專利名稱：肝臟x受體激動(dòng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明工作得到國(guó)立衛(wèi)生研究院的基金資助(CA-58073和DK-41670)，因此美國(guó)政府在此項(xiàng)發(fā)明中享有一定的權(quán)益。
背景技術(shù)：
肝臟X受體(Liver X Receptor，以下簡(jiǎn)稱LXR)屬于“核受體超家族”(nuclear receptor super-family)之一員，其包括了LXRα和遍在受體(Ubiquitous Receptor，UR，亦稱LXRβ)。該受體對(duì)基因表達(dá)具有反式激活(transactivate)作用。若干與膽固醇平衡相關(guān)的基因已被確認(rèn)為是LXR的直接靶向，例如，編碼膽固醇外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合盒1(efflux transporter ATP-binding Cassette 1)ABCA1和ABCG1、膽固醇7α-羥化酶(由膽固醇合成膽汁酸作用中的限速酶)、膽固醇酯移轉(zhuǎn)蛋白(CETP)、脂蛋白載脂蛋白E(ApoE)以及甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding protein 1c(SREBP-1c))等的基因皆為L(zhǎng)XR之靶向。相關(guān)研究請(qǐng)參考Schwartz等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2000，274794-802；Laffitte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001，98(2)508-512；及Repa等，Genes Dev.，2000，142819-30。
受到LXR調(diào)控的上述基因會(huì)改變膽固醇之逆向運(yùn)送及消耗，而這些改變將直接影響脂肪和纖維成分之形成、ApoE基因之表達(dá)，以及核因子κ-B和AP-1的激活。脂肪及纖維元在動(dòng)脈中累積會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化，而動(dòng)脈硬化是心臟病、中風(fēng)等疾病之潛在原因。目前已發(fā)現(xiàn)ApoE基因表達(dá)缺乏與阿爾茨海默病等疾病相關(guān)。而激活核因子κ-B和AP-1則會(huì)調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)并增進(jìn)抗炎能力。
發(fā)明概述本發(fā)明基于一新發(fā)現(xiàn)的類固醇化合物，其功能為L(zhǎng)XR之激動(dòng)劑。
本發(fā)明的一方面涉及一種具有式(I)結(jié)構(gòu)之化合物 每一R1、R2、R3、R4、R4’、R5、R6、R7、R11、R12、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、烷基、鹵烷基、羥基、氨基、羧基、氧、磺酸基、或任選地插入了-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR’、或-NR’-CO-的烷基；或R3與R4一起、R4與R5一起、R5與R6一起、或R6與R7一起進(jìn)行消去從而在其所連接之碳原子之間形成一個(gè)C＝C鍵；每一R8、R9、R10、R13、及R14分別獨(dú)立為氫、鹵素、烷基、鹵烷基、羥烷基、烷氧基、羥基或氨基；n為0、1或2；A為亞烷基、亞烯基或亞炔基；以及每一X、Y及Z分別獨(dú)立為烷基、鹵烷基、-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”或-N(SR’)R”；或X及Y一起為＝O、＝S或＝NR’；每一R’及R”分別獨(dú)立為氫、烷基或鹵烷基。
文中術(shù)語(yǔ)“烷基”、其作為前綴的“烷”(例如烷氧基)及作為后綴的“烷基”(例如羥烷基)，皆指直鏈或支鏈的C1-18。
在如式(I)之化合物中有一個(gè)亞族(subset)，其特征為每一R5及R6分別獨(dú)立為氫、烷基、鹵烷基、羥基或氨基；另一亞族之特征為R5及R6一起進(jìn)行消去從而在該二取代基所連接之碳原子之間形成一個(gè)C＝C鍵。另外兩個(gè)本化合物之亞族特征分別為X及Y一起為＝O或＝S，且Z為-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”或-N(SR’)R”；以及每一X、Y及Z分別獨(dú)立為烷基、鹵烷基、-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”或-N(SR’)R”。
