL .kg—1，禁食不禁水24h后，摘除眼球取血，血液放置lh，3000r -min^1離心3min，取上層血清，-4°C冰箱中保存，供ALT、AST、MDA、SOD等生化指標(biāo)的測定；同時取肝大葉組織于4%中性緩沖福爾馬林溶液中固定，供切片用。I. 3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析各項實(shí)驗數(shù)據(jù)均以表示，對組間比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗，以EXcel2003統(tǒng)
計軟件進(jìn)行統(tǒng)計。I. 4 結(jié)果I. 4. I血清生化指標(biāo)
與空白對照組相比，模型組血清中ALT、AST和MDA活性均顯著升高，SOD活性顯著降低，說明模型建立成功；與模型組相比，火炭母片高、低劑量組血清ALT和MDA活性均較模型組明顯降低，SOD均較模型組明顯升高，AST活性無明顯改變。血清生化指標(biāo)結(jié)果表明，火炭母片對四氯化碳致大鼠肝損傷具有保護(hù)作用，提示火炭母片對肝細(xì)胞的保護(hù)可能是通過抗自由基，抑制脂質(zhì)過氧化機(jī)制而發(fā)揮作用。見表I。表I火炭母片對四氯化碳致大鼠肝損傷血清生化指標(biāo)的影響
iaij 劑量(生藥量)ALTASTMDASOD
(g kg'1)(IU L'1)(IU-L'1) (nmol mL'1) (U mL-1)
空白對照組-10.5±7.28** 45.41±5.56** 2.76±0.42** 179.16±1.93**
模型組-254.06±18.67 164.94±28.71 4.57±0.55 173.68士1.81
陽性對照組0.0533.39±11.37** 82.24±30.55** 2.07±0.97** 178.03±1.99*
高劑量組2.0119.94±23.10** 142.24±12.28 3.26±0.47** 178.03士] .65*
低劑量組_LO_128.50士25.58** 147.41 土 15.40 3.42±0.58* 176.83±1.62
* :與模型組比較P < 0. 05，** :與模型組比較P < 0. 01。I. 4. 2組織病理觀察病理組織切片顯微鏡下觀察可見，空白對照組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀，肝細(xì)胞為多邊形，核大、核膜清晰、核仁明顯；模型組肝組織損傷嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，小葉內(nèi)肝細(xì)胞廣泛水腫、空泡狀，有點(diǎn)狀及碎片狀壞死，伴中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，病變以環(huán)中央靜脈分布為主；陽性對照組在中央靜脈周圍肝細(xì)胞輕度水腫，僅有少量小空泡狀病變；火炭母片高、低劑量組水腫程度輕微，有小空泡狀病變，無明顯組織壞死。病理組織切片結(jié)果表明，火炭母片對四氯化碳致大鼠肝損傷的肝細(xì)胞壞死程度有較大改善。(圖略)I. 5 結(jié)論火炭母醇提物對大鼠急性肝損傷具有良好保護(hù)作用。藥理實(shí)驗二體外抗乙肝病毒2. I試藥的配制含火炭母提取物試液的配制取“提取實(shí)施例二”所得的干膏l(xiāng)g，加入二甲基亞砜5OmL,配置濃度為0. 02g ^mL-1的藥液,無菌環(huán)境下用0. 22 y m的微孔濾器過濾,再用細(xì)胞培養(yǎng)液分別配制成16、8、4、2、1、0. 5mg rnL^1等6個不同濃度的藥液，置于4°C冰箱中保存，待用。PBS磷酸鹽緩沖溶液的配制取PBS磷酸緩沖鹽，用超純水配制成0. OlN(pH =7. 2 7. 4)的緩沖溶液，在無菌環(huán)境下用直徑為0. 22 y m的微孔濾器過濾，置于4°C冰箱中保存，待用。消化液的配制用PBS磷酸鹽緩沖溶液配制成0. 25%胰蛋白酶溶液，在無菌環(huán)境下用0. 22 的微孔濾器過濾，置于4°C冰箱中保存，待用。2. 2HepG2. 2. 15細(xì)胞株的復(fù)蘇與培養(yǎng)將液氮冷凍保存的H印G2. 2. 15細(xì)胞于37°C水浴融化后吸入離心管中，加入10倍量的培養(yǎng)液，混勻，IOOOr HiirT1低速離心，除去上清液，用培養(yǎng)液再清洗一次。然后將細(xì)胞株接種至培養(yǎng)瓶中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37°C、5% CO2環(huán)境下生長，視細(xì)胞生長情況每I 3d更換一次培養(yǎng)液。在長滿H印G 2. 2. 15細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，倒去培養(yǎng)液，加入0. 25 %胰酶，37°C消化3 4min，加培養(yǎng)液輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，I 3傳代。待細(xì)胞長滿后再次消化，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后，加培養(yǎng)液稀釋成濃度為I X IO4個 mL—1的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔180iiL，37°C，5% CO2培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁生長成單層后進(jìn)行實(shí)驗。2. 3藥物對細(xì)胞毒性的檢測參照Mosmann建立的MTT法[13]檢測藥物對H印G2. 2. 15細(xì)胞生長的抑制作用。細(xì)胞貼壁生長成單層后，設(shè)置分別加入藥液20 u L，使培養(yǎng)液孔內(nèi)終濃度為I. 6,0. 8,0. 4、
0.2,0. 1,0. 05,0. 025mg -L^1等7個濃度梯度組，同時設(shè)不加藥物的細(xì)胞對照組，每組重復(fù)5孔。藥物作用72h后，各孔加入MTT 20 u L并繼續(xù)培養(yǎng)4h。傾去上清液，加入PBS緩沖溶液清洗2次，倒置吸水紙上輕輕拍干，確保吸凈無殘留。每孔加入二甲基亞砜150 u 1，振蕩器上振蕩5min。用酶標(biāo)儀在490nm處測定每孔的吸光值(OD)，計算細(xì)胞破壞率(見公式I)，以及運(yùn)用藥物抑制濃度計算軟件I. 0. 0版(L0GIT法)計算藥物的半數(shù)有毒濃度TC5Q。
權(quán)利要求
1.一種中藥制劑，其特征在于以重量計，火炭母提取物在制劑中所占的比例為0.5% 99. 5%，余量為藥劑成型輔料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中藥制劑，其特征在于制備方法如下①干火炭母粗粉，用濃度為65% 95%的乙醇水溶液回流提取；②醇提液流過D3tll大孔樹脂柱，以脫除色素和葉綠素，收集流出液；③流出液回收溶劑至稀膏；④制劑的制備方法有2種第一種稀膏中加入白砂糖粉，溶解，混勻，制成口服液；第二種稀膏進(jìn)一步制成干膏，干膏打成細(xì)粉后與賦形輔料混勻，制成片劑、顆粒劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中藥制劑，其特征在于具有保肝降酶作用。
全文摘要
本發(fā)明屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種具有抗乙肝病毒和保肝降酶作用的中藥制劑，特別是一種以火炭母(蓼科植物火炭母Polygonum chinense L.的全草)的提取物制成的中藥制劑；研究結(jié)果表明，該中藥制劑能抑制HBsAg和HBeAg的分泌，并且能顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷大鼠的血清ALT和MDA，顯示出良好的保肝降酶作用。
文檔編號A61K36/704GK102697871SQ20121018399
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者張可鋒, 朱華, 王孝勛, 高雅 申請人:廣西中醫(yī)藥大學(xué)