專利名稱：人絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、其編碼序列、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及一種人絲氨酸/蘇氨酸激酶(humanserine/threoninekinase a，hSTKa)及其轉(zhuǎn)錄本hSTKc的cDNA序列。本發(fā)明還涉及由上述核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用及生產(chǎn)方法蛋白激酶的主要作用是催化蛋白質(zhì)的磷酸化，總體上包括蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，簡稱“STK”)和蛋白質(zhì)的酪氨酸激酶兩大類。蛋白激酶在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的功能，其在生物體內(nèi)主要是通過蛋白的磷酸化或者通過與起調(diào)節(jié)作用的小分子結(jié)合，在翻譯后水平上對蛋白發(fā)揮正常功能進(jìn)行調(diào)控的。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的表達(dá)受到糖皮質(zhì)激素、生長因子、細(xì)胞體積及細(xì)胞損傷等各種因素的影響。
STK在進(jìn)化上非常保守，其結(jié)構(gòu)上尤其在其催化功能語中有許多保守區(qū)域。如催化區(qū)的N端為甘氨酸富集段，該富集段附近還有一個賴氨酸，研究顯示該區(qū)與ATP的結(jié)合有關(guān)。催化區(qū)中心是保守的天冬氨酸，它與激酶的催化活性密切相關(guān)。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶廣泛存在于生物體的各個部分中，包括各種組織、器官和血清中，參與細(xì)胞發(fā)揮正常功能所必須的眾多過程，如基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白的分泌及細(xì)胞的移動和細(xì)胞器的生物合成等。
由于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在細(xì)胞生理活動中所起的基礎(chǔ)性作用，人們對其，尤其是該家族成員在人類中的表達(dá)作用情況的研究日漸廣泛和深入。1994年，Small D等人克隆了人干細(xì)胞STK-1并研究了其在正常人骨髓中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，STK-1可能是造血干細(xì)胞的生長因子受體(Proc Natl Acad Sci 1994，91(2)459-463)。1996年，Chen，H.，等人研究了人皮膚微脈管內(nèi)皮細(xì)胞STK-1基因組第九和第十個外顯子的和突變情況。1998年，Li X.等人報道克隆得到了STK-2。Brodbeck，D.，Nakatani，K.，Masure，S.，等人克隆并鑒定了了RAC-gamma serine/threonine protein kinase(Akt-3)(J.Biol.Chem.274(14)，9133-9136(1999)；Biochem.Biophys.Res.Commun.257(3)，906-910(1999)；Eur.J.Biochem.265(1)，353-360(1999)。2001年Stanchi，F(xiàn).等人在分離與酵母序列相似的人類基因時還得到了一個由603個氨基酸殘基組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，Genbank登錄號為CAA07196，進(jìn)一步證明絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶對細(xì)胞生長的必需性(Yeast，18(1)，69-80)。
然而，在本發(fā)明之前，尚沒有任何人公開過本發(fā)明所述的人絲氨酸/蘇氨酸激酶hSTKa和hSTKc。
本發(fā)明的目的之二是提供一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼一種人絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶b(humanserine/threoninekinase c，hSTKc)，它是上述hSTKa的轉(zhuǎn)錄剪切本。
本發(fā)明的目的之三是提供一種蛋白，該蛋白被命名為人絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶a(humanserine/threoninekinase a，hSTKa)。
本發(fā)明的目的之四是提供一種蛋白，該蛋白被命名為人絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶c(humanserine/threoninekinase c，hSTKc)。
本發(fā)明的目的之五是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的hSTKa和hSTKc蛋白的方法。
本發(fā)明的目的之六是提供hSTKa和hSTKc核酸序列和蛋白的應(yīng)用。
在本發(fā)明提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人hSTK蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3中所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的hSTK蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有hSTK蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有hSTK蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hSTK蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3中核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hSTK蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hSTK蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hSTK蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hSTK蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有hSTK蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中3-2009位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框3-2009位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中3-2009位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸3-2009位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸3-2009位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人hSTK相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hSTK蛋白多肽”指具有hSTK蛋白活性的SEQ IDNO.2或SEQ IDNO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人hSTK相同功能的、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括hSTK蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與本發(fā)明的hSTK DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hSTK多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含hSTK多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了hSTK多肽的可溶性片段。通常，該片段具有hSTK多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明所指的hSTK蛋白或多肽的類似物與天然hSTK多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括hSTK多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)hSTK的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有hSTK多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼hSTK的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測hSTK核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于hSTK多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對hSTK DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于hSTK基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與hSTK基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制hSTK蛋白的分子，也包括那些并不影響hSTK蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的hSTK基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的hSTK基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)hSTK或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人.In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷hSTK功能的抗體以及不影響hSTK功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用hSTK基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與hSTK基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
在本發(fā)明中，人hSTKa的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人睪丸λgt10cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物A1 CGATGACATCGACGGGGAAGGAC；A2 CAACAA GCTGCTG CAGGACCTG為正向引物；B1CAGGTCCTCATC CTCCTGGCTCG；B2 GATGGCCTC GTGGAGGT GACATG為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷，大小分別為約一千和一千一百個堿基對的片段及雜質(zhì)。去除雜質(zhì)，提高所需核苷酸片段的濃度，分別用PshAI酶切得到的片段，并連接，最后得到目的片段。
以人睪丸λgt10cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物A1CGATGACATCG ACGGGGAAGGAC；A2 CAACAA GCTGCTG CAGGACCTG為正向引物；B1CA GGTCCTCATC CTCCTGGCTCG；B2 GCTAGTG TGTCTAAGGCTGCTCG為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷，大小分別為約一千和一千三百個堿基對的片段及雜質(zhì)。去除雜質(zhì)，提高所需核苷酸片段的濃度，分別用PshAI酶切得到的片段，并連接，最后得到目的片段。
本發(fā)明的hSTKa和hSTKc是由同一DNA轉(zhuǎn)錄翻譯而來，只是在轉(zhuǎn)錄過程中由于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪切拼接方式不同，故而產(chǎn)生了不同的蛋白，但其在序列和制備方法上有很大的相似性。
用本發(fā)明的hSTKa和hSTKc蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS ranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST軟件進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與某些已鑒定的絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白家族成員(如CAA64382、JC1446和CAA07196)都有一定同源性，并且其結(jié)構(gòu)中具有絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白家族成員的特征功能域。
綜上所述，本發(fā)明的hSTKa和hSTKc屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，具有該家族成員的共同特征，即可通過胞外的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)與細(xì)胞因子接合，并通過其胞內(nèi)部分的磷酸酯酶活性將細(xì)胞因子攜帶的信號傳遞至胞內(nèi)，作用于靶分子，從而對細(xì)胞乃至生物體的生理活動提到調(diào)控作用。這些生理作用包括促進(jìn)組織生長，調(diào)控細(xì)胞的生長和增殖，激活、抑制免疫細(xì)胞，刺激造血細(xì)胞，激活炎癥反應(yīng)，防止病毒、細(xì)菌入侵等。