上述化合物亦包括其適用之鹽類及前體藥物。舉例而言，該鹽類可由本發(fā)明之化合物的其中一個(gè)帶正電的取代基(例如氨基)與一陰離子作用而形成。合適的陰離子包括(但不限于)氯離子、溴離子、碘離子、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、三氟醋酸鹽、及醋酸鹽。同樣地，該鹽類亦可由本發(fā)明化合物之帶負(fù)電取代基(例如羧基)與一陽(yáng)離子作用而得。適合之陽(yáng)離子包括(但不限于)鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子及如四甲基銨離子之類的銨離子。前體藥物可舉例如酯類，以及其它藥物學(xué)可接受之衍生物，而該衍生物被施用于一對(duì)象后能夠提供上述類固醇化合物。
本發(fā)明之另一方面涉及一藥物組合物，其包含一有效量的本發(fā)明的化合物，以及一種藥物學(xué)可接受的載體。確實(shí)，本發(fā)明之化合物可用以治療LXR介導(dǎo)的疾病，如心臟病、中風(fēng)、阿爾茨海默病及炎癥性疾病，因此本發(fā)明之范疇亦包括以本發(fā)明之化合物治療上述疾病之一的方法，以及利用本發(fā)明之化合物生產(chǎn)可用以治療上述疾病之一的藥物的方法。
以下將對(duì)本發(fā)明之?dāng)?shù)種化合物進(jìn)行詳細(xì)的說明，本發(fā)明之其余特點(diǎn)、目的和優(yōu)點(diǎn)可由本說明書與權(quán)利要求書得知。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明之化合物可由本領(lǐng)域已知方法以適當(dāng)之類固醇為起始物質(zhì)而合成。更確切地說，該起始類固醇在C-17的位置(參見上述式(I)，即R17所連接之碳原子)具有一可經(jīng)修飾而含有由x、Y及Z所定義的部分(亦請(qǐng)參見式(I))之取代基。該取代基之范例包括膽酸(cholic acid)、脫氫膽酸(dehydrocholic acid)、脫氧膽酸(deoxycholic acid)、石膽酸(lithocholic acid)、熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid)、豬膽酸(hyocholicacid)、豬脫氧膽酸(hyodeoxycholic acid)、及膽烷酸(cholanoicacid)，而這些取代基可購(gòu)得或由文獻(xiàn)記載之方式合成，例如見Roda等所述(F.Lipid Res.，1994，352268-2279；及Roda等，Dig.Dis.Sci.，1987，3424S-35S)。
本發(fā)明的一種在C-17位置具有含酰胺取代基(亦即，X和Y一起為＝O，而Z為氨基)之化合物，可通過將一在C-17位置具有羧基取代基之類固醇與一含氨基化合物(例如二甲基胺、苯胺、氨基醋酸及苯丙氨酸)反應(yīng)而制備。相似地，本發(fā)明的一種在C-17位置具有含酯取代基(亦即，X和Y一起為＝O，而Z為一烷氧基)之化合物，可通過將一在C-17位置具有羧基取代基之類固醇與一含羥基之化合物(例如乙醇和異丙醇)反應(yīng)而制備。上述之酰胺化或酯化反應(yīng)可在任何適當(dāng)之溶液中進(jìn)行。若上述反應(yīng)在水溶液中進(jìn)行，則可不必為體內(nèi)或體外篩選分析而對(duì)該類固醇產(chǎn)物進(jìn)行分離。
本發(fā)明之一種于C-17位置具有一羰基取代基(亦即，X和Y一起為＝O)之化合物，例如可與硫化氫反應(yīng)而形成一含硫羰基之化合物(亦即，X和Y一起為＝S)，或與肼反應(yīng)而形成一含亞胺基之化合物(亦即X和Y一起為＝NR)。以上反應(yīng)請(qǐng)分別參見Janssen等(Ed.)，OrganosulfurChemistry；WileyNew York，1967，219-240；以及Patai等(Ed.)，TheChemistry of the Carbon-Nitrogen Double Bond；WileyNew York，1970，64-83和465-504。
在必要的情況下，可通過本領(lǐng)域已知的方法對(duì)C-17之外的環(huán)原子(ring atom)的取代基進(jìn)行進(jìn)一步修改。舉例而言，在C-3位置之羥基取代基可與醋酸之類的酸進(jìn)行酯化反應(yīng)而成為酯取代基。
本反應(yīng)可輕易自動(dòng)化，因其反應(yīng)機(jī)制簡(jiǎn)單。生成物之分離及定量可通過薄層層析法、高壓液相層析法、氣相層析法、毛細(xì)管電泳或其它分析及制備程序而達(dá)成。
