專利名稱：：一種淫羊藿提取物及制備方法、制劑和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥研制領(lǐng)域，特別涉及一種淫羊藿提取物及其制備方法、制劑以及在制備腦組織保護(hù)劑的藥物中的應(yīng)用，特別是在預(yù)防和治療腦梗死、腦梗塞后遺癥等缺血性腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腦梗死俗稱中風(fēng)或腦卒中。中風(fēng)分為出血性中風(fēng)和缺血性中風(fēng)，缺血性中風(fēng)即腦梗死，它包括腦血栓形成、腦栓塞等，腦梗死在所有中風(fēng)中占70%80%，近幾年來明顯增多，且向年輕化發(fā)展。有的病人僅僅27歲，但大多數(shù)為45歲以上的中老年。腦梗死的主要病理變化是在腦動(dòng)脈硬化的基礎(chǔ)上，血管內(nèi)形成血栓，阻塞了血流，造成腦組織的缺血、缺氧和壞死，使病人出現(xiàn)偏癱、失語、偏側(cè)肢體麻木、走路不穩(wěn)、大小便失禁、精神錯(cuò)亂、癡呆、甚至成為植物人，部分腦干梗死和大面積腦梗死可致命。腦中風(fēng)是嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的常見的難治性疾病，祖國醫(yī)學(xué)將其列為"風(fēng)、癆、臌、膈"四大疑難病之首，存在著明顯三高(發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高)現(xiàn)象。根據(jù)統(tǒng)計(jì)我國每年發(fā)生腦中風(fēng)病人達(dá)200萬，發(fā)病率高達(dá)120/10萬；現(xiàn)幸存中風(fēng)病人700萬，其中450萬病人不同程度喪失勞動(dòng)力和生活不能自理，致殘率高達(dá)75%;我國每年中風(fēng)病人死亡達(dá)120萬。得過腦中風(fēng)的患者，容易復(fù)發(fā)，每復(fù)發(fā)一次，加重一次。因此，充分認(rèn)識(shí)腦中風(fēng)的嚴(yán)重性，提高腦中風(fēng)的治療與預(yù)防水平、降低腦中風(fēng)的發(fā)病率，致殘率和死亡率是醫(yī)藥研究工作者的當(dāng)務(wù)之急。淫羊藿藥用歷史悠久，來源于小檗科淫羊藿屬的多種植物。李時(shí)珍在《本草綱目》中稱其有"益精氣，堅(jiān)筋骨，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力"之功效，用于陽痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣等。目前對(duì)藥材淫羊藿的研究比較多，現(xiàn)有文獻(xiàn)大量報(bào)道它在心血管疾病的治療作用，能抑制心肌收縮力，降低心肌氧耗量，擴(kuò)張外周血管，改善微循環(huán)等；能促進(jìn)造血功能、免疫功能及骨代謝，具有抗衰老、抗腫瘤等功效。關(guān)于淫羊藿提取物制備方法的文獻(xiàn)報(bào)道也有很多，例如四川省中藥研究所黎萬壽等認(rèn)為巫山淫羊藿中淫羊藿苷的最佳工藝是"15倍量70%乙醇溶液回流提取"(《時(shí)珍國醫(yī)國藥》2000,11(11):971);陜西中醫(yī)學(xué)院王昌利等用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)箭葉淫羊藿的總黃酮水提取和醇提取工藝進(jìn)行比較，認(rèn)為水提的工藝所得的提取物的含量最高(《中成藥》1996，18(5):1-3);中國中醫(yī)研究院中藥研究所趙小妹等認(rèn)為有的人淫羊藿水提醇沉法所得淫羊藿苷含量最高(《中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志》2000，6(6):3-5);還有一些人認(rèn)為醇提后采用酸堿沉淀法比較理想則，甚至有人認(rèn)為醇提和水提效果沒有什么明顯的差異等。有關(guān)淫羊藿及其制備方法的專利也是不勝枚舉，其中主要的工藝方法有水煎-大孔樹脂分離法、醇提-大孔樹脂分離法、水煎-萃取精制法、水煎-醇沉-大孔樹脂分離等。發(fā)明專利ZL02138339.1,"具有抗骨質(zhì)疏松作用的淫羊藿總黃酮的制備方法"中所報(bào)道的淫羊藿總黃酮的分離方法是"用水提取-正丁醇萃取"。專利ZL02148571.2"治療前列腺肥大的淫羊藿提取物及其在制備藥物中的應(yīng)用"中采用的制備方法是"用60-90%的有機(jī)溶劑的水溶液提取，減壓回收后的殘留物上大孔吸附樹脂柱D101或D140，用水和乙醇梯度洗脫，收集30-85%乙醇溶液部分。"專利ZL03141371.4"淫羊藿提取物及其生產(chǎn)工藝"中記載了"淫羊藿經(jīng)過水煮后，加入乙醇醇沉(醇含量70%)，過濾后上D101大孔樹脂柱，用水、85%乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮。"還有其他一些專利文獻(xiàn)在此就不一一列舉了。總之，關(guān)于淫羊藿及淫羊藿苷的制備方法的文獻(xiàn)方法和專利方法都比較多，而且研究結(jié)果往往大相徑庭，似乎還有所矛盾?？赡苡捎谒幉钠贩N以及提取純化的目的有所不同的緣故。很難界定研究結(jié)果的優(yōu)劣，更難形成一個(gè)客觀的可以作為評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)和參考。后來的研究者更是對(duì)所述的報(bào)道疑惑重重。發(fā)明人在試圖得到高含量的淫羊藿提取物的研究過程中，按照現(xiàn)有的各種報(bào)道所述的制備方法進(jìn)行了大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，但是，按照其所述的方法并沒有得到預(yù)期的效果。經(jīng)過工藝方案的調(diào)整和創(chuàng)新，發(fā)明人終于獲得50%以上淫羊藿總黃酮提取物。利用該高效的制備方法可以穩(wěn)定地、可重復(fù)地得到較高含量的淫羊藿總黃酮和淫羊藿苷。經(jīng)過多次的藥理藥效學(xué)試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)中藥材淫羊藿提取物對(duì)缺血性腦中風(fēng)即腦梗死及其后遺癥的治療具有獨(dú)特的作用，便以此工藝制得的淫羊藿總黃酮和淫羊藿苷作為原料藥，開發(fā)成藥劑學(xué)上可以接受的藥物制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)，提供一種全新的、高效的制備高含量的淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷的方法，還提供了該提取物在藥劑學(xué)上可以接受的制劑形式以及在制備預(yù)防和治療腦中風(fēng)、中風(fēng)后遺癥及其他腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明所提供的淫羊藿提取物是將中藥材淫羊藿利用一種現(xiàn)有技術(shù)中未曾提到過的堿-醇-水系統(tǒng)作為提取溶媒，經(jīng)過提取、濃縮、純化、干燥等工藝流程精制而成的。采用該方法制得的淫羊藿提取物中淫羊藿總黃酮的含量至少可以達(dá)到65%以上，其中淫羊藿苷的含量至少在2(F。以上。本發(fā)明所提供的淫羊藿提取物是按照以下所述的工藝制備而成的U)將藥材淫羊藿粗粉，以1040倍量堿一乙醇一水溶液作為溶媒，回流提取23次，每次提取時(shí)間在12小時(shí)；(2)過濾，棄去藥渣，合并濾液，在5(TC70'C下減壓濃縮至相對(duì)密度為1.01.5的浸膏；(3)過濾，濾液中加稀酸調(diào)節(jié)pH值至中性；(4)將調(diào)過pH值后的藥液上HPD100大孔吸附樹脂柱，用水洗脫至無色后，用5%35%乙醇水溶液洗脫，棄去洗脫液；(5)再用40%80%乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液；(6)洗脫液在5(TC70。C下減壓濃縮，濃縮至比重約為1.201.40，干燥即得。在上述制備方法中，優(yōu)選20倍量0.01%碳酸鈉50%乙醇水溶液作為提取溶媒，回流提取3次，每次提取時(shí)間2小時(shí)，合并三次濾液。濾液在65'C下減壓濃縮至相對(duì)密度約為1.151.20，趁熱濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)pH至中性，通過預(yù)先處理過的HPD100大孔吸附樹脂柱，依次用水、30%乙醇、60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，回收乙醇，于7(TC減壓濃縮至相對(duì)密度為1.301.35(60°C)的稠膏，真空干燥，即得到淫羊藿總黃酮提取物，其中淫羊藿總黃酮的含量至少在65%以上，淫羊藿苷的含量至少在20%以上。