將本發(fā)明的hSTKa和hSTKc核苷酸或氨基酸序列與醫(yī)藥上可接受的載體相連可以制成試劑、藥物和試劑盒，以預(yù)防、診斷和治療由于hSTKa或hSTKc表達(dá)不正常而引起的疾病。
表1為hSTKa、hSTKac和CAA07196的氨基酸序列同源比較。其中，“*”表示三個序列中相應(yīng)位置上的氨基酸相同，“”表示三個序列中相應(yīng)位置上的氨基酸雖不相同但其理化性質(zhì)大致相同，“.”表示三個序列中相應(yīng)位置上的氨基酸理化性質(zhì)有一定相同性，“-″表示三個序列中相應(yīng)位置上沒有對應(yīng)的氨基酸。
(2).PCR產(chǎn)物的測序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprepPlasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后獲得全長cDNA序列，共2023bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于3-2009位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出hSTKa的氨基酸序列，共668個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
實施例2hSTKa在大腸桿菌中的表達(dá)在該實施例中，將編碼hSTKa的cDNA序列，用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hSTK a cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-CCCCGGATCCATGACA TCGACGGGGA AGG，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的hSTKa的部分編碼序列；3′端引物序列為5’TGACAAGCTTACTTTTCG GGATAATTC，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和hSTKa的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體和插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用PshAI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證hSTK的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的hSTK。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫hSTK?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘呤褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白，純化后的蛋白可以結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對含PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實施例3hSTKa在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實施例中，將編碼hSTKa的cDNA序列下列寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hSTKacDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-CCCCAAGCTTATGACA TCGACGGGGA AGG該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的hSTKa的部分編碼序列；3′端引物序列為5’-TGACGGATCCACTTTTCG GGATAATTC該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個翻譯終止子和hSTKa的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII及BamHI消化pcDNA3載體和插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用PshAI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證hSTKa的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的SuperdexG-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1MNaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實施例4hSTKc的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以人睪丸λgt10cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物A1CGATGACATCG ACGGGGAAGGAC；A2 CAACAA GCTGCTG CAGGACCTG為正向引物；B1CA GGTCCTCATC CTCCTGGCTCG；B2 GCTAGTG TGTCTAAGGCTGCTCG為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷，大小分別為約一千和一千三百個堿基對的片段及雜質(zhì)。去除雜質(zhì)，提高所需核苷酸片段的濃度，分別用PshAI酶切得到的片段，并連接，最后得到目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprepPlasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后獲得全長cDNA序列，共2223bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于3-2009位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出hSTKc的氨基酸序列，共736個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實施例5