而于C-17位置取代基不含羰基、硫羰基或亞胺基之化合物，亦可由本領(lǐng)域已知的方法制備。舉例而言，3α，6α，24-三羥基-24，24-二(三氟甲基)-5β-膽烷可經(jīng)由下列步驟制備 如上所示之步驟，膽酸先在酸性環(huán)境中與甲醇作用以形成甲基酯，該甲酯基化合物接著與叔丁基二甲基硅氯化物(tert-butyldimethylsilylchloride，TBDMSCl)作用以保護(hù)3β-羥基。該被保護(hù)的甲基酯與二(異丁基)鋁氫化物(di(iso-butryl)alumina hydride)反應(yīng)而形成一醛類，接著再與三甲基(三氟甲基)硅烷進(jìn)行反應(yīng)，形成α位置被三氟甲基取代的一種醇類。該醇類接著進(jìn)行Dess-Martin反應(yīng)以形成一種酮類。請(qǐng)參考Dess等，J.Org Chem.，1983，384155。該酮類接著再次與三甲基(三氟甲基)硅烷反應(yīng)形成α位置具有兩個(gè)三氟甲基取代基的一種醇類。該具有兩個(gè)取代基的醇類最后再與四正丁基氯化銨(TBAF)反應(yīng)，除去保護(hù)而得到3α，6α，24-三羥基-24，24-二(三氟甲基)-5β-膽烷。
取一有效量之上述制備之化合物，與藥物學(xué)可接受之載體以配制成可用來治療與動(dòng)脈粥樣硬化或ApoE缺乏相關(guān)之疾病，或是炎癥性疾病。在前文中“有效量”指的是用以對(duì)受測(cè)對(duì)象提供治療效果所使用該化合物之量。在動(dòng)物及人類之間所使用劑量之相互關(guān)系(根據(jù)“毫克/身體表面積每平方米”而計(jì)算)，可見于Freireich等，Cancer Chemother.Rep.1966，50，219。身體表面積可由病人之身高及體重而得到一近似值，該近似值計(jì)算可參見Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，New ork，1970，537。而本領(lǐng)域人員亦應(yīng)知悉有效劑量會(huì)隨著用藥途徑、使用的賦形劑、或搭配其它治療程序而變化，而非一定值。舉例而言，藥物學(xué)可接受之載體包括膠態(tài)二氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、硫酸月桂酸鈉以及D&C Yellow#10。
該化合物用于藥物時(shí)，可能以非腸胃方式使用，例如皮膚局部注射、腹腔注射或靜脈注射。非腸胃用藥之例子包括將有效化合物溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，或?qū)⒃摶衔锱c其它用藥上可接受之載體混合。如環(huán)狀糊精或其它習(xí)知之助溶劑亦可包括在該藥物成分中。
由于本發(fā)明之化合物可有效刺激LXR，因此通過體外分析可初步篩選出該化合物，也因此可以治療與LXR相關(guān)之疾病。舉例而言，將腎臟細(xì)胞以一螢光酶報(bào)告基因(包括一人類c-fos最小啟動(dòng)子)以及一LXR進(jìn)行轉(zhuǎn)染(transfect)。將該經(jīng)過轉(zhuǎn)染之細(xì)胞與待測(cè)化合物共同培養(yǎng)之后，量測(cè)該螢光酶之活性以決定該報(bào)告基因被反式激活(transactivation)之程度。
在初步篩選中表達(dá)出刺激LXR效果之化合物，可更進(jìn)一步根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法在動(dòng)物試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估。舉例而言，可將一化合物搭配含膽固醇之食物以喂食實(shí)驗(yàn)老鼠。通過比較實(shí)驗(yàn)組(有喂食該化合物)與對(duì)照組(未喂食該化合物)之老鼠在不同組織中的膽固醇含量，即可測(cè)定該化合物之效用。
在不需進(jìn)一步說明情況下，本領(lǐng)域人員應(yīng)可根據(jù)本說明書之內(nèi)容，將本發(fā)明應(yīng)用至最廣泛之程度。本說明書所列舉之已發(fā)表文章系引證其文章整體。本說明書接著會(huì)說明幾個(gè)特定實(shí)施例，以描述數(shù)個(gè)屬于本發(fā)明之不同化合物之合成以及生物測(cè)試程序。需注意的是，下述實(shí)施例僅僅是用于說明書本發(fā)明，而非是將本發(fā)明的其他方面限制于實(shí)施例。
實(shí)施例1本發(fā)明之化合物之合成3α，6α，24-三羥基-24，24-二(三氟甲基)-5β-膽烷(化合物(1))之合成方法如前所述。
