專利名稱：β－淀粉樣蛋白－類似物－T－細(xì)胞表位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改善阿爾茲海默氏病(AD)和其他以淀粉樣蛋白沉積為特征，例如以淀粉樣蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中沉積為特征的疾病的治療和預(yù)防。更具體地說，本發(fā)明提供一種通過在遭受或有風(fēng)險(xiǎn)遭受具有涉及淀粉樣蛋白沉積病理特征的疾病的患者中產(chǎn)生抗相關(guān)蛋白(APP或Aβ)或其組分的抗體來下調(diào)(不需要的)淀粉樣蛋白沉積的方法。本發(fā)明還提供生產(chǎn)在該方法中所用多肽的方法及如此修飾的多肽。本發(fā)明還包括編碼修飾多肽的核酸片段以及整合這些核酸片段的載體，及以此轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞和細(xì)胞系。最后，本發(fā)明還提供一種新型的結(jié)合物肽免疫原。
背景技術(shù)：
淀粉樣變性是導(dǎo)致組織損傷和疾病的不溶性蛋白原纖維的細(xì)胞外沉積(Pepys，1996；Tan等，1995；Kelly，1996)。當(dāng)正常可溶性蛋白和肽以異常方式進(jìn)行自交聯(lián)時(shí)，原纖維形成(Kelly，1997)。
淀粉樣蛋白與嚴(yán)重疾病，包括系統(tǒng)淀粉樣變性病、AD、成熟期發(fā)作糖尿病(maturity onset diabetes)、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、額顳癡呆(fronto-temporal dementia)和朊病毒相關(guān)的傳染性海綿狀腦病(人的庫魯病和克雅病及綿羊和牛的癢病)有關(guān)，在例如阿爾茲海默氏病中淀粉樣蛋白斑的形成，似乎與人的疾病發(fā)展最相關(guān)。已顯示在沉積物中發(fā)現(xiàn)的蛋白，如β-淀粉樣蛋白在動物模型中的過量表達(dá)或修飾形式的表達(dá)誘導(dǎo)疾病的各種癥狀，例如阿爾茲海默氏病樣癥狀。目前沒有針對淀粉樣蛋白沉積的特異性治療，而且這些疾病通常是致命的。
淀粉樣蛋白原纖維的亞基可以是野生型、變異的或截短的蛋白，在體外，從寡肽和變性蛋白可形成類似的原纖維(Bradbury等，1960；Filshie等，1964；Burke & Rougvie，1972)。原纖維多肽組分的性質(zhì)決定淀粉樣變性病的特征。盡管淀粉樣蛋白的大小、天然結(jié)構(gòu)和功能差別很大，但所有淀粉樣蛋白原纖維都是長度不定的、無分支、直徑為70-120，對剛果紅表現(xiàn)出特征性染色(Pepys，1996)。它們特征在于交叉的β-結(jié)構(gòu)(Pauling & Corey，1951)，其中多肽鏈組織成β-折疊形式。雖然淀粉樣蛋白具有非常不同的前體結(jié)構(gòu)，但它們都可經(jīng)歷一種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，或許沿類似的途徑，轉(zhuǎn)換成β-折疊螺旋原纖維構(gòu)件的錯(cuò)折疊形式。
這種獨(dú)特的纖維模式導(dǎo)致稱為β-纖絲狀的淀粉樣變性病，(Glenner，1980a，b)，AD的原纖維蛋白在其二級結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)前稱為β-蛋白(Glenner & Wong，1984)。目前，特征性交聯(lián)β-衍射模式與原纖維的出現(xiàn)和著色性能一起成為可接受的淀粉樣蛋白的診斷標(biāo)記，而且暗示，雖然原纖維從非常不同的蛋白前體形成，但不管其前體蛋白的性質(zhì)如何，它們在一定程度上具有結(jié)構(gòu)相似性，并包含一種結(jié)構(gòu)超家族(SundeM，Serpell LC，Bartlam M，F(xiàn)raser PE，Pepys MB，Blake CCFJ Mol Biol 1997Oct 31；273(3)729-739)。
AD是最廣泛和熟知的疾病之一，所述疾病中存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的淀粉樣蛋白沉積物暗示在疾病發(fā)展中起到中心作用。
AD阿爾茲海默氏病(AD)是一種不可逆的漸進(jìn)性腦疾病，其逐漸發(fā)生，并導(dǎo)致記憶喪失、行為和個(gè)性改變及智力下降。這些喪失與腦細(xì)胞死亡及它們之間連接的下降相關(guān)。該病的成因因人而異，如同下降的速度。平均來講，雖然該病可持續(xù)達(dá)20年，但確診后的AD患者只活8到10年。
AD分階段地發(fā)展，從早期輕度遺忘到精神功能的嚴(yán)重喪失。這種喪失已知為癡呆。在多數(shù)患有AD的人中，癥狀首先在60歲以后表現(xiàn)出來，但更早的發(fā)作并不罕見。最早期的癥狀通常包括近期記憶喪失、判斷錯(cuò)誤和個(gè)性改變。通常，處于AD初期的人思考較不清晰，忘記熟悉的人和一般物體的名稱。在疾病晚期，他們甚至可能忘記如何做簡單的事情。最后，患有AD的人喪失所有推理能力，變得依賴他人對其日常生活的照顧。最終，該病變得非常惡化以至于患者臥床不起，并可能發(fā)展其他疾病和感染。最常見地，患有AD的人死于肺炎。
雖然AD發(fā)生的危險(xiǎn)隨年齡而增加，但AD和癡呆癥狀并不是正常衰老的一部分。AD和其他癡呆疾病是由影響腦的疾病引起的。在正常衰老中，腦中的神經(jīng)細(xì)胞并不大量丟失。相反，AD破壞三個(gè)關(guān)鍵過程神經(jīng)細(xì)胞通訊、新陳代謝和修復(fù)。這種破壞最終導(dǎo)致許多神經(jīng)細(xì)胞停止機(jī)能，喪失與其他神經(jīng)細(xì)胞的聯(lián)系，并死亡。
首先，AD破壞控制記憶的腦部分特別是海馬和相關(guān)結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)元。由于在海馬中的神經(jīng)細(xì)胞完全停止機(jī)能，所以造成短期記憶喪失，而且常常人做容易和熟悉事情的能力開始下降。AD也攻擊大腦皮層，特別是負(fù)責(zé)語言和推理的區(qū)域。最后，許多腦的其他區(qū)域也參與進(jìn)來，所有這些腦區(qū)萎縮(收縮)，AD患者變得臥床不起、失禁、完全無助、對外界不反應(yīng)(來源National Institute on Aging Progress Report onAlzheimer′s Disease，1999)。
AD的沖擊AD是65歲及以上的人中癡呆的最普遍原因。由于其對個(gè)人、家庭、健康護(hù)理系統(tǒng)和整個(gè)社會的巨大沖擊，AD已成為一個(gè)主要的健康問題?？茖W(xué)家估計(jì)，當(dāng)前有超過4百萬的人遭受該病，而且這種趨勢在65歲以上的人中每5年翻一番。另外也估計(jì)大約每年有360,000新病例(發(fā)病率(incidence))發(fā)生，可是該數(shù)字隨人口年齡而增加(Brookmeyer等，1998)。
AD給社會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。一項(xiàng)在美國進(jìn)行的最新研究估計(jì)，每年用于一位AD患者的看護(hù)費(fèi)用，對一個(gè)患有輕度AD的患者來說，是$18,408，對患有中度AD的患者是$30,096，對患有嚴(yán)重AD的患者是$36,132。在美國，估計(jì)每年用于看護(hù)AD患者的國家花費(fèi)略高于$500億(Leon等，1998)。