hSTKc在大腸桿菌中的表達(dá)在該實施例中，將編碼hSTKc的cDNA序列，用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hSTKc cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-CCCCGGATCCATGACA TCGACGGGGA AGG，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的hSTKc的部分編碼序列；3′端引物序列為5’-AGTGAAGCTTAG GCTGCTCGCG GCGGGCG，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和hSTKc的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體和插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用PshAI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證hSTKc的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的hSTK。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫hSTK?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘呤褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白，純化后的蛋白可以結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對含PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例6hSTKc在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實施例中，將編碼hSTKc的cDNA序列下列寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hSTKccDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-CCCCAAGCTTATGACA TCGACGGGGA AGG該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的hSTKc的部分編碼序列；3′端引物序列為5’-AG TGGGATCCAG GCTGCTCGCG GCGGGCG該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個翻譯終止子和hSTKc的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII及BamHI消化pcDNA3載體和插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用PshAI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證hSTKc的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的SuperdexG-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例7同源比較用本發(fā)明的hSTKa和hSTKc蛋白(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4)在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDSranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST軟件進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與某些已鑒定的絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白家族成員(如CAA64382、JC1446和CAA07196)都有一定同源性，并且其結(jié)構(gòu)中具有絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)特征。
絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)特征為[LIVMFYC]-x-[HY]-x-D-[LIVMFY]-K-x(2)-N-[LIVMFYCT](3).其中，[LIVMFYC]是指從LIVMFYC其中氨基酸中任選一個，x為任意氨基酸，x(2)為任意2個氨基酸。本發(fā)明的蛋白屬于該結(jié)構(gòu)如下hSTKaRLEKTLGKGQTGLVKLGVHCVTCQKVAIKIVNREKLSESVLMKVEREIAILKLIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARKFFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPHYACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIPPDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWY(SEQ ID NO.2中19-270)；hSTKcRLEKTLGKGQTGLVKLGVHCVTCQKVAIKIVNREKLSESVLMKVEREIAILKLIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARKFFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPHYACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIPPDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWY(SEQ ID NO.4中19-270)(htttp//smart.embl-heidelberg.de/smart/show motifs.pl)綜上所述，本發(fā)明的hSTKa和hSTKc屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，具有該家族成員的共同特征，即可通過胞外的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)與細(xì)胞因子接合，并通過其胞內(nèi)部分的磷酸酯酶活性將細(xì)胞因子攜帶的信號傳遞至胞內(nèi)，作用于靶分子，從而對細(xì)胞乃至生物體的生理活動提到調(diào)控作用。這些生理作用包括促進(jìn)組織生長，調(diào)控細(xì)胞的生長和增殖，激活、抑制免疫細(xì)胞，刺激造血細(xì)胞，激活炎癥反應(yīng)，防止病毒、細(xì)菌入侵等。
本發(fā)明的hSTKa和hSTKc除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明hSTKa和hSTKc還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白，例如可將本發(fā)明hSTKa和hSTKc的N端與鼠STK的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明的hSTKa和hSTKc的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
實施例8制備抗體將本發(fā)明的hSTKa和hSTKc重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀hSTK基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