3α，6α-二羥基-5β-膽烷酸-N-甲基-N-甲氧基-24-酰胺(化合物2)，2，2，2，-三氟乙基-3α，6α-二羥基-5β-膽烷酸-24-酰胺(化合物3)，24-膽甾烯-酰胺(化合物4)，N，N-二甲基-24-膽甾烯-酰胺(化合物5)，以及N-甲氧基-24-膽甾烯-酰胺(化合物6)接依照下列方式合成在二甲基甲酰胺中溶入一類固醇24-羧酸(Sigma，St.Louis，Missouri)、一胺類、二乙基氰基磷酸鹽(Aldrich，Milwaukee，Wisconsin)，以及三乙基胺。在20-70℃之間攪拌該溶液12-16小時(shí)，以冰塊冷卻之后再以乙酸乙酯萃取。接著分別以1.0N鹽酸溶液、1.0N氫氧化鈉溶液清洗該萃取液，接著再以無水硫酸鈉吸去多余水分。將乙酸乙酯移去，并在必要時(shí)以硅石層析法純化而得一粗產(chǎn)物。
實(shí)施例2報(bào)告基因反式激活檢驗(yàn)將人類胚胎腎臟293細(xì)胞以每孔105個(gè)細(xì)胞的密度種入48孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)基使用Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，并以10％胎牛血清補(bǔ)充。培養(yǎng)24小時(shí)之后，以磷酸鹽共沉淀法將250ng之pGL3/UREluc報(bào)告基因、40ng之pSG5/hRxRα、40ng之pSG5/rUR或CMX/hLXRα、10ng之pSG5/hGrip1、0.4ng之CMV/R-luc(轉(zhuǎn)染正?；瘓?bào)告基因，Promega)、以及250ng之載體DNA轉(zhuǎn)染至每一孔細(xì)胞中，其中該pGL3/UREluc報(bào)告基因系由三拷貝AGGTCAagccAGGTCA組成，其融合于位于質(zhì)?；A(chǔ)基因pGL3(Promega，Madison，WI)之螢火蟲螢光酶基因之前的人類c-fos啟動(dòng)子的-56至+109位核苷酸。再培養(yǎng)12-24小時(shí)之后，以磷酸緩沖溶液清洗該培養(yǎng)皿，接著再以DMEM及4％脫脂胎牛血清提供養(yǎng)分。將一包含待測(cè)化合物(例如化合物2或3)之乙醇溶液加入雙份的該DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，最終該待測(cè)化合物之濃度為1-10μM、而乙醇濃度為0.2％。之后再培養(yǎng)24-48小時(shí)，收集該細(xì)胞，并在單光螢光儀(Becton Dickenson、Mountain View、CA)下以商業(yè)試劑盒(Premega Dual luciferase II)檢驗(yàn)其螢光酶活性。
該檢測(cè)結(jié)果顯示，化合物2和化合物3皆為L(zhǎng)XRα和UR之有效激動(dòng)劑。
實(shí)施例3對(duì)飲食誘發(fā)的高膽固醇血癥小鼠的作用以二組三個(gè)月大的non-Swiss白化小鼠(Harlan，Indianapolic，Indiana)分別作為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，并皆喂食含有1％之飼料7天(Harlan Teklad 7001，Harlan，Indianapolis，Indiana)。接著在對(duì)照組的飲水中加入0.25％羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin)(HPCD，Acros Organic，Somerville，NewJersey)而實(shí)驗(yàn)組則在其飲用水中加入0.25％HPCD以及化合物2(0.125、0.25及0.5g/L)。小鼠對(duì)于飼料及飲水皆可自由取用而非強(qiáng)迫。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之飲水量相差不到10％。
讓小鼠禁食4小時(shí)之后收集其血液，并以商業(yè)試劑盒(Sigma，St.Louis，MO)利用酶學(xué)方法量測(cè)其血液中膽固醇及三酸甘油酯之含量。利用Warnick等，Clin.Chem.1982，281379-88所述之方法可分離出高濃度之脂蛋白膽固醇，并以酶學(xué)定量。而利用Bligh等，Canadian J.Biochem.Physiol.1959，37911918所述之方法則可分離并定量肝臟中之膽固醇及三酸甘油酯。利用Turiey等，J.Cardiovasc.Pharmacol.1996，2771-79所述之方法，以硼氫化鈉將殘余之膽汁酸還原，接著萃取并以商業(yè)試劑盒(Sigma，St.Louis，MO)定量之。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出，小鼠飲食中之膽固醇雖未增加其血液中之膽固醇含量，但卻增加其肝臟中之膽固醇含量。攝取化合物2可防止肝臟中的膽固醇含量增加，并可增加殘余膽汁酸的分泌以加速除去膽固醇。在血清及肝臟中的三酸甘油酯含量則不因化合物2之?dāng)z取與否而改變。