本發(fā)明所述的淫羊藿提取物可以制備成藥劑學(xué)任何一種可能的藥物制劑，包括口服制劑和注射用制劑，優(yōu)選口服制劑。以淫羊藿總黃酮提取物為有效藥料，根據(jù)需要加入可行的藥用輔料，按照各種制劑常規(guī)的制備方法制成各種藥用制劑。本發(fā)明的制劑每一單位所含有效藥料為lmg1000mg。本發(fā)明所用的藥物制劑可以按照已知的方法、與一種或多種可藥用的載體或稀釋劑等一起配制。該制劑可以是口服、非腸道、直腸、鼻內(nèi)給藥的形式，也可以制成氣霧劑、吸入劑等給藥的形式?？诜苿┌ㄓ材z囊劑、軟膠囊劑、緩釋膠囊、控釋膠囊、普通片劑、口腔崩解片、含片、分散片、泡騰片、緩釋片、控釋片、顆粒劑、水丸、滴丸、蜜丸、微丸、口服液、合劑、糖漿劑等各種制劑在內(nèi)。本發(fā)明所提供的淫羊藿提取物的制備方法是發(fā)明人通過對(duì)多種現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行重復(fù)、驗(yàn)證后，由于沒有達(dá)到預(yù)期效果，從而提出的新的制備方法。按照本發(fā)明所提供的制備方法，可以確定的、可重復(fù)的、穩(wěn)定的得到高含量的淫羊藿提取物，用高效液相檢測(cè)法測(cè)得淫羊藿總黃酮的含量在65%以上，淫羊藿苷的含量在20%以上。同樣，發(fā)明人對(duì)淫羊藿藥材直接用水提或者是乙醇提取后濃縮所得的淫羊藿提取物采用上述方法檢測(cè)，其中淫羊藿總黃酮的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于50%以上的要求，淫羊藿苷的含量更是很低。除此之外，還對(duì)其他目前所知的幾種提取工藝方法進(jìn)行了重復(fù)和驗(yàn)證，并且將最終的結(jié)果進(jìn)行了一個(gè)客觀的比較，發(fā)現(xiàn)使用所述的方法很難得到50%以上淫羊藿總黃酮有效部位。以下是研究結(jié)果一覽表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>現(xiàn)有技術(shù)中淫羊藿多是用于心血管系統(tǒng)疾病的治療藥物，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用研究相對(duì)虧乏。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述的淫羊藿提取物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病特別是腦梗死具有很好的治療作用。腦梗死后其有關(guān)區(qū)域的腦組織發(fā)生嚴(yán)重的腦缺血，引起電壓依賴性Ca2+通道開放，興奮性氨基酸(EAA)增加，受體調(diào)控的Ca2+通道開放，這兩者C"2+通道的開放導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，由此觸發(fā)花生四烯酸代謝瀑布式反應(yīng)及活化氧化酶系統(tǒng)，產(chǎn)生大量自由基造成腦細(xì)胞損傷。根據(jù)近年研究發(fā)現(xiàn)的腦梗死病理生理機(jī)制的新理論認(rèn)為其與損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，它主要包括興奮性毒性、周圍去極化、炎癥、程序性細(xì)胞死亡等四種具體機(jī)制。這四種機(jī)制往往是相互因果、相互影響，在發(fā)生的時(shí)間上有重疊和互相聯(lián)系。它與經(jīng)典認(rèn)識(shí)(血供中斷二無底物二無能量=細(xì)胞死亡)不同。損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)認(rèn)為腦缺血后，引起能量缺乏、興奮性氨基酸(EAA)從細(xì)胞內(nèi)釋放，使細(xì)胞外興奮性氨基酸(谷氨酸)濃度很快增加，導(dǎo)致突觸后的谷氨酸過度激活受體，使Ca2+內(nèi)流或從細(xì)胞內(nèi)的鈣庫釋放，激活大量的酶引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。某些酶導(dǎo)致氧自由基(0FR)產(chǎn)生，它本身也作為第二信使，損害細(xì)胞蛋白質(zhì)、糖、脂肪酸等。細(xì)胞進(jìn)一步去極化釋放鉀，細(xì)胞外鉀引起去極化擴(kuò)散即梗死周圍去極化(PID)。氧自由基和其他信使激活炎性細(xì)胞因子和酶，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。炎癥本身產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致惡性循環(huán)。氧自由基損傷DNA，進(jìn)而和其他機(jī)制一起導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。級(jí)聯(lián)反應(yīng)在缺血的數(shù)秒內(nèi)即發(fā)生，可持續(xù)數(shù)周。級(jí)聯(lián)反應(yīng)都以興奮性毒性開始。對(duì)谷氨酸介導(dǎo)損傷的一種解釋是由于梗死周圍擴(kuò)散抑制樣的去極化引起缺氧所致。PID是從缺血灶中心被觸發(fā)而擴(kuò)散到梗死周圍附近(半暗區(qū))。缺血半暗區(qū)是無灌注的中心(壞死區(qū))和正常組織間的移行區(qū)，該區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在但功能受損。半暗區(qū)不是靜止的，隨時(shí)間和治療其大小發(fā)生改變。梗死區(qū)可擴(kuò)展到半暗區(qū)，成功的治療可縮小半暗區(qū)的范圍。半暗區(qū)是興奮性毒性、梗死周圍去極化、炎癥、凋亡起作用的地方，也是治療的主要著眼點(diǎn)。半暗區(qū)最初損害表現(xiàn)為功能障礙，它和缺血造成的代謝紊亂有關(guān)。當(dāng)血流速度下降時(shí)，首先是蛋白質(zhì)合成抑制，繼為厭氧糖酵解、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和能量代謝紊亂，最后是缺氧去極化，加重局部缺血損傷，這提示治療性的抑制去極化可減小梗死面積。炎癥是由級(jí)聯(lián)反應(yīng)大量細(xì)胞毒性成分誘導(dǎo)的氧自由基和其他介質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞因子和致炎癥酶原產(chǎn)生的結(jié)果。細(xì)胞因子作用于內(nèi)皮細(xì)胞受體，吸引白細(xì)胞并誘導(dǎo)它們移至腦。而再灌注時(shí)中性粒細(xì)胞的損傷機(jī)制可能有以下幾種(1)由于缺血組織局部產(chǎn)生的趨化因子使中性粒細(xì)胞相缺血區(qū)浸潤；活化的中性粒細(xì)胞可釋放出多種毒性產(chǎn)物和破壞性的蛋白酶，其中被確認(rèn)具有介導(dǎo)損傷作用的有髓過氧化物酶、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶等，直接造成組織損傷。(2)缺血再灌注中的中性粒細(xì)胞粘附、集聚所產(chǎn)生的血流變學(xué)效應(yīng)可加重組織損傷。(3)激活的中性粒細(xì)胞可釋放TOF(腫瘤壞死因子)、IL-6(白細(xì)胞介素-6)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面粘附分子暴露，兩者親和力增強(qiáng)。而黏附的中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步被激活，自身合成和釋放更多的具有趨化作用的炎性介質(zhì)，使白細(xì)胞的浸潤進(jìn)一步加重。(4)再灌注時(shí)組織重新獲得02的供應(yīng)，激活的中性粒細(xì)胞耗氧量顯著增加，產(chǎn)生大量氧自由基，造成細(xì)胞損傷。由此可以看出白細(xì)胞介導(dǎo)的微血管損傷和細(xì)胞氧化損傷在缺血再灌注損傷的發(fā)病中起著重要作用。所以研究表明抑制炎癥反應(yīng)可能也是新的治療腦梗死的對(duì)策。腦缺血觸發(fā)的另一類型細(xì)胞死亡是程序性死亡(PCD)，其中包括凋亡。