實施例9作為微矩陣的底物微矩陣，又稱為DNA芯片。通過使用一些著名的生物軟件(如LASERGENESOFTWARE(DNASTAR)，來選擇將hSTK全長cDNA、EST、或基因片段作為微矩陣的底物樣品。然后通過使用噴墨技術(shù)及一系列化學(xué)方法如射線、化學(xué)、熱力學(xué)、機(jī)械方法等把樣品固定在載體上，如玻璃上，得到芯片(Schena，M.et al.(1995)Science 270467-470；andShalon，D.et al.(1996)Genome Res.6639-645.)，形成的元件有點(diǎn)狀、條形等等。一塊典型的芯片通常含有一定數(shù)量的元件。雜交反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的探針，然后用掃描儀來檢測發(fā)生雜交反應(yīng)的元件及反應(yīng)的程度。探針與每一個芯片元件的互補(bǔ)性和結(jié)合量都可通過對掃描出的圖像的分析來判斷。
雜交結(jié)果可用于檢測出hSTKa和hSTKc基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象，理解由于hSTKa和hSTKc表達(dá)不正常引起的疾病的分子基礎(chǔ)，診斷疾病，并可改進(jìn)及監(jiān)測相關(guān)藥劑的活性。
實施例10試劑盒的制備試劑盒1它含有(1)特異性擴(kuò)增hSTKa和hSTKc的引物對和使用說明。該試劑盒還可含有或不含有將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的所需試劑。其中，該特異性引物的序列衍生自SEQ IDNO1的序列。對逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以檢測樣品中是否含有hSTKa和hSTKc的核酸序列。該試劑盒還可含有進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的其他試劑，例如緩沖液等。
此外，較佳地，至少一個所用的引物跨越了兩個外顯子，因為此時對應(yīng)于hSTKa和hSTKc的基因組序列將不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。
試劑盒2該試劑盒含有針對hSTKa和hSTKc的特異性的抗體(例如實施例5中制備的多克隆抗體，或者用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗hSTKa和hSTKc的單克隆抗體)，和使用說明。該試劑盒用于直接檢測樣品中是否存在或缺失hSTKa和hSTKc蛋白。先通過特異性免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，然后用常規(guī)技術(shù)檢測免疫復(fù)合物。
試劑盒3該試劑盒含有可特異性地與hSTKa和hSTKc的mRNA雜交的探針。它還可含有或不含有雜交緩沖液。該試劑盒通過核酸分子與hSTKa和hSTKc特異性探針之間的雜交反應(yīng)來檢測樣品中是否存在hSTKa和hSTKc的核酸分子。
試劑盒也可用于檢測出基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象，并檢測出一系列與本發(fā)明的hSTK相關(guān)的基因，從而對相關(guān)疾病的診斷、治療起輔助作用。
實例11
制成藥物本發(fā)明的hSTKa和hSTKc蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等可作為藥物，可促進(jìn)燙傷燒傷、組織切除乃至器官摘除后的傷口愈合，防止傷口感染。將本發(fā)明的hSTKa和hSTKc核酸反義鏈或hSTKa和hSTKc抗體制成試劑盒可用于減輕或輔助治療由于hSTKa和hSTKc表達(dá)量過高而導(dǎo)致的疾病，也可輔助臨床上腫瘤和癌癥的診斷，預(yù)防及治療。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
此外，本發(fā)明hSTKa和hSTKc核酸(編碼序列或反義序列)可以直接引入細(xì)胞，以提高h(yuǎn)STKa和hSTKc的表達(dá)水平或者抑制hSTKa和hSTKc的過度表達(dá)。本發(fā)明的hSTKa和hSTKc蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因hSTKa和hSTKc缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
當(dāng)本發(fā)明的hSTKa和hSTKc蛋白多肽被用作藥物時，治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
序列表<210>1<211>2032<212>核苷酸<213>人類<220><221>編碼序列<222>(3)..(2009)<223><400>1cg atg aca tcg acg ggg aag gac ggc ggc gcg cag cac gcg cag tat 47Met Thr Ser Thr Gly Lys Asp Gly Gly Ala Gln His Ala Gln Tyr1 5 10 15gtt ggg ccc tac cgg ctg gag aag acg ctg ggc aag ggg cag aca ggt95Val Gly Pro Tyr Arg Leu Glu Lys Thr Leu Gly Lys Gly Gln Thr Gly20 25 30ctg gtg aag ctg ggg gtt cac tgc gtc acc tgc cag aag gtg gcc atc 143Leu Val Lys Leu Gly Val His Cys Val Thr Cys Gln Lys Val Ala Ile35 40 45aag atc gtc aac cgt gag aag ctc agc gag tcg gtg ctg atg aag gtg 191Lys Ile Val Asn Arg Glu Lys Leu Ser Glu Ser Val Leu Met Lys Val50 55 60gag cgg gag atc gcg atc ctg aag ctc att gag cac ccc cac gtc cta 239Glu Arg Glu Ile Ala Ile Leu Lys Leu Ile Glu His Pro His Val Leu65 70 75aag ctg cac gac gtt tat gaa aac aaa aaa tat ttg tac ctg gtg cta 287Lys Leu His Asp Val Tyr Glu Asn Lys Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Leu80 85 90 95gaa cac gtg tca ggt ggt gag ctc ttc gac tac ctg gtg aag aag ggg 335Glu His Val Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Tyr Leu Val Lys Lys Gly100 105 110agg ctg acg cct aag gag gct cgg aag ttc ttc cgg cag atc atc tct 383Arg Leu Thr Pro Lys Glu Ala Arg Lys Phe Phe Arg Gln Ile Ile Ser115 120 125gcg ctg gac ttc tgc cac agc cac tcc ata tgc cac agg gat ctg aaa 431Ala Leu Asp Phe Cys His Ser His Ser Ile Cys His Arg Asp