易于發(fā)生動(dòng)脈硬化之雄性小鼠C57BL/6J(Jackson Laboratory，BarHarbor，ME)亦接受相同之研究。在化合物2劑量改變的方法中，該雄性鼠血清中之膽固醇含量降低，而血清中之三酸甘油酯含量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中則并未劇烈增加。
實(shí)施例4對(duì)飲食誘發(fā)的高膽固醇血癥倉(cāng)鼠的作用倉(cāng)鼠(非小鼠或大鼠)的膽汁酸及血液中的膽固醇量變曲線(profile)與人類相仿。人類與倉(cāng)鼠血清中的主要膽固醇載體屬于低密度脂蛋白(LDL)，而小鼠與大鼠的則是高密度脂蛋白(HDL)。因此本實(shí)施例利用倉(cāng)鼠來評(píng)估化合物2對(duì)于膽固醇及三酸甘油酯之量變曲線的影響。
倉(cāng)鼠系以口服方式攝取化合物2，為期二周，其劑量最高為200mg/Kg/日，喂養(yǎng)該倉(cāng)鼠之飼料則為正常飼料(chow diet)。該倉(cāng)鼠之血清膽固醇或三酸甘油酯含量并未變化。另一方面，當(dāng)化合物2被倉(cāng)鼠攝取而正常飼料中添加1％膽固醇時(shí)，可防止血清膽固醇或肝臟中膽固醇酯的增加。有攝取化合物2之倉(cāng)鼠，其血清三酸甘油酯含量遠(yuǎn)高于空白組。然而喂養(yǎng)正常飼料之對(duì)照組動(dòng)物亦有相同之三酸甘油酯含量，且該含量在Trautwein等、Comp.Biochem.Physiol.A Mol.Integ.Physiol.1999，12493-103所做的報(bào)告中系屬于正常范圍?？瞻捉M倉(cāng)鼠降低之三酸甘油酯含量或許是由于其肝臟中大量累積之膽固醇酯。
實(shí)施例5對(duì)飲食誘發(fā)的高膽固醇血癥大鼠的作用本實(shí)施例之動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與實(shí)施例4所用的相同，除了實(shí)施例中的倉(cāng)鼠與化合物2，分別換成雄性三個(gè)月大的Harlan Sprague-Dawley大鼠(Harlan Indianapolis，Indiana)與化合物3。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物3與化合物2相似，皆具有降低膽固醇的效果。
實(shí)施例6本發(fā)明化合物影響ApoE基因表達(dá)之體外研究(1)在大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物系以LaDu等，J.Biol.Chem.，2000，275(43)33974-80中所描述的方法，自剛出生-2天之Harlan Sprague-Dawley幼鼠(Harlan，Indianapolis，Indiana)的大腦皮質(zhì)制備而得。在實(shí)驗(yàn)開始之前，該星形膠質(zhì)細(xì)胞需成長(zhǎng)至約填滿培養(yǎng)皿90％面積。該細(xì)胞培養(yǎng)基換成含有N2養(yǎng)分的限制必要培養(yǎng)基(MEM)(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，Maryland)，并且以三倍量加入化合物2(0.1-1mM/L)。培養(yǎng)48-72小時(shí)之后，收集特定條件化之培養(yǎng)基并與SDS填充緩沖溶液混合。通過添加SDS上樣緩沖溶液至培養(yǎng)盤中，可原位得到細(xì)胞裂解物。
依照LaDu等(見上)所述之方法進(jìn)行蛋白印跡分析。將細(xì)胞裂解物和特定條件之培養(yǎng)基注入梯度為4-20％之SDS-聚丙烯酰胺電泳膠之中，并在電泳結(jié)束之后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。以氨基黑對(duì)該硝化纖維素膜進(jìn)行染色，再以蒸餾水除去染色。對(duì)蛋白質(zhì)之染色結(jié)果進(jìn)行掃瞄之后，以含有0.2％Tween 20及1％脫脂奶粉之磷酸緩沖液封阻該硝化纖維素膜。以抗鼠ApoE多克隆抗體、辣根過氧化酶結(jié)合之山羊抗兔IgG、chmiluminescent底物(Pierce，Rockford，IL)及X光膠片來測(cè)定ApoE的表達(dá)量。
與空白組相比較之下，攝取化合物2之實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞裂解物中之ApoE含量均較高。