當(dāng)細(xì)胞接受導(dǎo)致凋亡的"信號(hào)"時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)被激活，引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)殺死細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在再灌注半小時(shí)即出現(xiàn)，以2448h凋亡細(xì)胞數(shù)最多，且可持續(xù)四周之久，主要分布于梗死灶邊緣區(qū)內(nèi)層。凋亡是腦損傷的動(dòng)態(tài)進(jìn)行過程，參與缺血后梗塞的發(fā)展。急性缺血的中心神經(jīng)細(xì)胞以壞死為主，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞的快速死亡，成為不可逆性死亡。本發(fā)明所提供的淫羊藿總黃酮不但能夠顯著改善腦缺氧狀態(tài)，對(duì)缺血性腦組織的再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，降低血小板聚集，抑制腦血栓生成等的作用，更重要的是可以抑制ATP酶和腺苷酸環(huán)化酶的活性，減少ATP的分解，改善腦細(xì)胞的能量平衡，提高腦細(xì)胞對(duì)氧和葡萄糖的利用率與代謝，使神經(jīng)原的能量增加，電位活力和微循環(huán)改善，改善神經(jīng)功能障礙；直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺和5-羥色胺受體，增強(qiáng)突觸前神經(jīng)末梢釋放遞質(zhì)和突觸后受體的剌激作用，改善神經(jīng)傳遞功能；能阻斷a-受體，緩解血管痙攣，降低血管阻力，因而增加腦組織的血流供應(yīng)和對(duì)氧的利用。本發(fā)明所述的淫羊藿提取物及其各種制劑可以用于制備預(yù)防和治療腦梗死及其后遺癥的藥物中的應(yīng)用。和現(xiàn)有技術(shù)相比，本品具有以下優(yōu)勢(shì)(1)含量高。和現(xiàn)有技術(shù)相比，作為開發(fā)中藥五類新藥的原料藥的本發(fā)明所提供的淫羊藿提取物中淫羊藿總黃酮的含量達(dá)到65%以上，淫羊藿苷的含量達(dá)到20%以上。本發(fā)明突破了現(xiàn)有技術(shù)中所采用的提取溶媒非水即醇的慣性思維，而是選擇水一堿一醇溶媒系統(tǒng)，經(jīng)過多次的工藝優(yōu)化，最終確定了最佳的工藝流程。由于淫羊藿有效成分大部分是含有羥基(酸性)的黃酮類成分及其聚合物，僅是以水或者是醇來提取，勢(shì)必有一些聚合物不能在水或醇里充分溶解，從而造成提取不完全，有效物質(zhì)含量隨之降低的后果。發(fā)明人以水一堿一醇作為提取溶媒，則可以很好的解決這一問題。不但可以使溶于醇溶液的物質(zhì)大量釋放，還可以將其中大量的酸性聚合物在堿溶液中水解，從而使藥材中的有效物質(zhì)能夠盡可能完全溶解而被提取出來。這樣不但提高了有效物質(zhì)淫羊藿總黃酮的含量，而且使一些聚合物水解，轉(zhuǎn)化成淫羊藿苷，提高了淫羊藿苷的含量。經(jīng)過大孔樹脂精制的淫羊藿提取物中，淫羊藿總黃酮的含量在65%以上，淫羊藿苷的含量在20%以上。這充分說明了本發(fā)明所采用的水一堿一醇系統(tǒng)的溶媒在淫羊藿的提取工藝上展示了突出的創(chuàng)造性和進(jìn)步性，同時(shí)使得淫羊藿提取物具有不同于現(xiàn)有技術(shù)的新穎性。(2)作用機(jī)理獨(dú)特。缺血性腦損傷的病理機(jī)制非常復(fù)雜，有多個(gè)病理環(huán)節(jié)參與，是一個(gè)多基因和多靶點(diǎn)參與的過程。本品獨(dú)特的作用機(jī)理表現(xiàn)在它對(duì)腦梗死從多方面、多靶點(diǎn)起作用，不但能夠擴(kuò)張腦血管、抑制血小板聚集、抑制血栓形成，而且可以重構(gòu)腦缺血區(qū)微循環(huán)、挽救半暗帶，減輕興奮性氨基酸的毒性作用，減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)血腦屏障保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)、提高能量利用、恢復(fù)腦細(xì)胞能量代謝、改善神經(jīng)傳遞功能，從而明顯地改善臨床癥狀，提高生存率，降低致殘程度。(3)安全性高。本品源于天然植物，安全性很好，副反應(yīng)低，腦梗死等缺血性腦卒中的各個(gè)治療階段都可以使用。綜上所述，本品經(jīng)整體動(dòng)物、細(xì)胞和分子生物學(xué)等水平深入研究，證明主要有以下藥理活性1、改善腦缺血軟腦膜微循環(huán)障礙作用，重構(gòu)缺血區(qū)微循環(huán)，挽救半暗帶，顯著縮小腦梗塞面積；2、提高能量利用，恢復(fù)腦能量代謝；3、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的毒性作用和糾正神經(jīng)遞質(zhì)的異常，從而改善神經(jīng)傳遞功能；4、阻斷自由基連鎖反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；5、調(diào)節(jié)氨基酸代謝，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載；6、抑制細(xì)胞凋亡，抑制腦電活動(dòng)，抑制神經(jīng)元受損；7、增強(qiáng)血腦屏障保護(hù)，保持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性8、抗血栓的形成和抗血小板凝聚作用；9、擴(kuò)張腦血管、增加腦血流量；10、改善局部腦缺血所致記憶障礙；11、對(duì)易感型自發(fā)性高血壓腦卒、腦血管癡呆等疾病有預(yù)防和治療作用。以下將以藥理、藥效實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡釋和說明。1、本品對(duì)腦缺血模型鼠腦組織MP0和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響1.1、材料與方法1.1.1動(dòng)物及模型制備健康成年雄性SD大鼠，體重250300g。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型。結(jié)扎大鼠頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，自頸總動(dòng)脈分叉處向頸內(nèi)動(dòng)脈插入栓線約18mm，阻斷大腦中動(dòng)脈血流，造成局灶性腦缺血。術(shù)后將栓線尾部置于劈下，缺血2小時(shí)后輕輕拔栓線造成血流再灌注。假手術(shù)組頸內(nèi)動(dòng)脈也插入栓線，但深度為57mm,不能阻塞大腦中動(dòng)脈。1.1.2主要試劑和藥品MPO測(cè)定試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、兔抗鼠bcl—2抗體、bax抗體及生物素化羊抗兔IgG及DAB顯色劑、本品。1.1.3動(dòng)物分組將60只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、本品低、中、高劑量組，每組12只。給藥組灌胃給藥，每日l次，7天后造模。腦缺血2小時(shí)后再灌注24小時(shí)后取腦組織標(biāo)本分別檢測(cè)MPO活性及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。1.1.4腦組織MPO活性測(cè)定腦缺血2小時(shí)后再灌注24小時(shí)后將每組中6只大鼠斷頭取腦，取缺血側(cè)腦組織(假手術(shù)組取假手術(shù)側(cè))100mg，按重量體積l:19加均漿介質(zhì)制備成5%的組織均漿，按照試劑盒說明書進(jìn)行具體步驟操作，采用分光光度法在460nmlcm光徑處檢測(cè)各管0D值，應(yīng)用公式測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值/11.3*取樣量計(jì)算MPO活性數(shù)值。1.1.5腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)腦缺血2小時(shí)再灌注24小時(shí)后將每組中6只大鼠用10%水合氯醛過量麻醉，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈插管后灌注生理鹽水快速?zèng)_洗，再用4。/。冷多聚甲醛磷酸緩沖液(Ph7.4)沖洗灌注至肝臟褪色變硬，四肢、尾變硬。