大約400萬美國人是85歲或更老，而且在大多數(shù)工業(yè)化國家，該年齡群是人口中增長最快的一部分。估計(jì)在美國，到2030年，該群體將接近850萬；一些研究人口趨勢的專家暗示該數(shù)字甚至可能更大。隨著越來越多的人活的更長，受衰老疾病，包括AD，影響的人數(shù)將繼續(xù)增長。例如，一些研究表明，年齡為85歲和更老的人中大約有一半患有某種形式的癡呆癥(National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer′s Disease，1999)。
AD的主要特征AD的標(biāo)志是腦中的兩個(gè)異常結(jié)構(gòu)淀粉樣蛋白斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)。斑是密集的，是在腦神經(jīng)元外部和周圍蛋白和細(xì)胞物質(zhì)的大量不溶性沉積物。纏結(jié)是在神經(jīng)元內(nèi)部形成的不溶的纏結(jié)的纖維。
存在兩種類型的AD家族性AD(FAD)和偶發(fā)性AD，家族性AD遵循一個(gè)確定的遺傳模式，而在偶發(fā)性AD中沒有觀察到明顯的遺傳模式。由于發(fā)作年齡的差異，AD進(jìn)一步可描述為早期發(fā)作型(在小于65歲的人中發(fā)生)或晚期發(fā)作型(在65歲和更老的人中發(fā)生)。早期發(fā)作型AD是罕見的(大約有10％病例)，通常影響30-60歲的人。某些形式的早期發(fā)作型AD是遺傳的，在家族中流行。早期發(fā)作型AD也經(jīng)常比更普遍的晚期發(fā)作型發(fā)展更快。
所有迄今已知的FADs都有早期發(fā)作，現(xiàn)在已知有50％FAD病例由位于三個(gè)不同染色體上的三個(gè)基因的缺陷造成。它們是染色體21上APP基因的突變；染色體14上一個(gè)稱為早老素(presenilin)1的基因突變；和染色體1上一個(gè)稱為早老素2的基因突變。然而還沒有證據(jù)證明這些突變中任何一個(gè)也在更普遍的偶發(fā)性或非家族性晚期發(fā)作AD中起主要作用(National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer′s Disease，1999)。
淀粉樣蛋白斑在AD中，淀粉樣蛋白斑首先在用于記憶和其他認(rèn)知功能的腦區(qū)域中發(fā)生。它們包含β淀粉樣蛋白(此后命名為Aβ)的大量不溶性沉積物，所述β淀粉樣蛋白為稱為淀粉樣蛋白前體蛋白(APP，其氨基酸序列列于SEQ ID NO2中)的較大蛋白的蛋白片段-混合以部分神經(jīng)元和非神經(jīng)細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。目前不知道是否淀粉樣蛋白斑自身構(gòu)成AD的主要原因或是否它們是AD過程的副產(chǎn)物。當(dāng)然，APP蛋白的改變可導(dǎo)致AD，如在由APP基因突變導(dǎo)致的遺傳型AD中，而且Aβ斑的形成似乎與人疾病的發(fā)展緊密相關(guān)(Lippa C.F.等，1998)。
APPAPP是許多與細(xì)胞膜相關(guān)的蛋白質(zhì)中的一個(gè)。當(dāng)它合成后，APP嵌入到神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜中，部分在細(xì)胞內(nèi)，部分在細(xì)胞外。最近用轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明，APP在神經(jīng)元的生長和存活中似乎起到重要作用。例如，一定形式和數(shù)量的APP可以保護(hù)神經(jīng)元免受短期和長期損傷，并使損傷的神經(jīng)元能更好地修復(fù)自己，而且在腦損傷后，可幫助部分神經(jīng)元生長。
當(dāng)APP嵌入到細(xì)胞膜中時(shí)，蛋白酶作用在APP的特定位點(diǎn)，將其切割為蛋白片段。一種蛋白酶幫助將APP切割形成Aβ，另一種蛋白酶在淀粉樣蛋白片段中部切割A(yù)PP，從而使Aβ不能形成。形成的Aβ有兩種不同長度，較短的40(或41)個(gè)氨基酸的Aβ，它是相對可溶的且聚集緩慢，稍微較長的，42個(gè)氨基酸的“粘性”Aβ，它能夠很快形成不溶的團(tuán)塊。當(dāng)形成Aβ時(shí)，還不確切知道它是如何通過或圍繞神經(jīng)細(xì)胞移動的。在該過程的最后階段，“粘性”Aβ在細(xì)胞外聚集成長絲，并與已死和將死的神經(jīng)元片段及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞形成作為腦組織中AD特征的斑。
一些存在證據(jù)表明，APP中的突變賦予使Aβ從APP前體中剪切出來，從而產(chǎn)生更多的總Aβ或相對更多的“粘性”形式更多的可能性。它還顯示早老素基因的突變可至少以兩種方式造成神經(jīng)元的退化通過修飾Aβ產(chǎn)生或更直接地通過引發(fā)細(xì)胞的死亡。其他研究者提示突變的早老素1和2可能參與加速細(xì)胞凋亡速度。
預(yù)期隨著疾病的進(jìn)行，將會產(chǎn)生越來越多的病斑，填充越來越多的腦區(qū)。研究提示Aβ可能以一種動態(tài)平衡的形式同時(shí)進(jìn)行聚集和解聚。這給我們帶來如下希望，即甚至有可能在斑形成后再對其進(jìn)行降解(National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer′s Disease，1999)。
認(rèn)為Aβ對神經(jīng)元是有毒性的。在組織培養(yǎng)研究中，研究者發(fā)現(xiàn)，與過量表達(dá)正常人APP的神經(jīng)元相比較，改造成過量表達(dá)突變形式的人APP的海馬神經(jīng)元細(xì)胞死亡增加(Luo等，1999)。
另外，在動物模型中已表明，過量表達(dá)或表達(dá)修飾形式的Aβ蛋白誘導(dǎo)阿爾茲海默氏病癥狀(Hsiao K.等，1998)。
假定Aβ產(chǎn)生增加、其聚合為斑和由此造成的神經(jīng)毒性可能導(dǎo)致AD，那么調(diào)查可降低或甚至阻斷Aβ聚集為斑的條件是具有治療意義的。
早老素早老素-1(S-180)中的突變大約占所有早期發(fā)作家族性AD(FAD)病例的50％。已鑒定大約30個(gè)導(dǎo)致AD的突變。AD的發(fā)作隨突變而異。早老素-2中的突變占FAD病例更小得多的部分，但仍是一個(gè)重要因素。目前還不知道早老素是否參與偶發(fā)性非家族性AD。早老素的功能是未知的，但由于在具有早老素突變的AD患者中Aβ-42水平增加，因此它們似乎參與APP的加工以產(chǎn)生Aβ-42(較長較粘形式的肽，SEQ ID NO2中，殘基673-714)。不清楚早老素是否也在NFT’s產(chǎn)生中具有作用。一些提示早老素在神經(jīng)元退化和神經(jīng)元死亡中具有更直接的作用。早老素-1位于染色體14上，而早老素-2在染色體1上。如果一個(gè)人具有這些基因中僅一個(gè)突變形式，他或她幾乎一定會發(fā)生早期發(fā)作型AD。