(2)在人類THP-1細(xì)胞中以人類單核細(xì)胞系中之THP-1細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)，進(jìn)行實(shí)施例6之體外試驗(yàn)。更精確地說，該細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前系保存在以10％胎牛血清補(bǔ)充之RPMI1640培養(yǎng)基之中，并以PMA活化24小時(shí)。之后以CellgroTM完整培養(yǎng)基(Mediatech，F(xiàn)isher Scientific，Pittsburgh，PA)替換原有之培養(yǎng)基，接著加入一含有化合物2(濃度為0.1-1M/L)之乙醇溶液。靜置48-72小時(shí)之后收獲該細(xì)胞。測(cè)定細(xì)胞中ApoE含量之方法如前所述。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，攝取化合物2會(huì)增加分泌的及與細(xì)胞相關(guān)之ApoE含量。
實(shí)施例7ApoE基因表達(dá)之動(dòng)物研究以含有1.25％膽固醇、0.5％膽酸及15％玉米油之飼料，連續(xù)喂食20只四個(gè)月大的雄性C57BL/6J小鼠8周。將20只小鼠分成4組，每組5只。其中三組之飲用水含有0.25％HPCD及不同濃度的化合物2，以使該三組之小鼠每天分別攝取25、50及100mg/Kg體重。第四組則未攝取化合物2。8周之后，犧牲該20只小鼠并收集其大腦。每組所收集之大腦利用含酚之試劑(TrizolTMreagent，Life Technologies，Gaithersburg，Maryland)分離出ApoE基因之mRNA。以Northern印跡法分析該mRNA以決定ApoE基因之表達(dá)量。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組之ApoE mRNA含量較空白組為高，表示攝取化合物2會(huì)減低循環(huán)系統(tǒng)中的膽固醇含量，抑制肝臟中的膽固醇堆積。
實(shí)施例8ApoE基因表達(dá)之動(dòng)物研究以致粥瘤性(atherogenic)飼料(15％油脂，0.2％膽固醇)喂食20只缺乏LDL受體基因之小鼠，并以每組5只分為4組，每天攝取含有化合物2分別為0(對(duì)照組)、25、50及100mg/體重Kg之飲用水，為期二周，水中并含有0.25％之HPCD。兩周之后，犧牲該小鼠并收集其各部位組織(例如肝臟、大腦和腸)，并以實(shí)施例7所述之方法分析各部位組織。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組之總血清膽固醇含量為700mg/dL，而對(duì)照組則為1400mg/dL。實(shí)驗(yàn)組腦中之ApoE mRNA含量則為對(duì)照組的4-5倍。以抗ApoE探針進(jìn)行原位雜交的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大腦中的mRNA較對(duì)照組為高，尤其是位于海馬回和大腦皮質(zhì)層二部位。
實(shí)施例9抗炎癥作用之動(dòng)物研究本實(shí)驗(yàn)系依照Tonilli等，Endocrinology 1965，77625-634所述之方法執(zhí)行。以1％巴豆油、25％吡啶、60％乙醚、5％水以及待測(cè)化合物4或化合物6，制成一巴豆油混合液，使用在non-Swiss雄性白化鼠Harlan(Indianapolis，Indiana)。
每只小鼠的右耳之正反兩面皆涂上100mL之巴豆油混合液，6小時(shí)之后剪下其右耳并量其重量。結(jié)果顯示，以含有化合物4或化合物6之混合液涂布的耳朵所增加的重量，遠(yuǎn)低于僅涂布巴豆油的耳朵所增加的重量。因此，該化合物為有效之抗炎癥制劑。
需注意的是，上述僅為本發(fā)明的一些具體實(shí)施例。但是，在不脫離本發(fā)明基本架構(gòu)的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)，其皆應(yīng)為本專利以下所主張之權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種式(I)之化合物 