斷頭取腦，取視交叉前后約23mm范圍的冠狀切片腦組織置于4%多聚甲醛中4'C條件下固定24小時(shí)，石蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚約4um，行TUNEL染色。采用NikonECLIPSEE600全自動(dòng)圖象分析系統(tǒng)，在相同的視野下，分別對(duì)相鄰切片的凋亡細(xì)胞核bcl—2、bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的數(shù)目、面積及平均光密度進(jìn)行分析。1.1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以(7土S)表示，采用t檢驗(yàn)。1.2、結(jié)果見表1、2、3。與假手術(shù)組比較，模型組缺血側(cè)腦組織MPO活性顯著升高，TUNEL陽性細(xì)胞(即凋亡神經(jīng)元細(xì)胞，胞體縮小，核膜皺縮，染色不均，濃集于核膜附近，見核固縮核核碎裂)數(shù)目增多，其陽性面積及平均光密度顯著增加。與模型組比較，本品低、中、高劑量組大鼠缺血側(cè)腦組織MPO活性降低，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.01，P<0.05)，其陽性面積及平均光密度顯著降低，其中高劑量組最強(qiáng)。結(jié)果顯示，假手術(shù)組僅有少量bax蛋白表達(dá)，缺血2小數(shù)再灌注24小時(shí)，bax蛋白的陽性面積及平均光密度顯著增加，與假手術(shù)數(shù)組差異顯著。本品治療后陽性面積及平均光密度顯著下降，與模型組比較差異顯著。在正常情況下，bcl—2在神經(jīng)細(xì)胞就有較強(qiáng)的表達(dá)，缺血2小數(shù)再灌注24小時(shí)后bcl—2蛋白陽性面積及平均光密度顯著減少，與假手術(shù)組差異顯著，本品治療后陽性面積及平均光密度均顯著提高，與模型組比較差異顯著。表l:各組大鼠腦組織MPO活性、神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較(^±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與假手術(shù)組比較"P〈0.01，與模型組比較卞〈0.01，，〈0.05表2:本品對(duì)腦缺血再灌注模型鼠半暗帶區(qū)bax蛋白的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與假手術(shù)組比較"P〈0表3:本品對(duì)腦缺血l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與假手術(shù)組比較"P〈0.01，與模型組比較，，〈0.05,*P〈0.01。2、本品對(duì)腦缺血模型鼠局部葡萄糖利用率的影響2.1材料與方法2.1.1材料健康雄性SD大鼠20只，體重300350g，隨機(jī)分為對(duì)照組和本品組，每組10只。2.1.2、方法SD大鼠用2%戊巴比妥鈉30mg/kg體重腹腔注射麻醉后制作大腦中動(dòng)脈閉塞模型，缺血3小時(shí)后拔出線栓，缺血1小時(shí)后按lg/kg體重的劑量用微量輸液泵腹腔滴注本品溶液，對(duì)照組富腹腔滴注等量生理鹽水。缺血后24小時(shí)用過量戊巴比妥鈉處死動(dòng)物。進(jìn)行LCGU測(cè)定。2.1.3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析。2.2、結(jié)果局部腦葡萄糖利用率14c去氧葡萄糖滲出少表明葡萄糖利用率低，本品組缺血中心區(qū)LCGU明顯高于對(duì)照組(P〈0.05)，缺血周邊區(qū)LCGU也明顯高于對(duì)照組及對(duì)側(cè)大腦半球同源區(qū)(P<0.05)，表明本品能增加局灶性腦缺血模型及其周邊區(qū)的LCGU。表4:本品對(duì)大鼠局部腦葡萄糖利用率的影響(umol.100g—'，7±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與對(duì)照組比較卞〈0.05,與對(duì)側(cè)大腦半球相同區(qū)域比較"P〈0.053、對(duì)于大鼠腦缺血再灌注中白細(xì)胞浸潤情況的影響3.1材料和方法3.1.1動(dòng)物分組健康Wister大鼠40只，體重在250300g雌雄各半。隨機(jī)將大鼠均分成4組，每組10只正常組、假手術(shù)組、對(duì)照組和給藥組。正常組無手術(shù)操作。3.1.2腦缺血再灌注模型制備假手術(shù)組腹腔注射20g/L戊巴比妥鈉(50mg/kg)進(jìn)行麻醉。將麻醉后的大鼠仰臥固定于大鼠定位儀上，展平頸部，，常規(guī)消毒，在喉頭于胸骨之間正中線處作一縱向切口，長約2.5cm，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣鈍性分離肌肉，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈穿線備用，在兩側(cè)頸總動(dòng)脈下墊一小硅膠管但不結(jié)扎，消毒，縫合傷口。對(duì)照組和給藥組手術(shù)操作通假手術(shù)組，但結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈，阻斷大腦血液供應(yīng)。1小時(shí)后撤出硅膠管，恢復(fù)血流供應(yīng)。假手術(shù)組、對(duì)照組于缺血后再灌注2小時(shí)腹腔注射生理鹽水(10mg/kg);給藥組術(shù)前灌胃給藥7天，每日一次，造模后缺血再灌注1天后快速腹主動(dòng)脈取血后再斷頸開顱取腦。對(duì)照組和給藥組大鼠一側(cè)大腦半球用于制備腦勻漿，一側(cè)大腦半球用于制備組織病理切片。3.1.3藥物及試劑丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物岐化酶(SOD)試劑盒、TNF試劑盒本品原料藥。3.1.4儀器大鼠定位儀、800型離心機(jī)、721分光光度計(jì)、顯微鏡、圖象分析儀。3.1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3.2結(jié)果3.2.1腦勻漿中MDA、SOD及血清中TNF的含量，結(jié)果見表5、表6。表5:大鼠腦缺血再灌注后腦勻漿中SOD活性和MDA含量(7±Sn=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注與對(duì)照組相比卞〈0.01廣P〈0.05表5可以看出，藥物組與對(duì)照組比較，腦勻漿中SOD活性明顯升高(P〈0.01),而MDA的含量明顯下降(P<0.05),都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表6:大鼠腦缺血再灌注后血清中TNF含量±Sn=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注與對(duì)照組比較'P〈0.05表6可以看出，給藥組與對(duì)照組比較，血清中TNF含量明顯下降(P<0.05)。3.2.2腦梗塞區(qū)白細(xì)胞的計(jì)數(shù)各組大鼠在腦缺血再灌注1天后處死，取一側(cè)大腦半球永體積分?jǐn)?shù)為10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，沿冠狀位在視交叉平面連續(xù)切片5張(5um)，常規(guī)HE染色，隨機(jī)抽取1張作為光鏡觀察，光鏡400倍視野下，用標(biāo)準(zhǔn)的10*10鏡欄柵計(jì)數(shù)缺血組織中的白細(xì)胞，每張切片計(jì)數(shù)5各視野。切片中性白細(xì)胞典型及未受缺血影響者，結(jié)果見表7。3.2.3腦梗塞灶面積計(jì)算利用圖象分析系統(tǒng)計(jì)算視交叉平面處腦梗塞灶面積，結(jié)果見表7。表7:大鼠腦缺血再灌注后腦梗塞區(qū)白細(xì)胞個(gè)數(shù)及腦梗塞面積結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注與對(duì)照組比較卞〈0.01表7可以看出，給藥組大鼠腦梗塞區(qū)白細(xì)胞計(jì)數(shù)和腦梗塞面積與對(duì)照組比較明顯減小(*P〈0.01)。從上述實(shí)驗(yàn)可以看出本品能顯著抑制白細(xì)胞的浸潤，減少氧化損傷，減小梗塞面積。