Leu Lys130 135 140cct gaa aac ctc ctg ctg gac gag aag aac aac atc cgc atc gca gac 479Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Glu Lys Asn Asn Ile Arg Ile Ala Asp145 150 155ttt ggc atg gcg tcc ctg cag gtt ggc gac agc ctg ttg gag acc agc 527Phe Gly Met Ala Ser Leu Gln Val Gly Asp Ser Leu Leu Glu Thr Ser160 165 170 175tgt ggg tcc ccc cac tac gcc tgc ccc gag gtg atc cgg ggg gag aag 575Cys Gly Ser Pro His Tyr Ala Cys Pro Glu Val Ile Arg Gly Glu Lys180 185 190tat gac ggc cgg aag gcg gac gtg tgg agc tgc ggc gtc atc ctg ttc 623Tyr Asp Gly Arg Lys Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Phe195 200 205gcc ttg ctg gtg ggg gct ctg ccc ttc gac gat gac aac ttg cga cag 671Ala Leu Leu Val Gly Ala Leu Pro Phe Asp Asp Asp Asn Leu Arg Gln210 215 220ctg ctg gag aag gtg aag cgg ggc gtg ttc cac atg ccg cac ttt atc 719Leu Leu Glu Lys Val Lys Arg Gly Val Phe His Met Pro His Phe Ile225 230 235ccg ccc gac tgc cag agt ctg cta cgg ggc atg agc gag gtg gac gcc 767Pro Pro Asp Cys Gln Ser Leu Leu Arg Gly Met Ser Glu Val Asp Ala240 245 250 255gca cgc cgc ctc acg cta gag cac att cag aaa cac ata tgg tat ata 815Ala Arg Arg Leu Thr Leu Glu His Ile Gln Lys His Ile Trp Tyr Ile260 265 270ggg ggc aag aat gag ccc gaa cca gag cag ccc att cct cgc aag gtg 863Gly Gly Lys Asn Glu Pro Glu Pro Glu Gln Pro Ile Pro Arg Lys Val275 280 285cag atc cgc tcg ctg ccc agc ctg gag gac atc gac ccc gac gtg ctg 911Gln Ile Arg Ser Leu Pro Ser Leu Glu Asp Ile Asp Pro Asp Val Leu290 295 300gac agc atg cac tca ctg ggc tgc ttc cga gac cgc aac aag ctg ctg 959Asp Ser Met His Ser Leu Gly Cys Phe Arg Asp Arg Asn Lys Leu Leu305 310 315cag gac ctg ctg tcc gag gag gag aac cag gag aag atg att tac ttc 1007Gln Asp Leu Leu Ser Glu Glu Glu Asn Gln Glu Lys Met 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表1hSTKa MTSTGKDGGAQHAQYVGPYRLEKTLGKGQTGLVKLGVHCVTCGKVAIKIVNREKLSESVLhSTKc MTSTGKDGGAQHAQYVGPYRLEKTLGKGQTGLVKLGVHCVTCQKVAIKIVNREKLSESVLCAA07196------------------------------------------------------------hSTKa MKVEREIAILKLIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARKhSTKc MKVEREIAILKLIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARKCAA07196-----------LIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARK*************************************************hSTKa FFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPHhSTKc FFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPHCAA07196FFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPH************************************************************hSTKa YACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIPhSTKc YACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIPCAA07196YACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIP************************************************************hSTKa PDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWYIGGKNEPEPEQPIPRKVQIRSLPSLEDIDPhSTKc PDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWYIGGKNEPEPEQPIPRKVQIRSLPSLEDIDPCAA07196PDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWYIGGKNEPEPEQPIPRKVQIRSLPSLEDIDP************************************************************hSTKa DVLDSMHSLGCFRDRNKLLGDLLSEEENQEKMIYFLLLDRKERYPSQEDEDLPPRNEIDPhSTKc DVLDSMHSLGCFRDRNKLLQDLLSEEENQEKMIYFLLLDRKERYPSQEDEDLPPRNEIDPCAA07196DVLDSMHSLGCFRDRNKLLQDLLSEEENQEKMIYFLLLDRKERYPSQEDEDLPPRNEIDP************************************************************hSTKa