關(guān)于早老素-1是否與假設(shè)的參與APP加工過程的γ-分泌酶一致仍存在一些不確定性(Naruse等，1998)。
載脂蛋白E載脂蛋白E通常與膽固醇相關(guān)，但在AD腦的病斑和纏結(jié)中也發(fā)現(xiàn)存在。盡管等位基因1-3似乎并不參與AD，但APOE-ε4等位基因的存在和晚期AD的發(fā)展有重要關(guān)系(Strittmatter等，1993)。然而它是一個(gè)危險(xiǎn)因素，不是與早老素及APP突變情況一樣的直接原因，而且它并不限定在家族性AD中。
還不確切知道APOEε4蛋白增加發(fā)生AD可能性的途徑，但一個(gè)可能的理論是，它促進(jìn)Aβ的構(gòu)建，這造成AD發(fā)作年齡的降低，或者存在或不存在APOE等位基因可能影響神經(jīng)元對損傷應(yīng)答的方式(Buttini等，1999)。
另外表明Apo A1是淀粉樣蛋白原性的(amyloigenic)。在體外，完整的apo A1自身可形成剛果紅陽性的淀粉樣蛋白樣的原纖維(Am J Pathol147(2)238-244(Aug 1995)，Wisniewski T，Golabek AA，Kida E，Wisniewski KE，F(xiàn)rangione B)。
存在一些矛盾的結(jié)果，即相對于其他等位基因，APOE-ε4等位基因在降低智力喪失癥狀中具有一個(gè)正向作用(Stern，Brandt，1997，Annalsof Neurology 41)。
神經(jīng)原纖維纏結(jié)第二個(gè)AD標(biāo)記包括在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的纏結(jié)的絲的異常集合。纏結(jié)的主要成分是稱為tau(τ)的蛋白的一種形式。已知在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，tau蛋白結(jié)合并穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)部支持結(jié)構(gòu)或骨架的構(gòu)件的微管。但是，在AD中，tau進(jìn)行化學(xué)改變，該改變的tau不再穩(wěn)定微管，而是造成它們的分解。這種運(yùn)輸系統(tǒng)的瓦解首先導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞間通訊故障，隨后可能導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。
在AD中，化學(xué)改變的tau纏結(jié)為配對的螺旋絲-兩股互相交纏的tau。這些絲是在神經(jīng)原纖維纏結(jié)中發(fā)現(xiàn)的主要物質(zhì)。在一項(xiàng)最近的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)，在健康腦的海馬的特定部分中，少于6％的神經(jīng)元發(fā)生神經(jīng)原纖維變化，而在死于輕度AD的人中則為這些神經(jīng)元的多于43％，在死于嚴(yán)重AD的人中為這些神經(jīng)元的多于71％。在研究神經(jīng)元的丟失中發(fā)現(xiàn)類似的遞進(jìn)關(guān)系。該證據(jù)支持隨著AD的進(jìn)程同時(shí)存在纏結(jié)的形成和神經(jīng)元發(fā)展的損失的觀點(diǎn)(National Institute on Aging Progress Report onAlzheimer′s Disease，1999)。
Tauopathies和纏結(jié)除AD外，幾種神經(jīng)變性疾病特征在于在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)中tau聚集成不溶性細(xì)絲，導(dǎo)致功能紊亂和死亡。最近，幾組研究患有除AD外的多種遺傳型癡呆家族的研究者發(fā)現(xiàn)，tau基因的第一個(gè)突變在染色體17上(Clark等，1998；Hutton等，1998；Poorkaj等，1998；Spillantini等，1998)。在這些家族中，tau基因的突變導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和癡呆。這些與AD具有一些共同特征，但在幾個(gè)主要方面有所不同的疾病，總稱為“與染色體17相關(guān)的額顳癡呆和帕金森病”(FTDP-17)。這些疾病是，例如帕金森病、某些形式的肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(ALS)、皮質(zhì)退化(corticobasal degeneration)、進(jìn)行性核上性麻痹和皮克病，均以tau蛋白異常聚集為特征。
其他AD樣神經(jīng)疾病AD和其他神經(jīng)疾病，包括朊病毒病(如庫魯病，克雅病和牛海綿狀腦炎)、帕金森病、亨廷頓舞蹈病和額顳癡呆，具有重要的平行性。所有這些疾病都涉及在腦中異常蛋白的沉積。AD和朊病毒病導(dǎo)致癡呆和死亡，二者都與不溶性淀粉樣蛋白原纖維的形成有關(guān)，但從膜蛋白來講彼此不同。
研究AD之后第二個(gè)最普遍的神經(jīng)變性疾病-帕金森病的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)與該病相關(guān)的第一個(gè)基因。該基因編碼一個(gè)稱為synuclein的蛋白，感興趣的是，該蛋白也發(fā)現(xiàn)于AD患者腦的淀粉樣蛋白斑中(Lavedan C，1998，Genome Res.8(9)871-80)。研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，另一種進(jìn)行型神經(jīng)變性疾病-亨廷頓舞蹈病中的遺傳缺陷導(dǎo)致癡呆，導(dǎo)致亨廷頓蛋白(Huntington protein)形成非常類似于AD中Aβ原纖維和朊病毒病中蛋白原纖維的不溶性原纖維(Scherzinger E等，1999，PNAS U.S.A.96(8)4604-9)。
科學(xué)家也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種新基因，當(dāng)其突變時(shí)，導(dǎo)致發(fā)生家族性British癡呆(FBD)，這是一種罕見的導(dǎo)致類似于在AD中看到的嚴(yán)重行動障礙和進(jìn)行性癡呆的遺傳病。在發(fā)現(xiàn)于FBD病斑中的淀粉樣蛋白斑的生化分析中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)稱為ABri的獨(dú)特肽(Vidal等，1999)。在該基因特定位點(diǎn)的突變導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)比正常Bri蛋白更長的蛋白。
通過Bri蛋白突變末端剪切而得到的ABri肽和淀粉樣蛋白原纖維一樣沉積。認(rèn)為這些斑導(dǎo)致神經(jīng)元機(jī)能障礙和以FBD為特征的癡呆。
用Aβ免疫免疫系統(tǒng)通常在機(jī)體中參與清除外源蛋白和蛋白質(zhì)的顆粒，但與上述疾病相關(guān)的沉積物主要包括自身蛋白，因此使免疫系統(tǒng)在控制這些疾病中的作用不太明顯。另外，沉積物通常位于與免疫系統(tǒng)分離的區(qū)間(CNS)，二者均提示任何疫苗或免疫治療方法將是無效的。