其中，每一R1、R2、R3、R4、R4’、R5、R6、R7、R11、R12、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、烷基、鹵烷基、羥基、氨基、羧基、氧、磺酸基、或任選地插入了-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR’-、或-NR’-CO-的烷基；或R3與R4一起、R4與R5一起、R5與R6一起、或R6與R7一起進(jìn)行消去從而在其所連接之碳原子之間形成一個(gè)C＝C鍵；每一R8、R9、R10、R13、及R14，分別獨(dú)立為氫、鹵素、烷基、鹵烷基、羥烷基、烷氧基、羥基或氨基；n為0、1或2；A為亞烷基、亞烯基或亞炔基；以及每一X、Y及Z，分別獨(dú)立為烷基、鹵烷基、-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”；或X及Y一起為＝O、＝S或＝NR’；其中每一R’及R”分別獨(dú)立為氫、烷基或鹵烷基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中每一R5及R6，分別獨(dú)立為氫、烷基、鹵烷基、羥基或氨基。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中R5為氫；以及R6為羥基。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中X及Y一起為＝O或＝S；以及Z為-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中X及Y一起為＝O；以及Z為-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”。
6.權(quán)利要求4的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
7.權(quán)利要求5的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
8.權(quán)利要求7的化合物，其中每一R1、R2、R4、R4’、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫；R3為羥基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為烷基；以及A為亞烷基。
9.權(quán)利要求3的化合物，其中每一X、Y及Z，分別獨(dú)立為烷基、鹵烷基、-OR’、或-SR’。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
11.權(quán)利要求10的化合物，其中每一R1、R2、R4、R4’、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫；R3為羥基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為烷基；以及A為亞烷基。
12.權(quán)利要求1的化合物，其中R5及R6一起進(jìn)行消去從而在該R5及R6所連接之碳原子之間形成一個(gè)C＝C鍵。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中X及Y一起為＝O或＝S；以及Z為-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中X及Y一起為＝O；以及Z為-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”。
15.權(quán)利要求13的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
16.權(quán)利要求14的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中每一R1、R2、R4、R4’、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、烷基、鹵烷基、羥基、或氨基；R3為羥基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為烷基；n為0；以及A為亞烷基。
18.權(quán)利要求12的化合物，其中每一X、Y及Z，分別獨(dú)立為烷基、鹵烷基、-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”。
19.權(quán)利要求18的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
20.權(quán)利要求19的化合物，其中R3為羥基；以及每一R10及R13，分別獨(dú)立為烷基。
21.權(quán)利要求1的化合物，其中X及Y一起為＝O或＝S；以及Z為-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”。
22.權(quán)利要求21的化合物，其中X及Y一起為＝O；以及Z為-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”。