4、對(duì)腦缺血大鼠軟腦膜微循環(huán)的影響4.1材料和方法4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，體重250300g。按性別分籠飼養(yǎng)。自由飲水。4.1.2、儀器與實(shí)驗(yàn)藥品、試劑MCIP微循環(huán)圖象系統(tǒng)，生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)。本品、腦心通、人工腦脊液。4.1.3、分組與給藥方法取SD大鼠40只，按性別隨機(jī)分為5組，每組8只，雌雄各半，分別十二指腸給藥本品30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg，腦心通100mg/kg，及等容量生理鹽水，給藥容積均為2ml/kg。4.1.4腦缺血模型的建立取SD大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉40ml/kg，麻醉，沿腹正中線切開，行十二指腸插管，荷包縫合。仰臥位固定，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，一側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，另一側(cè)頸總動(dòng)脈插管，連接三通，一端與生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)連接，以描記血壓，另一端與注射器相連以備放血。然后將大鼠俯臥位固定，暴露顱骨，在離矢狀縫約0.20.3cm處用手術(shù)刀刮薄骨板，逐層分離硬腦膜、蛛網(wǎng)膜、暴露軟腦膜，形成一橢圓形窗口，以人工腦脊液保持軟腦膜濕潤，用MCIP微循環(huán)圖象處理系統(tǒng)選取管徑為2050um的微血管進(jìn)行觀察?？刂剖覝亍４獕浩椒€(wěn)后，快速從頸總動(dòng)脈放血，平均動(dòng)脈壓下降為45士5毫米汞柱，以此作為地壓低灌注性腦缺血的開始。穩(wěn)定10分鐘后，分別十二指腸給藥，用MCIP微循環(huán)圖象處理系統(tǒng)測(cè)量給藥前及給藥后30、60、120、180分鐘微血管的管徑及血流速度，計(jì)算血流速度和血管管徑的變化率。血流速度變化率=(給藥后血流速度一給藥前血流速度)/給藥前血流速度X100X血管管徑變化率=(給藥后血管管徑—給藥前血管管徑)/給藥前血管管徑X100X4.1.5統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(7±S)表示，采用成組設(shè)計(jì)的二樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。4.2結(jié)果模型組大鼠軟腦膜微循環(huán)血流速度持續(xù)性減慢，而給與腦安康膠囊后，大鼠軟腦膜微循環(huán)血流速度明顯加快，給藥30分鐘后即開始起效(P<0.01),60分鐘后達(dá)最大作用，最大增幅可以達(dá)52%，隨后作用逐漸減弱。各時(shí)間點(diǎn)血流速度變化率與模型組比較均有顯著性差異(P〈0.05,P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8、9表8:本品對(duì)腦缺血大鼠軟腦膜微循環(huán)血流速度的影響(7士S，n二8)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注與正常比較，*P<0.01,與生理鹽水組比較林P〈0.01。模型組大鼠軟腦膜微循環(huán)微血管持續(xù)性收縮，而給與本品后，大鼠軟腦膜微循環(huán)血管明顯擴(kuò)張，給藥后30分鐘后即開始起效(P<0.05)，60分鐘后達(dá)到最大作用，最大擴(kuò)張率達(dá)到35.0%，隨后擴(kuò)血管作用逐漸減弱。各時(shí)間點(diǎn)管徑變化率與模型組比較均顯著性差異(P<0.01'P<0.05)。表9:對(duì)腦缺血大鼠軟腦膜微循環(huán)血管管徑的影響(7±S,n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注與正常比較##P<0.Ol，與生理鹽水組、對(duì)照組比較，**P<0.01'*P<0.05。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本品具有較好的改善腦缺血軟腦膜微循環(huán)障礙作用，且起效快，維持時(shí)間長，能夠很好的治療腦梗死疾病。5、對(duì)中風(fēng)后遺癥的作用的研究5.1、材料與方法5.1.1、動(dòng)物與分組雄性SD大鼠180只，重250300g。隨機(jī)分為缺血性中風(fēng)后遺癥模型組、藥物組、假手術(shù)組，每組60只。5.1.2、藥物本品。5.1.3、缺血性中風(fēng)后遺癥模型的制備按TAMURA的方法稍加改進(jìn)行右側(cè)近端大腦中動(dòng)脈電凝術(shù)制成MCAO模型，MCA05周后即為缺血性中風(fēng)后遺癥大鼠模型。假手術(shù)組大鼠行相同的開顱手術(shù)而不凝閉MCA。5.1.4、給藥方法模型成功后，3組同時(shí)進(jìn)行灌胃治療。藥物組按60mg/kg給藥，余兩組分別給予同等量生理鹽水，每日l次，共14天。5.1.5、觀測(cè)指標(biāo)的測(cè)定5.1.5.1、額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)rCBF的測(cè)定3組大鼠分別于治療前、后1周和2周各取8只進(jìn)行測(cè)定，每只大鼠均測(cè)定梗死灶對(duì)側(cè)半球額葉皮質(zhì)及同側(cè)海馬rCBF。采用激光多普勒血流儀。大鼠麻醉后固定于立體定位儀，剪開顱頂皮膚，用牙科鉆鉆透顱骨。以微型支架固定光纖探頭，測(cè)定梗死灶對(duì)側(cè)額葉rBCF時(shí)選擇距離前囟門后1.2mm，頂縫右側(cè)2mm點(diǎn)，進(jìn)針lrnm;測(cè)定海馬rCBF時(shí)選擇前囟門后5mm，頂縫右側(cè)3mm點(diǎn)，進(jìn)針2.54mm，連續(xù)測(cè)定10分鐘，記錄LDP輸出信號(hào)，經(jīng)PERISOFT程序處理，計(jì)算平均值。5.1.5.2、大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變的測(cè)定采用FEENEY等大鼠走橫木實(shí)驗(yàn)17分法評(píng)價(jià)大鼠四肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。3組大鼠分別于治療前、治療后1周和2周，各取12只大鼠進(jìn)行測(cè)評(píng)。5.1.5.3、大鼠腦組織GAP-43、SYN表達(dá)的測(cè)定大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分后，于觀察各時(shí)相從3組中各取6只迅速斷頭取腦，沿冠狀面平均每隔2mm分成數(shù)層，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋。切片機(jī)上行厚度為5um連續(xù)冠狀切片，嚴(yán)格按照試劑盒說明行免疫組化染色。觀察時(shí)，隨機(jī)取上、下、左、右、中5各視野，用自動(dòng)病理圖文分析系統(tǒng)免疫組化染色陽性信號(hào)的面積占當(dāng)時(shí)視野面積的百分比，即為所要測(cè)定的免疫反應(yīng)產(chǎn)物陽性信號(hào)的密度值。5.1.5.4、大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1、eeN0S、P-gpmRNA表達(dá)的測(cè)定。大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分后，于觀察各時(shí)相從3組中各取6只迅速斷頭取腦。固定、脫水、浸臘包埋及切片操作同上，根據(jù)試劑盒說明行原位雜交。切片從各實(shí)驗(yàn)組每個(gè)觀察時(shí)點(diǎn)所得切片中隨機(jī)選取，每張切片隨機(jī)觀察IO條微血管(X400),統(tǒng)計(jì)血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性率及染的深度。表10:大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>5.1.6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(7±S)表示，應(yīng)用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P〈0.05為差異有顯著意義。