然而，科學(xué)家最近已經(jīng)嘗試用包含異源的人Aβ和已知激發(fā)免疫系統(tǒng)的物質(zhì)的疫苗對小鼠進(jìn)行免疫(Schenk等，1999和WO 99/27944)。用人APP突變基因插入到小鼠DNA中的部分轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型檢測疫苗。小鼠產(chǎn)生修飾的APP蛋白，并隨其長大而發(fā)展為淀粉樣蛋白斑。該小鼠模型用于檢測抗修飾的轉(zhuǎn)基因人APP的接種是否在斑的形成中起作用。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，一組轉(zhuǎn)基因小鼠給以每月注射的疫苗，從6周齡開始，至11月結(jié)束。第二組轉(zhuǎn)基因小鼠作為對照組不進(jìn)行注射。到13月齡，對照組小鼠具有占腦2-6％的病斑。相反，免疫小鼠中事實(shí)上沒有病斑產(chǎn)生。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，研究者在已產(chǎn)生一些病斑的第11個(gè)月開始注射。經(jīng)過7個(gè)月時(shí)間，對照轉(zhuǎn)基因小鼠腦中病斑數(shù)量增加17倍，而接受疫苗的那些小鼠與18月齡對照轉(zhuǎn)基因小鼠相比較，降低99％。在一些小鼠中，一些已存在的病斑沉積物似乎通過治療已被除去。而且也發(fā)現(xiàn)其他病斑相關(guān)的損傷，如炎癥和異常神經(jīng)細(xì)胞過程，作為免疫結(jié)果均有下降。
因此，以上是在小鼠中的初步研究，例如，科學(xué)家需要了解接種的小鼠是否在其他方面保持健康，及那些接種的小鼠是否記憶保持正常。另外，由于小鼠模型并不是AD的完全代表(動物不產(chǎn)生神經(jīng)原纖維纏結(jié)，而且其多數(shù)神經(jīng)元也不死亡)，所以需要進(jìn)行另外的研究以確定人是否有與小鼠相似或不同的反應(yīng)。另一個(gè)需要考慮的問題是該方法可能“治愈”淀粉樣蛋白沉積，但可能不能終止癡呆的發(fā)展。
技術(shù)問題也具有主要的挑戰(zhàn)性。例如，不可能用該技術(shù)制造使人產(chǎn)生抗其自身蛋白的抗體的疫苗。因此許多安全性和有效性的問題需要在任何在人中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行解決。
因此，Schenk等的工作表明，如果可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)沉積物，例如AD中形成的病斑，中的自身蛋白產(chǎn)生強(qiáng)的免疫應(yīng)答，則既有可能阻止沉積物的形成，又有可能清除已形成的病斑。
最近，由于副作用，使用上述討論的Aβ疫苗的臨床試驗(yàn)已停止進(jìn)行，所述副作用是可能由于產(chǎn)生抗CNS中Aβ的不可控制的自身免疫，大量被免疫的受試者發(fā)展為慢性腦炎。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供新型的抵抗以淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病，例如AD，的治療方法。進(jìn)一步的目的是開發(fā)一種抗淀粉樣蛋白的自身疫苗，以獲得一種新型的對涉及淀粉樣蛋白沉積的AD和其它病理疾病的治療方法。
發(fā)明概述此處所描述的是應(yīng)用一種自身免疫技術(shù)來產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗另外的無免疫原性的APP和Aβ的免疫應(yīng)答。而且也描述了這種用于預(yù)防、可能治愈或緩和與淀粉樣蛋白沉積相關(guān)的這類疾病癥狀的這類疫苗的制劑。
因此，在其最廣泛和最概括的范圍內(nèi)，本發(fā)明涉及一種在動物，包括人體內(nèi)下調(diào)淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)或β-淀粉樣蛋白(Aβ)的方法，該方法包含對動物免疫系統(tǒng)有效呈遞免疫有效量的至少一個(gè)APP或Aβ類似物，所述類似物在同一個(gè)分子中整合至少一個(gè)APP和/或Aβ的B細(xì)胞表位和至少一個(gè)外源T輔助細(xì)胞表位(TH表位)，從而用該類似物免疫動物可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗動物自源的APP或Aβ的抗體。其中所述類似物a)是由至少一個(gè)拷貝SEQ ID NO2的殘基672-714的亞序列組成的多聚氨基酸，其中外源TH表位通過氨基酸添加和/或插入和/或刪除和/或取代的方式而被引入，其中亞序列選自由SEQ ID NO2中氨基酸殘基673-714組成的氨基酸序列的殘基1-42、殘基1-40、殘基1-39、殘基1-35、殘基1-34、殘基1-28、殘基1-12、殘基1-5、殘基13-28、殘基13-35、殘基17-28、殘基25-35、殘基35-40、殘基36-42和殘基35-42；和/或b)是包含外源TH表位和打斷的APP或Aβ序列的多聚氨基酸，以使類似物不包括任何可與引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的MHC II類分子有效結(jié)合的SEQ ID NO2中的亞序列；和/或
c)是包含外源TH表位和APP或Aβ衍生的氨基酸的多聚氨基酸，并在類似物C末端包含一個(gè)單獨(dú)的甲硫氨酸殘基，其中APP或Aβ中及外源TH表位中的其他甲硫氨酸殘基已被取代或刪除，優(yōu)選已被亮氨酸或異亮氨酸取代；和/或d)是一種包含多羥基聚合物骨架的結(jié)合物，在所述骨架上分別偶聯(lián)a)中定義的多聚氨基酸和/或b)中定義的多聚氨基酸和/或c)中定義的多聚氨基酸；和/或e)是一種包含多羥基聚合物骨架的結(jié)合物，在所述骨架上分別偶聯(lián)1)外源TH表位和2)選自下述的多聚氨基酸a)中定義的亞序列、b)中定義的APP或Aβ打斷的序列、和APP或Aβ衍生的，C末端包含一個(gè)單獨(dú)的甲硫氨酸殘基的氨基酸序列，其中APP或Aβ中和外源TH表位中的其他甲硫氨酸殘基已被取代或刪除，優(yōu)選已被亮氨酸或異亮氨酸取代。
本代理人先前已提出一項(xiàng)國際專利申請，涉及抗淀粉樣蛋白原性多肽，例如APP和Aβ的安全接種策略，參閱WO 01/62284。該申請?jiān)诒旧暾埖倪f交日未公布，而且還不包括關(guān)于上述的有用的APP和Aβ類似物的詳細(xì)資料。
本發(fā)明也涉及APP和Aβ類似物及編碼這些的子集的核酸片段。包含類似物或核酸片段的免疫原性組合物也是本發(fā)明的一部分。
附例

圖1來源于淀粉樣蛋白前體蛋白的自免疫變異體，以產(chǎn)生抗Aβ蛋白Aβ-43(或C-100)的抗體應(yīng)答的示意性描述圖。APP顯示在圖的頂部，其余示意性構(gòu)件表示模式表位P2和P30被取代或插入到APP的各種剪切體中。在圖中，黑色部分表示APP的信號序列，雙向交叉陰影是APP的細(xì)胞外部分，深色豎向陰影是APP的跨膜結(jié)構(gòu)域，淺色豎向陰影是APP的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，粗交叉陰影表示P30表位，細(xì)交叉陰影表示P2表位。實(shí)線框表示Aβ-42/43，實(shí)線框和點(diǎn)線框一起表示C-100?！癆beta”表示Aβ。