23.權(quán)利要求21的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R5、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
24.權(quán)利要求22的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R5、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
25.權(quán)利要求24的化合物，其中每一R1、R2、R4、R4’、R5、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫；每一R3及R6，分別獨(dú)立為氫、或羥基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為烷基；n為0；以及A為亞烷基。
26.權(quán)利要求1的化合物，其中每一X、Y及Z，分別獨(dú)立為烷基、鹵烷基、-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”。
27.權(quán)利要求26的化合物，其中每一X、Y及Z，分別獨(dú)立為烷基、鹵烷基、-OR’、或-SR’。
28.權(quán)利要求26的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R5、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
29.權(quán)利要求27的化合物，其中每一R1、R2、R3、R4、R4’、R5、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、鹵烷基、羥基或氨基；每一R10及R13，分別獨(dú)立為氫、烷基、或鹵烷基；n為0；以及A為亞烷基。
30.權(quán)利要求29的化合物，其中每一R1、R2、R4、R4’、R5、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫；每一R3及R6，分別獨(dú)立為氫或羥基；以及每一R10及R13，分別獨(dú)立為烷基。
31.權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物為
32.一種藥物組合物，包括一有效量的具有下式化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物 其中，每一R1、R2、R3、R4、R4’、R5、R6、R7、R11、R12、R15、R16、及R17，分別獨(dú)立為氫、鹵素、烷基、鹵烷基、羥基、氨基、羧基、氧、磺酸基、或任選地插入了-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR’-、或NR’-CO-的烷基；或R3與R4一起、R4與R5一起、R5與R6一起、或R6與R7一起進(jìn)行消去從而在其所連接之碳原子之間形成一個(gè)C＝C鍵；每一R8、R9、R10、R13、及R14，分別獨(dú)立為氫、鹵素、烷基、鹵烷基、羥烷基、烷氧基、羥基或氨基；n為0、1或2；A為亞烷基、亞烯基或亞炔基；以及每一X、Y及Z，分別獨(dú)立為烷基、鹵烷基、-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”；或X及Y一起為＝O、＝S或＝NR’；其中每一R’及R”，分別獨(dú)立為氫、烷基或鹵烷基；以及一藥物學(xué)上可接受之載體。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中X及Y一起為＝O或＝S；以及Z為-OR’、-SR’、-NR’R”、-N(OR’)R”、或-N(SR’)R”。
34.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中每一X、Y及Z，分別獨(dú)立為烷基、鹵烷基、-OR’、或-SR’。
35.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中該化合物為
全文摘要
一種式(I)之化合物，其中每一R
文檔編號(hào)A61P25/28GK1585777SQ02813426
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2002年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月3日
發(fā)明者廖述宗, 宋慶 申請(qǐng)人:芝加哥大學(xué)