5.2、結(jié)果5.2.1、額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)rCBF均顯著低于假手術(shù)組(P〈0.05);治療1周后，藥物組額葉皮質(zhì)rCBF即升至假手術(shù)組水平，知道觀察結(jié)束；海馬區(qū)rCBF與治療第2周葉顯著高于模型組，見表ll。表ll:人H額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)rCBF的測(cè)定[ml/(100g/min)7±S]<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注藥物組與模型組相比較*<0.05;藥物組和假手術(shù)組比較^〈0.05。5.2.3對(duì)大鼠腦組織GAP-43、SYN表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表13。假手術(shù)組GAP—43在大腦皮層及部分腦區(qū)有表達(dá)，且呈對(duì)稱性分布，各時(shí)點(diǎn)無顯著性差異。模型組在梗死灶中心區(qū)GAP-43未見表達(dá)，梗死灶周圍區(qū)GAP-43陽性信號(hào)密度值與假手術(shù)組比較無顯著性差異。藥物治療1周時(shí)，同模型組比較GAP-43表達(dá)不顯著，第2周梗死灶周圍區(qū)GAP-43表達(dá)明顯提高，與其他兩組比較均有顯著性差異。SYN陽性表達(dá)產(chǎn)物在假手術(shù)組可見于皮質(zhì)、紋狀體、海馬等處，各觀察時(shí)點(diǎn)比較無顯著差異。模型組在梗死灶周圍區(qū)可見SYN陽性表達(dá)，但各吋點(diǎn)其陽性密度值均低于假手術(shù)組。藥物組治療l周后，梗死灶周圍區(qū)SYN陽性密度值明顯高于模型組，2周時(shí)則達(dá)假手術(shù)組水平。表13、大鼠GAP-43、SYN陽性信號(hào)密度值的變化(％，7±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注:GAP-43陽性信號(hào)密度值的變化藥物組2周時(shí)分別與0周和1周時(shí)相比較，均為卞<0.05;與同時(shí)段模型組比較，P〈0.05;與同時(shí)段假手術(shù)組比較，〈0.05;SYN陽性信號(hào)密度值的變化與假手術(shù)組比較Ap〈0.05，APX).05;與模型組比較，，〈0.05，*P<0.05。5.2.4、大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-lmRNA、eeNOSmRNA、P-gpraRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表14。模型組ET-lmRNA表達(dá)積分顯著高于假手術(shù)組，而eeNOSmRNA、P-gpmRNA表達(dá)積分均顯著低于假手術(shù)組。藥物治療1周時(shí)ET-lmRNA表達(dá)積分明顯低于模型組，2周時(shí)積分繼續(xù)下降。藥物治療1周時(shí)eeNOSmRNA表達(dá)積分較模型組顯著提高，2周時(shí)繼續(xù)增高。藥物治療1周時(shí)P-gpmRNA表達(dá)積分與模型組比較未見明顯變化，2周時(shí)則顯著高于模型組。表14:大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-lmRNA、eeNOSmRNA、P-gpmRNA的表達(dá)(n=45，7±S)項(xiàng)目<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注ET-lmRNA陽性表達(dá)積分與模型組比較卞〈0.05,"P<0.05;與假手術(shù)組比較卞〈0.05,照P〈0.05。eeNOSmRNA陽性表達(dá)積分與模型組比較卞<0.05，**P<0.05;與假手術(shù)組比較"P〈0.05,P〈0.05。P-gpmRNA陽性表達(dá)積分與模型組比較卞〈0.05,與假手術(shù)組比較*P〈0.05。實(shí)驗(yàn)表明本品對(duì)缺血性中風(fēng)后遺癥大鼠模型神經(jīng)功能有顯著改善作用，而激活下調(diào)腦區(qū)時(shí)其治療缺血性中風(fēng)后遺癥的重要機(jī)制U)改善rCBF。治療前模型組和給藥組病灶對(duì)側(cè)額葉皮質(zhì)及同側(cè)海馬區(qū)較之假手術(shù)組均有明顯的低灌注現(xiàn)象，提示存在功能抑制。特別時(shí)病灶對(duì)側(cè)額葉皮質(zhì)rCBF的降低，時(shí)腦梗死的遠(yuǎn)隔效應(yīng)。用本品治療后，低灌注現(xiàn)象均有顯著改善，而模型組應(yīng)用生理鹽水后則位發(fā)生顯著性變化，提示本品改善rCBF是其激活下調(diào)腦區(qū)的重要機(jī)制之一。(2)提高腦神經(jīng)機(jī)能活動(dòng)。下調(diào)腦區(qū)激活的外在表現(xiàn)是神經(jīng)缺損癥狀的恢復(fù)，而其內(nèi)在效應(yīng)則是神經(jīng)機(jī)能活動(dòng)的提高。大鼠BWT測(cè)評(píng)表明，給藥組經(jīng)過本品治療后大鼠四肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能較之，模型組有顯著恢復(fù)，說明中風(fēng)病即使進(jìn)入后遺癥期神經(jīng)功能仍然可以繼續(xù)改善。(3)上調(diào)GAP-43、SYN表達(dá)。下調(diào)腦區(qū)機(jī)能活動(dòng)與神經(jīng)元、突觸活性密切相關(guān)。GAP-43是代表神經(jīng)生長和再生的特異性指標(biāo)；SYN作為突出囊泡的結(jié)構(gòu)成分，是反應(yīng)突出活性和突出重建的分子標(biāo)志物。本品可顯著上調(diào)兩者的表達(dá)，而對(duì)照組均為發(fā)現(xiàn)明顯改變。(4)調(diào)節(jié)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。本實(shí)驗(yàn)以eeNOSmRNA、ET-lraRNA的表達(dá)反應(yīng)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞合成NO和ET-1的能力，分別反映腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和參與構(gòu)成血腦屏障的ET-lniRNA、eeNOSmRNA、P-gpraRNA的變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)本品能上調(diào)eeNOSmRNA、P-gpmRNA的表達(dá)，而降低ET-lmRNA的表達(dá)，表明本品在調(diào)節(jié)血管舒縮功能、改善腦微循環(huán)功能狀態(tài)、增強(qiáng)血腦屏障保護(hù)以及保持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性方面具有重要作用。6、對(duì)腦缺血模型大鼠腦含水量及腦指數(shù)的影響6.1、方法雄性大鼠60只隨機(jī)分為6組，于實(shí)驗(yàn)前1天上、下午及實(shí)驗(yàn)當(dāng)天術(shù)前I小時(shí)各灌胃給藥1次。雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎3小時(shí)后斷頭開顱取腦，用濾紙吸去腦表面的水分，稱量濕重，然后置于干燥箱內(nèi)IIO'C烘至恒重，稱量干重。腦含水量(％)=(濕重一干重)Z濕重X100X,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以t檢驗(yàn)方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果見表15。6.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本品能明顯降低腦缺血模型大鼠的腦含水量及腦指數(shù)。上述缺血腦組織固定后，冠狀切取大腦，常規(guī)脫水，石臘包埋制片，AE染色，光鏡檢驗(yàn)(X400)。鏡下觀察，假手術(shù)對(duì)照組腦組織神經(jīng)細(xì)胞和血管周圍腔隙不大，腦缺血模型組血管周圍腔隙明顯變大，神經(jīng)細(xì)胞周圍腔隙變化不十分明顯。