圖2合成通常應(yīng)用的免疫原性結(jié)合物的實(shí)施例的示意性描述。肽A(任何抗原序列，例如，此處所述的Aβ序列)和肽B(一段包括外源T輔助細(xì)胞表位的氨基酸序列)被合成和混合。然后，將它們與合適的活化多羥基聚合物接觸，肽A和B通過活化基團(tuán)以相應(yīng)于這兩種物質(zhì)在肽混合物中的最初比例的定量進(jìn)行連接。詳見實(shí)施例4。
發(fā)明詳述定義下面將對本說明書和權(quán)利要求書中所用的大量術(shù)語進(jìn)行定義和詳細(xì)解釋，以闡明本發(fā)明的界線和范圍。
此處可互換的術(shù)語“淀粉樣蛋白”和“淀粉樣蛋白質(zhì)”表示一類長度不確定的蛋白質(zhì)無支鏈的原纖維。淀粉樣蛋白原纖維對剛果紅表現(xiàn)出特征性染色，具有交叉的β結(jié)構(gòu)，其中多肽鏈組織為β-折疊。淀粉樣蛋白通常來源于淀粉樣的蛋白質(zhì)，它們具有非常不同的前體結(jié)構(gòu)，但都將經(jīng)歷一種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為錯(cuò)折疊形式，該形式是β折疊螺旋原絲的構(gòu)件。通常，淀粉樣蛋白原纖維的直徑在大約70到約120的范圍變動。
術(shù)語“淀粉樣蛋白原性(amyloidogenic)蛋白質(zhì)”意圖表示通過如此成為沉積物的一部分或通過成為導(dǎo)致形成沉積物形成的生物合成途徑的一部分而參與形成淀粉樣蛋白沉積物的多肽。因此，淀粉樣蛋白原性蛋白的實(shí)例是APP和Aβ。但參與這些代謝的蛋白也可能是淀粉樣蛋白原性蛋白。
此處的“淀粉樣蛋白多肽”意圖表示包含上述討論的來源于人或其他哺乳動物的淀粉樣蛋白原性蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽(或其剪切體，所述剪切體與完整的淀粉樣蛋白原性蛋白質(zhì)共用許多B-細(xì)胞表位)，-淀粉樣蛋白原性多肽可因此例如包含淀粉樣蛋白原性多肽前體的實(shí)質(zhì)部分(substantial parts)(對Aβ而言，一種可能的淀粉樣蛋白多肽可以來源于APP)。從原核系統(tǒng)制備的淀粉樣蛋白原性多肽的非糖基化形式也包括在術(shù)語范圍內(nèi)，如同由于使用例如酵母或其他非哺乳類真核表達(dá)系統(tǒng)而具有的各種糖基化模式的形式。然而應(yīng)該注意，當(dāng)使用術(shù)語“淀粉樣蛋白原性多肽”時(shí)，是指所述多肽在施用于待治療動物時(shí)通常是不具有免疫原性的。換句話說，淀粉樣蛋白原性多肽是自身蛋白或這種自身蛋白的類似物，它們通常不引起抗所述動物的淀粉樣蛋白原性的免疫應(yīng)答。
“類似物”是指分子結(jié)構(gòu)中整合一個(gè)或幾個(gè)改變的APP或Aβ衍生的分子。這種改變可以是例如，APP或Aβ多聚氨基酸與合適的融合配偶體的融合形式(即，在一級結(jié)構(gòu)上僅涉及C-和/或N-末端氨基酸殘基增加的改變)，和/或它可以是在多肽氨基酸序列中的插入和/或刪除和/或取代形式。該術(shù)語也包括衍生的APP或Aβ衍生的分子，參閱以下討論的APP或Aβ修飾。在某些情況下，可以構(gòu)建類似物以致很少或甚至不能引發(fā)抗正常淀粉樣蛋白前體蛋白的抗體，從而避免對作為淀粉樣蛋白前體的多肽的(生理上正常的)非聚集形式產(chǎn)生不必要干涉。
應(yīng)注意可以設(shè)想在人中使用人的APP或Aβ異種類似物(例如，犬或豬的類似物)作為疫苗，有可能產(chǎn)生所需的抗APP或Aβ的免疫。因此這種異種類似物進(jìn)行免疫的應(yīng)用也是本發(fā)明的一部分。
本文中的術(shù)語“多肽”意圖指從2到10個(gè)氨基酸殘基的短肽、從11到100個(gè)氨基酸殘基的寡肽，和多于100個(gè)氨基酸殘基的多肽。另外，該術(shù)語也意圖包括蛋白，即，包含至少一個(gè)多肽的功能生物分子；當(dāng)包含至少兩個(gè)多肽時(shí)，這些可以共價(jià)連接或非共價(jià)連接形成復(fù)合體。蛋白質(zhì)中的多肽可以是糖基化的和/或脂化(lipidated)的和/或包含輔基。而且術(shù)語“多聚氨基酸”是術(shù)語“多肽”的等同體。
術(shù)語“T淋巴細(xì)胞”和“T細(xì)胞”可互用，表示胸腺來源的淋巴細(xì)胞，負(fù)責(zé)各種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及在體液免疫應(yīng)答中的輔助。同樣，術(shù)語“B淋巴細(xì)胞”和“B細(xì)胞”可互用，指產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞。
術(shù)語“亞序列”是指分別直接來源于天然存在的淀粉樣蛋白氨基酸序列或核酸序列的，至少3個(gè)氨基酸或當(dāng)相應(yīng)時(shí)至少3個(gè)核苷酸的任何連續(xù)的一段序列。
本文中的術(shù)語“動物”通常意圖表示動物物種(優(yōu)選哺乳動物)，例如人類、Canis domesticus等，而不是指一種單一的動物。然而，該術(shù)語也表示這種動物物種的一個(gè)群體，因?yàn)橛幸稽c(diǎn)很重要，即根據(jù)本發(fā)明的方法免疫的個(gè)體確實(shí)都具有相同的APP或Aβ，從而允許用相同的免疫原免疫動物。對熟練技術(shù)人員將是清楚的，即本文中的動物是指具有免疫系統(tǒng)的生物。優(yōu)選動物是脊椎動物，例如哺乳動物。
此處的術(shù)語“APP或Aβ的體內(nèi)下調(diào)”是指在活生物體中降低沉積的相關(guān)類型的淀粉樣蛋白質(zhì)(或同樣地淀粉樣蛋白)的總量。這種下調(diào)可通過幾種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)其中，通過抗體結(jié)合而對淀粉樣蛋白進(jìn)行簡單干涉以阻止錯(cuò)誤聚集是最簡單的方式。然而，本發(fā)明的范圍也包括抗體結(jié)合導(dǎo)致清除細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞)對淀粉樣蛋白的清除，以及抗體干涉其他導(dǎo)致淀粉樣蛋白形成的淀粉樣蛋白原性多肽。進(jìn)一步的可能性是抗體結(jié)合CNS外的Aβ，從而通過簡單的質(zhì)量作用原理從CNS中有效除去Aβ。
表述“有效呈遞…到免疫系統(tǒng)”意圖表示動物的免疫系統(tǒng)以可控方式經(jīng)受一種免疫原性挑戰(zhàn)。如以下內(nèi)容所表現(xiàn)出的，這種免疫系統(tǒng)的挑戰(zhàn)可通過多種方式實(shí)現(xiàn)，其中最重要的是用包含“藥物疫苗(pharmaccine)”的多肽(即，被給藥以治療或改善進(jìn)行性疾病的疫苗)接種或核酸“藥物疫苗”接種。要達(dá)到的重要結(jié)果是動物中免疫活性細(xì)胞以免疫有效方式對抗抗原，而達(dá)到該結(jié)果的精確方式對于支撐本發(fā)明的發(fā)明設(shè)想來說是不太重要的。
術(shù)語“免疫有效數(shù)量”在本領(lǐng)域中有其通常意義，即，一定量的免疫原，它能夠引發(fā)有效殺傷與免疫原具有相同免疫學(xué)特性的致病劑的免疫應(yīng)答。