PRKRVDSPMLNRHGKRRPERKSMEVLSVTDGGSPVPARRAIEMAQHGQRSRSISGASSGLhSTKc PRKRVDSPMLNRHGKRRPERKSMEVLSVTDGGSPVPARRAIEMAQHGQRSRSISGASSGLCAA07196PRKRVDSPMLNRHGKRRPERKSMEVLSVTDGGSPVPARRAIEMAQHGQRSRSISGASSGL************************************************************hSTKa STSPLSSPRVTPHPSPRGSPLPTPKGTPVHTPKESPAGTPNPTPPSSPSVGGVPWRARLNhSTKc STSPLSSPRVTPHPSPRGSPLPTPKGTPVHTPKESPAGTPNPTPPSSPSVGGVPWRARLNCAA07196STSPLSSPRVTPHPSPRGSPLPTPKGTPVHTPKESPAGTPNPTPPSSPSVGGVPWRARLN************************************************************hSTKa SIKNSFLGSPRFHRRKLQVPTPEEMSNLTPESSPELAKKSWFGNFISLEKEEQIFVVIKDhSTKc SIKNSFLGSPRFHRRKLQVPTPEEMSNLTPESSPELAKKSWFGNFISLEKEEQIFVVIKDCAA07196SIKNSFLGSPRFHRRKLQVPTPEEMSNLTPESSPELAKKSWFGNFISLEKEEQIFVVIKD************************************************************hSTKa KPLSSIKADIVHAFLSIPSLSHSVISQTSFRAEYKATGGPAVFQKPVKFQVDITYTEGGEhSTKc KPLSSIKADIVHAFLSIPSLSHSVISQTSFRAEYKATGGPAVFQKPVKFQVDITYTEGGECAA07196KPLSSIKADIVHAFLSIPSLSHSVISQTSFRAEYKATGGPAVFQKPVKFQVDITYTEGGE************************************************************hSTKa AQKENGIYSVTFTLLSGPSRRFKRVVETIQAQLLSTHDPPAAQHLSDTTNCMEMMTGRLShSTKc AQKENGIYSVTFTLLSGPSRRFKRVVETIQAQLLSTHDPPAAQHLSDTTNCMEMMTGRLSCAA07196AQKENGIYSVTFTLLSGPSRRFKRVVETIQAQLLSTHDPPAAQHLSEPPPPAPGLSWGAG**********************************************:.. ::hSTKa KCG--------IIPKS--------------------------------------------hSTKc KCGSPLSNFFDVIKQLFSDEKNGQAAQAPSTPAKRSAHGPLGDSAAAGPGPGGDAEYPTGCAA07196LKG-------QKVATSYESSL---------------------------------------* :hSTKa ----------------hSTKc KDTAKMGPPTARREQPCAA07196----------------
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有hSTK蛋白激酶多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.1中核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列是SEQ ID NO.1中核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
5.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列是SEQ ID NO.3中核苷酸序列。
6.一種分離得到的hSTK蛋白多肽，其特征在于，它是與SEQ ID NO.2氨基酸序列有至少95％的同源性。
7.一種分離得到的hSTK蛋白多肽，其特征在于，它是具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、其活性片段或其活性衍生物。
8.如權(quán)利要求7所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
9.如權(quán)利要求6所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
10.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
11.一種用權(quán)利要求10所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
13.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
14.一種產(chǎn)生具有hSTK蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將如權(quán)利要求1至5所述的核苷酸序列連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hSTK蛋白表達(dá)載體；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hSTK蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hSTK蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hSTK蛋白活性的多肽。
15.一種能與權(quán)利要求6所述的hSTK蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
16.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
17.一種權(quán)利要求1所述DNA分子的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)或者用制造基因芯片；或者用于制備藥物。
18.一種權(quán)利要求6所述蛋白多肽的應(yīng)用，其特征在于，它應(yīng)用于篩選人絲氨酸/蘇氨酸激酶的激動劑或抑制劑；或者用于制備藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及一種人絲氨酸/蘇氨酸激酶(human serine/threonine kinase a，hSTKa)及其轉(zhuǎn)錄本hSTKc的cDNA序列。本發(fā)明還涉及由上述核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用及生產(chǎn)方法。
文檔編號A61K38/45GK1414103SQ0213649
公開日2003年4月30日 申請日期2002年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月14日
發(fā)明者余龍, 唐麗莎, 吳海, 郭金虎, 葉光明 申請人:復(fù)旦大學(xué)