而本品中、高劑量組能明顯抑制造模型所致血管周圍腔隙擴(kuò)大，說明本品對(duì)大鼠缺血性腦組織的病理變化有一定的保護(hù)作用。表15:本品對(duì)急性不完全性腦缺血模型大鼠腦含水量及腦指數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>與模型組比較1X0.05,MP<0.017、對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響7.1、方法取SD大鼠50只，平均分為5組.，給藥組本品低(30mg/kg)、中(60mg/kg)、高(120mg/kg)劑量組，對(duì)照組灌服等容量生理鹽水，假手術(shù)組除不結(jié)扎頸總動(dòng)脈，其余處理同對(duì)照組。末次給藥后1小時(shí)，大鼠乙醚麻醉行頸部正中手術(shù)，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，待動(dòng)物清醒后，結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，30分鐘后再恢復(fù)腦供血，24小時(shí)后，斷頭取腦備用。大鼠斷頭取腦，去除小腦和腦干，制成10%勻漿，按TBA比色法測(cè)定MDA含量，用鄰苯三酚自氧化方法測(cè)定SOD活性，用光電比色法測(cè)定LDH活性，用Hartree法測(cè)定腦組織中蛋白質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以t檢驗(yàn)方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表16。7.2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明大鼠全腦缺血30分鐘再灌注24小時(shí)，對(duì)照組大鼠腦組織LDH,SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，本品中、高劑量組能提高缺血再灌注大鼠腦組織的LDH、SOD活性，降低MDA含里o表16:對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>與假手術(shù)組比較卞<0.01，MP<0.05;與對(duì)照組比較"P〈0.01，，<0.05。8、對(duì)體內(nèi)靜脈血栓形成的影響。8.1方法大鼠50只隨機(jī)分為5組，分別為模型組、高劑量組(120mg/kg)、中劑量組(60mg/kg)、低劑量組(30mg/kg)和陽性對(duì)照步長腦心通組(100mg/kg),每組10只。除模型組外，各組連續(xù)灌胃給藥10天，于末次給藥后2h，動(dòng)物麻醉，腹部正中切開腹腔，剝離下腔靜脈備用。在左腎靜脈下方用粗線結(jié)扎下腔靜脈，縫合腹腔，結(jié)扎4h后，處死大鼠，打開腹腔，在結(jié)扎下方2cm處夾閉管腔，取出瘀血段血管，剖開管腔，取出血栓，放在濾紙上，吸干血液，用分析天平稱取血栓濕重(mg)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法用方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表17。8.2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型組比較，各治療組大鼠靜脈血栓濕重明顯減輕(P〈0.05,P〈0.01);本品高、中劑量組血栓濕重均低于步長腦心通組(P<0.05),說明本品具有抑制大鼠體內(nèi)血栓形成的作用。表17:各組大鼠體內(nèi)靜脈血栓濕重<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01;與腦心通組比較"P〈0.05。9、對(duì)大鼠體外血栓形成的影響9.1、方法SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組IO只。本品高劑量組120mg/kg，本品中劑量組60mg/kg，本品低劑量組30mg/kg，步長腦心通組100mg/kg，空白對(duì)照組等容量生理鹽水。各組大鼠均每日灌胃給藥1次，連續(xù)7天，于末次給藥后1小時(shí)，以10%烏拉坦lml/100g麻醉，手術(shù)剝離頸總動(dòng)脈，取血1.8ral，注入標(biāo)好刻度線的血栓硅膠管中，套緊血栓管裝入人體外血栓形成儀，啟動(dòng)轉(zhuǎn)盤，計(jì)時(shí)，轉(zhuǎn)動(dòng)15min后，停機(jī)，取下血栓管，將管內(nèi)血液及形成的血栓迅速倒在預(yù)先鋪好濾紙的平皿中，在移放千燥濾紙上，用分規(guī)刻度尺測(cè)血栓長度，后提起血栓重新放在稱量好的濾紙上，稱其濕重后，置恒溫烤箱6(TC烘烤30min,分析天平稱其干重，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表18。9.2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本品高、中、低劑量組血栓長度顯著短于生理鹽水組，P〈0.05;血栓干重t檢驗(yàn)，本品高、中、低劑量組顯著低于鹽水組，P〈0.05，表明本品高、中、低劑量組有抑制血栓形成的作用。表18:本品對(duì)大鼠體外血栓形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注各給藥組與生理鹽水組比較*〈0.05。10、對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響10.1、方法昆明種小鼠50只，體重1822g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。本品低劑量組(60mg/kg)、中劑量組(120mg/kg)、高劑量組(240mg/kg)，陽性對(duì)照腦心通組(200mg/kg)，空白對(duì)照組給等量生理鹽水。各組小鼠均每日灌胃給藥l次，連續(xù)7天，末次給藥后l小時(shí),用毛細(xì)玻璃管將各鼠做眼眶內(nèi)眥取血，測(cè)定方法如下-玻片法用毛細(xì)玻管將各鼠做眼眶內(nèi)眥取血，迅速滴血于載玻片上，血滴直徑約510mm，立即開始計(jì)時(shí)，此后每隔30s用干燥潔凈針頭挑動(dòng)血液1次至針頭能挑起纖維蛋白絲為止，即為凝血時(shí)間。毛細(xì)玻管法各組小鼠給藥10min后，均用內(nèi)徑為lmra的玻璃毛細(xì)管插入小鼠內(nèi)眥球后靜脈叢取血，至毛細(xì)玻璃內(nèi)血栓達(dá)5cm。每隔30s折斷毛細(xì)玻管1小段，檢查有無出現(xiàn)血凝絲。計(jì)算從毛細(xì)玻璃管采血到出現(xiàn)血凝絲的時(shí)間，即為凝血時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表19。10.2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本品各劑量組與生理鹽水組比較均能顯著延長凝血時(shí)間，P〈0.01，P<0.05。表19:本品對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響組別動(dòng)物數(shù)(n)劑量(mg/kg)凝血時(shí)間玻片法毛細(xì)玻管法高劑量組10240mg/kg1.79±0.3(T1.79±0.29**中劑量組101200mg/kg1.70±0.26*1,70±0,27*低劑量組1060mg/kg1.67±0.28*1.67±0.29*腦心通組10200mg/kg1.72±0.20*1.72±0,25*生理鹽水組10_1.41±0.141.41±0.16注和對(duì)照組比較"P〈0.01，*P〈0.05。11、對(duì)血小板聚集功能的影響11.1方法取昆明小鼠50只，雌雄兼用，小鼠隨機(jī)分成5組，為本品高、中、低劑量組，腦心通組即生理鹽水組。給藥劑量見表4。小鼠連續(xù)給藥7天，每天灌胃給藥1次。末次給藥后40min，取抗凝血，離心分離出血小板血漿O.lml，置于硅化處理載玻片上，血漿中放入鐵心玻璃球l個(gè)，將載玻片放在加熱磁力攪拌器上，37。C預(yù)熱2min，啟動(dòng)攪拌器，以1000r/min轉(zhuǎn)5min,取下載玻片，先肉眼觀察血小板聚集個(gè)數(shù)，后置顯微鏡下觀察血小板聚集個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表20。