當(dāng)使用表述APP或Aβ已被“修飾”，此處是指在APP或Aβ上已經(jīng)進(jìn)行多肽的化學(xué)修飾。例如，這種修飾可以是序列中特定氨基酸殘基的衍生化(例如烷基化)，但是，如以下描述所理解的，優(yōu)選的修飾包括氨基酸序列一級結(jié)構(gòu)的改變。
當(dāng)討論“對APP或Aβ的自耐受”時(shí)，可理解為，由于多肽是待接種群體的自身蛋白質(zhì)，因此群體中的正常個(gè)體不具有抗該多肽的免疫應(yīng)答；雖然不能排除在動物群體中個(gè)別個(gè)體可產(chǎn)生抗天然多肽的抗體，例如，作為自免疫疾病的部分。無論怎樣，動物通常僅對其自身的APP或Aβ產(chǎn)生自耐受，但不排除具有不同表型的來源于其他動物物種或群體的類似物也可能被所述動物耐受。
“外源T細(xì)胞表位”(或“外源T淋巴細(xì)胞表位”)是一種能夠結(jié)合MHC分子并刺激動物物種中T細(xì)胞的肽。本發(fā)明中優(yōu)選的外源T細(xì)胞表位是“混雜的”表位，即，與動物物種或群體中大部分特定類別的MHC分子結(jié)合的表位。這種混雜的T細(xì)胞表位僅有有限數(shù)量是已知的，它們在下面將進(jìn)行詳細(xì)討論。混雜的T細(xì)胞表位也指“通用的”T細(xì)胞表位。應(yīng)注意，根據(jù)本發(fā)明使用的免疫原對盡可能大部分的動物群體是有效的，必須1)在同一個(gè)類似物中插入幾個(gè)外源T細(xì)胞表位，或2)制備幾種類似物，其中每種類似物具有插入的不同的混雜表位。也應(yīng)注意，外源T細(xì)胞表位的概念也包括使用隱藏的T細(xì)胞表位，即，來源于自身蛋白的表位，它僅在以分離形式存在，而不是所述自身蛋白部分時(shí)發(fā)揮免疫行為。
“外源T輔助淋巴細(xì)胞表位”(外源TH表位)是一種外源T細(xì)胞表位，它與MHC II類分子結(jié)合，能夠呈遞到與MHC II類分子結(jié)合的抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面。
本文中(生物)分子的“功能部分”意圖指負(fù)責(zé)至少一個(gè)該分子發(fā)揮的生化或生理效應(yīng)的分子部分。本領(lǐng)域中眾所周知，許多酶和其它效應(yīng)分子具有一個(gè)負(fù)責(zé)所述分子發(fā)揮效應(yīng)的活性位點(diǎn)。該分子的其他部分可用于增強(qiáng)穩(wěn)定性或可溶性的目的，因此，如果在本發(fā)明的具體實(shí)施例的內(nèi)容中，這些目的是不相關(guān)的，則可以省略。例如，可能用特定的細(xì)胞因子作為APP或Aβ中的修飾部分(參閱下面的詳細(xì)討論)，在這種情況下，由于偶聯(lián)到APP或Aβ上可提供了必要的穩(wěn)定性，因此穩(wěn)定性問題是沒有關(guān)系的。
術(shù)語“佐劑”具有在疫苗技術(shù)領(lǐng)域中通常的含義，即，一種物質(zhì)或物質(zhì)的組合物，它1)本身不能引起特異的的抗疫苗免疫原的免疫應(yīng)答，但它2)盡管如此能夠增強(qiáng)抗免疫原的免疫應(yīng)答?；驌Q句話說，單獨(dú)用佐劑接種不提供抗免疫原的免疫應(yīng)答，用免疫原接種可以引起或不引起抗免疫原的免疫應(yīng)答，但用免疫原和佐劑聯(lián)合接種誘導(dǎo)比單獨(dú)免疫原誘導(dǎo)的更強(qiáng)的抗免疫原的免疫應(yīng)答。
本文中的分子“導(dǎo)向”意圖表示位置，在該位置處，導(dǎo)入在動物中的分子將在特定組織中優(yōu)選出現(xiàn)或優(yōu)選與特定的細(xì)胞或細(xì)胞類型相關(guān)。這種效果可通過多種方法來實(shí)現(xiàn)，包括在促進(jìn)導(dǎo)向的組合物中配制分子或通過在分子中引入利于導(dǎo)向的基團(tuán)，這些問題將在下面詳細(xì)討論。
“免疫系統(tǒng)的刺激”是指一種物質(zhì)或物質(zhì)的組合物表現(xiàn)出普遍的，非特異性免疫刺激效應(yīng)。大量佐劑和假定的佐劑(例如某些細(xì)胞因子)具有刺激免疫系統(tǒng)的能力。使用免疫刺激劑的結(jié)果是免疫系統(tǒng)提高“警戒”，即用免疫原同時(shí)或隨后進(jìn)行免疫時(shí)，誘導(dǎo)出比單獨(dú)使用免疫原顯著更有效的免疫應(yīng)答。
“有效結(jié)合”是指肽結(jié)合到MHC分子(I類或II類)上以能夠刺激T細(xì)胞，使其殺傷呈遞與MHC分子結(jié)合的肽的細(xì)胞。例如，如果該APC將刺激與呈遞的肽-MHC II類分子復(fù)合體結(jié)合的TH細(xì)胞，則與APC表面上MHCII類分子結(jié)合的肽被稱為是有效結(jié)合的。
下調(diào)淀粉樣蛋白的優(yōu)選實(shí)施方案優(yōu)選在本發(fā)明的方法中用作免疫原的類似物是修飾的APP或Aβ分子，其中在APP或Aβ的氨基酸序列中至少存在一中改變，因?yàn)槟菢訕O大地促進(jìn)了獲得所有重要的阻斷自耐受的機(jī)會一例如，這在本文實(shí)施例2中得到的結(jié)果可明顯看出，在實(shí)施例2中，比較了用野生型Aβ進(jìn)行的免疫與用Aβ變異分子進(jìn)行的免疫。已表明(在Dalum I等，1996，J.Immunol.1574796-4804)，在正常個(gè)體中，生理上存在識別自身蛋白的潛在自反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞。然而，為了誘導(dǎo)這些B淋巴細(xì)胞確實(shí)產(chǎn)生與相關(guān)自身蛋白反應(yīng)的抗體，需要產(chǎn)生細(xì)胞因子的T輔助淋巴細(xì)胞(TH細(xì)胞和TH淋巴細(xì)胞)的幫助。通常，因?yàn)楫?dāng)被抗原呈遞細(xì)胞(APCs)提呈時(shí)，T淋巴細(xì)胞一般不識別來源于自身蛋白的T細(xì)胞表位，所以并不提供這種幫助。但是通過在自身蛋白中提供一種“外來性”元素(即通過引入免疫重要的修飾)，當(dāng)識別APC(例如最初為單核細(xì)胞)上的外源表位時(shí)激活了識別外源元素的T細(xì)胞?？勺R別修飾的自身蛋白上的自身表位的多克隆B淋巴細(xì)胞(也是APCs)，也識別(internalise)抗原，并隨后呈遞其外源T細(xì)胞表位，活化的T淋巴細(xì)胞隨后提供細(xì)胞因子來輔助這些自身反應(yīng)的多克隆B淋巴細(xì)胞。因?yàn)橛蛇@些多克隆B淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體與修飾多肽上的不同表位，包括也在天然多肽中存在的那些反應(yīng)，因此誘導(dǎo)了與非修飾的自身蛋白交叉反應(yīng)的抗體?？傊?，可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用，仿佛多克隆B淋巴細(xì)胞群體已識別整個(gè)外源抗原，而實(shí)際上僅插入的表位對宿主來說是外源的。在這種方式下，誘導(dǎo)產(chǎn)生了能夠與非修飾的自身抗原交叉反應(yīng)的抗體。
在本領(lǐng)域中已知幾種方式來修飾肽自身抗原以阻斷自耐受。然而優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的類似物包括-至少引入一個(gè)實(shí)現(xiàn)將修飾分子定位到抗原呈遞細(xì)胞(APC)的第一部分，和/或-至少引入一個(gè)刺激免疫系統(tǒng)的第二部分，和/或-至少引入一個(gè)優(yōu)化類似物呈遞到免疫系統(tǒng)的第三部分。
然而所有這些修飾應(yīng)在維持APP或Aβ中原始B淋巴細(xì)胞表位的實(shí)質(zhì)部分的情況下來完成，因?yàn)榭蓮亩鰪?qiáng)B淋巴細(xì)胞識別自身分子。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，側(cè)鏈基團(tuán)(以外源T細(xì)胞表位或上述的第一、第二和第三部分的形式)通過共價(jià)或非共價(jià)方式引入。也就是說，來源于APP或Aβ的氨基酸殘基一段序列在沒有改變一級氨基酸序列，或至少沒有在鏈中的單獨(dú)氨基酸間的肽鍵中引入改變的情況下進(jìn)行衍生化。
一個(gè)備選的和優(yōu)選的實(shí)施方案利用氨基酸取代和/或刪除和/或插入和/或添加(其可通過重組方式或借助于肽合成來實(shí)現(xiàn)；涉及較長一段序列的氨基酸的修飾可產(chǎn)生融合多肽)。本實(shí)施方案的一個(gè)特別優(yōu)選的形式是如WO 95/05849所述的技術(shù)，它公開了一種通過用自身蛋白類似物進(jìn)行免疫而下調(diào)自身蛋白的方法，所述類似物中許多氨基酸序列已被相應(yīng)的許多每個(gè)包含外源免疫顯性T細(xì)胞表位的氨基酸序列所取代，而同時(shí)在類似物中維持自身蛋白的整個(gè)三級結(jié)構(gòu)。然而對本發(fā)明而言，如果修飾(可以是插入、添加、刪除或取代)可以產(chǎn)生外源T細(xì)胞表位，同時(shí)在APP或Aβ中保存大量的B細(xì)胞表位，這樣就足夠了。但是，為了獲得所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的最大效率，優(yōu)選APP或Aβ的整個(gè)三級結(jié)構(gòu)在修飾的分子中維持不變。
在某些情況下，優(yōu)選APP或Aβ或其片段被突變。特別優(yōu)選的是在Aβ-43的35位的甲硫氨酸已被取代，優(yōu)選用亮氨酸或異亮氨酸取代，或被簡單地刪除的取代變異體。特別優(yōu)選類似物包含一個(gè)單獨(dú)的位于C-末端的甲硫氨酸，或是由于它天然存在于淀粉樣蛋白原性多肽或外源TH表位中、或是由于它已被插入或增加。因此，還優(yōu)選除了在C-末端位置可能有一個(gè)甲硫氨酸以外，包含外源TH表位的類似物部分不含甲硫氨酸。
刪除一個(gè)甲硫氨酸以外的所有甲硫氨酸的主要原因是，可能通過重組來制備多聚類似物，其隨后可被溴化氰切割而得到單個(gè)類似物。其有利之處是在于這樣便于進(jìn)行重組生產(chǎn)。
實(shí)際上，通常優(yōu)選所有根據(jù)本發(fā)明使用的APP或Aβ類似物都具有以下特征，即僅包括一個(gè)單獨(dú)的作為類似物中C-末端氨基酸的甲硫氨酸，而在淀粉樣蛋白原性多肽或外源TH表位中的其它甲硫氨酸均被刪除或用另一種氨基酸取代。
一個(gè)進(jìn)一步感興趣的突變是刪除或取代Aβ-43的19位的苯丙氨酸，特別優(yōu)選該突變是用脯氨酸來取代這個(gè)苯丙氨酸殘基。
其它在類似物中使用的感興趣的多聚氨基酸是Aβ-43蛋白的截短的部分。這些也可在根據(jù)本發(fā)明的免疫原性類似物中使用。特別優(yōu)選地是截短體Aβ(1-42)、Aβ(1-40)、Aβ(1-39)、Aβ(1-35)、Aβ(1-34)、Aβ(1-34)、Aβ(1-28)、Aβ(1-12)、Aβ(1-5)、Aβ(13-28)、Aβ(13-35)、Aβ(17-28)、Aβ(25-35)、Aβ(35-40)、Aβ(36-42)和Aβ(35-42)(其中括號中的數(shù)字表示組成相關(guān)片段的Aβ-43的氨基酸序列-例如，Aβ(35-40)與SEQ ID NO2中706-711位氨基酸相同)。所有這些具有截短部分的Aβ-43的變異體可用此處描述的Aβ片段來制備，特別是用實(shí)施例1中提到的變異體9、10、11、12和13來制備。
下面的公式描述本發(fā)明通常包括的分子構(gòu)建體(MOD1)s1(淀粉樣蛋白e1)n1(MOD2)s2(淀粉樣蛋白e2)n2……(MODx)sx(淀粉樣蛋白ex)nx(I)-其中淀粉樣蛋白e1-淀粉樣蛋白ex是包含APP或Aβ亞序列的xB細(xì)胞表位，它們分別是相同或不同的，并且可以包含或不包含外源側(cè)鏈基團(tuán)，x是≥3的整數(shù)，n1-nx是x個(gè)≥0的整數(shù)(至少有一個(gè)≥1)，MOD1-MODx是x個(gè)在保留的B細(xì)胞表位間引入的修飾，s1-sx是x個(gè)≥0的整數(shù)(如果在淀粉樣蛋白ex序列中沒有引入側(cè)鏈基團(tuán)，則至少有一個(gè)≥1)。因此，考慮到構(gòu)建體在免疫原性上的一般功能限制，本發(fā)明允許APP或Aβ原始序列的所有種類的變換(permutation)及其中所有種類的修飾。因此，本發(fā)明所包括的是通過刪除部分序列，例如在體內(nèi)表現(xiàn)出副作用的部分、或通常為胞內(nèi)部分并因此可產(chǎn)生非所需的免疫反應(yīng)的部分，從而獲得的修飾的APP或Aβ。
當(dāng)應(yīng)用時(shí)，上述闡明的構(gòu)建體的一個(gè)優(yōu)選形式是那些包含淀粉樣蛋白亞序列的B細(xì)胞表位未胞外暴露在衍生該淀粉樣蛋白的前體多肽中。通過選擇這樣的表位，保證不產(chǎn)生與產(chǎn)生前體的細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的抗體，從而使所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答限定在抗非所需的淀粉樣蛋白沉積物。例如，在這種情況下，當(dāng)沒有偶聯(lián)任何產(chǎn)生它們的細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)抗僅暴露在細(xì)胞外相的APP或Aβ表位的免疫反應(yīng)是可行的。
通過幾種方法來維持如此處所述的B細(xì)胞表位的實(shí)質(zhì)部分(substantialfraction)或甚至經(jīng)過修飾的蛋白的全部三級結(jié)構(gòu)。一種方式是簡單地制備直接抗所述多肽的多克隆抗血清(例如在兔中制備的抗血清)，然后用該抗血清作為抗產(chǎn)生的修飾蛋白的檢測試劑(例如，在競爭性ELISA中)。以與APP或Aβ相同的程度與抗血清反應(yīng)的修飾形式(類似物)必須被認(rèn)為具有與APP或Aβ相同的整體三級結(jié)構(gòu)，而對這種抗血清表現(xiàn)出限制性(但仍為主要的和特異的)反應(yīng)的類似物被認(rèn)為已保留了原始B細(xì)胞表位的實(shí)質(zhì)部分。
備選地，可以制備與APP或Aβ上獨(dú)特表位反應(yīng)的選擇的單克隆抗體并用作試驗(yàn)樣板。該方法的優(yōu)勢在于得到1)APP或Aβ的表位圖譜和2)在制備的類似物中保留的表位的圖譜。