11.2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本品高、中劑量組與生理鹽水組比較，血小板聚集能力明顯降低，P值〈0.05。表20:本品對(duì)小鼠血小板聚集功能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>12、對(duì)斷頭小鼠喘息時(shí)間的影響。12.1方法小鼠50只隨機(jī)分為5組，分別是生理鹽水組、高劑量組、中劑量組、低劑量組和陽性對(duì)照腦心通組，每組10只，除生理鹽水組外，各治療組分別連續(xù)給藥IO天，末次給藥后半小時(shí)，小鼠一次性斷頭，觀察小鼠喘息次數(shù)及喘息持續(xù)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法用方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表21。12.2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生理鹽水組比較，各治療組小鼠斷頭喘息次數(shù)及持續(xù)時(shí)間明顯增加(P〈0.01)，本品高劑量組斷頭喘息次數(shù)及持續(xù)時(shí)間明顯長于步長腦心通組(P<0.05)，說明本品可明顯增加斷頭小鼠腦功能的維持時(shí)間。表21:各組小鼠斷頭喘息次數(shù)及持續(xù)時(shí)間的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注-與對(duì)照藥腦心通組比較，*P<0.05;與生理鹽水組比較，SP<0.01。具體實(shí)施例實(shí)施例l:淫羊藿提取物的制備方法稱取40kg淫羊藿，加入0.01%碳酸鈉50°/。乙醇約800L,回流2小時(shí)，然后過濾，濾渣繼續(xù)用0.01%碳酸鈉50%乙醇約800L,回流2小時(shí)，過濾，再重復(fù)一次，合并三次濾液。將濾液于65。C減壓濃縮至相對(duì)密度約為1.151.20，趁熱濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)pH至中性，通過預(yù)先處理過的HPD100大孔吸附樹脂柱，依次用水、30%乙醇、60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，回收乙醇，于70。C減壓濃縮至相對(duì)密度為1.301.35(60°C)的稠膏，真空干燥，粉碎，即得淫羊藿提取物。實(shí)施例2:硬膠囊劑處方(IOOO粒)淫羊藿提取物100g微晶纖維素150g將淫羊藿提取物與微晶纖維素混合，過篩，使其混勻，加入適量的水或適宜濃度的乙醇制粒，干燥后，整粒，灌裝膠囊。實(shí)施例3片劑淫羊藿提取物10400mg/粒羧甲基淀粉鈉412mg/粒硬脂酸鎂0.10.3mg/粒淀粉50600mg/粒將淫羊藿總黃酮過篩，與羧甲基淀粉鈉、乳糖混合，過篩，加入適量的水或適宜濃度的乙醇制粒，干燥后，整粒，加入適量的硬脂酸鎂，用適當(dāng)?shù)臎_壓裝置壓片?？梢酝ㄟ^改變活性成分與載體的比例或者通過改變壓縮重量而制備成不同強(qiáng)度的片劑。實(shí)施例4顆粒劑淫羊藿提取物10500mg/袋糊精210克蔗糖215克矯味劑適量甜味劑適量將藥用成份和蔗糖、糊精、矯味劑、甜味劑混合均勻，加入適量的水或適宜濃度的乙醇制粒，干燥后，整粒，分裝。實(shí)施例5軟膠囊劑淫羊藿提取物10400mg/粒稀釋劑300450mg/粒助懸劑57.5mg/粒乳化劑57.5mg/粒水6090mg/粒每粒囊殼的組份和含量如下-明膠100150毫克甘油3050毫克水100150毫克防腐劑適量將明膠置于膠罐中，加入可溶解明膠量的純化水，膠罐溫度適宜，溶化后，加入甘油、防腐劑，攪拌均勻，抽真空脫氣后保溫靜置；按比例將淫羊藿提取物與稀釋劑、乳化劑、助懸劑混合均勻，將內(nèi)容物和制備好的明膠置旋轉(zhuǎn)壓囊機(jī)，壓制成軟膠囊，定型、干燥即可。可以按照不同需要，改變內(nèi)容物制備成不同規(guī)格的軟膠囊。實(shí)施例6滴丸淫羊藿提取物2100毫克/?；|(zhì)40400毫克冷凝液甲基硅油(適量)在淫羊藿提取物中加水制成均勻糊狀，再加入熔融的基質(zhì)液，加熱熔融成澄清液體，倒入己預(yù)熱的滴丸器中，控制滴制溫度和滴速，滴入冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置千燥器內(nèi)即得。實(shí)施例7糖漿劑淫羊藿提取物20500毫克羥丙基甲基纖維素適量緩沖劑適量矯味劑適量防腐劑適量甜味劑適量著色劑適量純化水至1Q100毫升將羥丙基甲基纖維素分散在熱水中，冷卻，然后與含有活性成分和制劑中其他成分的含水懸浮液混合。將所得溶液調(diào)制需要體積并混合均勻，滅菌后分裝。權(quán)利要求1、一種淫羊藿提取物，它是以堿—醇—水溶液作為溶劑，從中提取得到的以淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮為主要活性物質(zhì)的提取物，該提取物是按以下方法制備而成的(1)將藥材淫羊藿粗粉，以10～40倍量堿—乙醇—水溶液作為溶媒，回流提取2～3次，每次提取時(shí)間在1～2小時(shí)；(2)過濾，棄去藥渣，合并濾液，在50℃～70℃下減壓濃縮至相對(duì)密度為1.0～1.5的浸膏；(3)過濾，濾液中加稀酸調(diào)節(jié)pH值至中性；(4)將調(diào)過pH值后的藥液上HPD100大孔吸附樹脂柱，用水洗脫至無色后，用5％～35％乙醇水溶液洗脫，棄去洗脫液；再用40％～80％乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液；(5)洗脫液在50℃～70℃下減壓濃縮，濃縮至比重約為1.20～1.40，干燥即得。2、權(quán)利要求l所述的淫羊藿提取物，其特征在于該提取物是優(yōu)選以下方法制備而成-(1)將藥材淫羊藿粗粉，加入20倍量0.01%碳酸鈉50%乙醇水溶液回流提取3次，每次提取時(shí)間2小時(shí)，合并三次濾液；(2)濾液在65。C下減壓濃縮至相對(duì)密度1.151.20;(3)過濾，濾液用稀鹽酸調(diào)pH至中性；(4)上HPD100大孔樹脂柱，用水洗脫至無色，再用30%乙醇洗脫后，用60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液；(5)洗脫液于7(TC減壓濃縮，濃縮至比重約為1.301.35，真空干燥即得。3、權(quán)利要求1或2所述的淫羊藿提取物，其特征在于該提取物中淫羊藿總黃酮的含量在65%以上，淫羊藿苷的含量在20%以上。4、一種權(quán)利要求l所述的淫羊藿提取物的用途，其特征在于在制備腦組織保護(hù)劑的藥物中的應(yīng)用。5、根據(jù)權(quán)力要求5所述的淫羊藿提取物的用途，其特征在于特別是用于制備預(yù)防和治療腦梗死、腦梗塞后遺癥等缺血性腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。6、一種含有淫羊藿提取物的中藥制劑，其特征在于是由權(quán)利要求l所述的淫羊藿提取物和藥劑學(xué)上可接受的藥用輔料制備而成的任何一種可能的藥物制劑。7、權(quán)利要求7所述的中藥制劑，其特征在于可以制備成口服制劑和注射用制劑。8、權(quán)利要求8所述的中藥制劑，其特征在于所述的口服制劑可以是硬膠囊劑、軟膠囊劑、普通片劑、口腔崩解片、含片、分散片、緩釋制劑、控釋制劑、顆粒劑、水丸、滴丸、蜜丸等，且所述淫羊藿提取物中淫羊藿總黃酮的含量在65%以上，淫羊藿苷的含量在20%以上。全文摘要本發(fā)明提供一種淫羊藿提取物，特別是提供一種高含量的淫羊藿總黃酮提取物，其制備方法主要包括以下步驟(1)以堿-乙醇-水作為提取溶媒回流提取；(2)減壓濃縮；(3)調(diào)pH值；(4)大孔樹脂柱洗脫(5)洗脫液干燥，所得總黃酮含量在65％以上，淫羊藿苷的含量在20％以上。本發(fā)明所提供的提取物可以按照藥劑學(xué)上的要求制備成各種口服制劑，可以是硬膠囊劑、軟膠囊劑、普通片劑、口腔崩解片、含片、分散片、緩釋制劑、控釋制劑、顆粒劑、水丸、滴丸、蜜丸等。該提取物及含有該提取物的有效藥料可以用于制備腦組織保護(hù)劑的藥物中的應(yīng)用，特別是在預(yù)防和治療腦梗死、腦梗塞后遺癥等缺血性腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K9/16GK101416995SQ20071013388公開日2009年4月29日申請(qǐng)日期2007年10月24日優(yōu)先權(quán)日2007年10月24日發(fā)明者史美耿,朱靜娟,王永毅,王燕萍,石海云,錢世祥,阮錦滿申請(qǐng)人:南京宇道科技開發(fā)有限公司