當(dāng)然，第三種方法可分解APP或Aβ或其生物活性截短物(參閱上述內(nèi)容)的三維結(jié)構(gòu)，并將該結(jié)構(gòu)與制備的類似物的分解的三維結(jié)構(gòu)相比較。三維結(jié)構(gòu)可通過X射線衍射研究和NMR光譜分析來分解。關(guān)于三維結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步信息可某種程度上獲自圓二色性研究，其優(yōu)勢在于僅需要純的多肽(而X射線衍射需要提供結(jié)晶化的多肽，NMR需要提供多肽的同位素變異體)以提供給定分子的三維結(jié)構(gòu)的有用信息。但是，最終需要X射線衍射和/或NMR來得到結(jié)論性數(shù)據(jù)，因?yàn)閳A二色性僅能夠通過二級結(jié)構(gòu)元件的信息來提供正確三維結(jié)構(gòu)的間接證據(jù)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案利用APP或Aβ的B淋巴細(xì)胞表位的多重呈遞(即，在公式I中至少有一個(gè)B細(xì)胞表位存在于兩個(gè)位置)。該效果可通過各種方法來完成，例如，通過簡單地制備包含結(jié)構(gòu)(APP或Aβ衍生的多肽)m的融合多肽，其中m是≥2的整數(shù)，然后在APP或Aβ序列至少一個(gè)中引入此處討論的修飾。優(yōu)選引入的修飾包括至少一個(gè)拷貝的B淋巴細(xì)胞表位和/或引入一個(gè)半抗原。這些包括所選擇表位的多重呈遞的實(shí)施方案在以下情況是特別優(yōu)選的，即在疫苗試劑中僅APP或Aβ的次要部分用作組分。
如上所述，可通過引入至少一個(gè)氨基酸插入、添加、刪除或取代來完成外源T細(xì)胞表位的引入。當(dāng)然，正常的情況是在氨基酸序列中引入多于一個(gè)變化(例如，用完全T細(xì)胞表位來插入或取代)，但要達(dá)到的重要目標(biāo)是，當(dāng)被抗原呈遞細(xì)胞(APC)加工時(shí)，類似物將產(chǎn)生這種由APC表面上的MHC II類分子所呈遞的外源免疫顯性T細(xì)胞表位。因此，如果APP或Aβ的氨基酸序列在合適的位置包含許多也發(fā)現(xiàn)于外源TH表位中的氨基酸殘基，那么可通過氨基酸插入、添加、刪除和取代來提供外源表位的剩余氨基酸，從而來完成外源TH表位的引入。換句話說，即不必通過插入或取代來引入完整的TH表位以達(dá)到發(fā)明的目標(biāo)。
優(yōu)選氨基酸插入、刪除、取代或添加的數(shù)量至少是2，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和25個(gè)插入、取代、添加或刪除。另外，優(yōu)選插入、取代、添加或刪除的氨基酸數(shù)目不超過150，例如至多100、至多90、至多80和至多70。特別優(yōu)選取代、插入、刪除或添加的數(shù)目不超過60，特別是該數(shù)字不超過50或甚至40。最優(yōu)選地是該數(shù)字不超過30。關(guān)于氨基酸添加，應(yīng)注意的是，當(dāng)所得到的構(gòu)建體是融合多肽形式時(shí)，這些?？紤]高于150個(gè)。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括通過引入至少一個(gè)外源免疫顯性的T細(xì)胞表位而進(jìn)行的修飾。可以理解，T細(xì)胞表位的免疫顯性問題依賴于所述的動物物種。如此處所用，術(shù)語“免疫顯性”僅指在接種的個(gè)體/群體中產(chǎn)生重要免疫應(yīng)答的表位，但眾所周知的事實(shí)是，在一個(gè)個(gè)體/群體中為免疫顯性的T細(xì)胞表位不必在另一個(gè)同種個(gè)體中為免疫顯性，即使它可能能夠在后一個(gè)體中與MHC II類分子結(jié)合。因此，對本發(fā)明而言，免疫顯性的T細(xì)胞表位是在當(dāng)存在抗原時(shí)，可有效提供T細(xì)胞輔助的T細(xì)胞表位。典型地，免疫顯性的T細(xì)胞表位具有內(nèi)在特征，即它們實(shí)質(zhì)上總被提呈與MHC II類子進(jìn)行結(jié)合，而不管其中它們顯現(xiàn)的多肽。
另一個(gè)重要的問題是T細(xì)胞表位的MHC限制性。通常，天然存在的T細(xì)胞表位是MHC限制性的，即，某些組成T細(xì)胞表位的肽僅與MHC II類分子的一個(gè)亞群有效結(jié)合。這反過來具有這樣一個(gè)效應(yīng)，即在大多數(shù)情況下，應(yīng)用一種特定的T細(xì)胞表位將導(dǎo)致疫苗組分僅對群體中的一部分有效，而且取決于該部分的大小，必須在相同分子中包括更多的T細(xì)胞表位，或備選地制備多組分疫苗，其中組分是根據(jù)引入的T細(xì)胞表位的性質(zhì)而互相區(qū)別的APP或Aβ的變異體。
如果所用的T細(xì)胞的MHC限制性是完全未知的(例如在接種動物具有貧乏的確定的MHC組成的情況下)，由特定疫苗組合物所覆蓋的部分可通過以下公式近似計(jì)算 -其中pi是對存在于疫苗組合物中第i個(gè)外源T細(xì)胞表位產(chǎn)生反應(yīng)者在群體中的頻率，n是疫苗組合物中外源T細(xì)胞表位的總數(shù)。因此，在群體中的反應(yīng)頻率分別為0.8、0.7和0.6的包含3個(gè)外源T細(xì)胞表位的疫苗組合物，將給出1-0.2×0.3×0.4＝0.976-即97.6％的群體在統(tǒng)計(jì)意義上產(chǎn)生對疫苗的MHC-II介導(dǎo)的應(yīng)答。
以上公式不能應(yīng)用在已或多或少知道所用多肽精確的MHC限制性圖譜的情況中。如果，例如某種肽僅與HLA-DR等位基因DR1、DR3、DR5和DR7編碼的人MHC-II分子結(jié)合，那么同時(shí)使用該肽和另一種與其余的由HLA-DR等位基因編碼的MHC-II分子結(jié)合的肽將可以對所述群體達(dá)到100％覆蓋。同樣，如果第二種肽僅與DR3和DR5結(jié)合，添加該肽將根本不能增加覆蓋率。如果群體應(yīng)答的計(jì)算純粹基于疫苗中T細(xì)胞表位的MHC限制性，則被特定疫苗組合物所覆蓋的群體的最小部分可通過以下公式來確定 -其中j是編碼與疫苗中任何一種T細(xì)胞表位結(jié)合、并屬于三個(gè)已知HLA位點(diǎn)(DP、DR和DQ)的第j個(gè)的MHC分子的等位基因單元型在群體中頻率的總和；實(shí)際上，首先要確定哪些MHC分子可識別疫苗中的每個(gè)T細(xì)胞表位，其后并以類型(DP，DR和DQ)列出，然后不同的列出的等位基因單元型的單個(gè)頻率以每種類型進(jìn)行加和，從而產(chǎn)生1、2和3。
在公式II中pi值可能超過相應(yīng)的理論值Пiπj=1-Πj=13(1-vj)2---(IV)]]>-其中vj是編碼與疫苗中第i個(gè)T細(xì)胞表位結(jié)合、并屬于三個(gè)已知HLA位點(diǎn)(DP、DR和DQ)的第j個(gè)的MHC分子的等位基因單元型在群體中頻率的總和。這表明在1-Пi群體中，應(yīng)答者的頻率是f殘余的-i＝(pi-Пi)/(1-Пi)。
因此可調(diào)整公式III以得到公式V -其中術(shù)語1-f殘余的-i在陰性情況下設(shè)定為0。應(yīng)該注意的是，公式V需要所有的表位都已經(jīng)對相同組的單元型而被單元型圖譜化。
因此，當(dāng)選擇引入到類似物中的T細(xì)胞表位時(shí)，包括所有可獲得的關(guān)于該表位的以下知識是非常重要的1)應(yīng)答者在群體中對每個(gè)表位的頻率，2)MHC限制性數(shù)據(jù)和3)相關(guān)單元型在群體中的頻率。
存在許多天然存在的“混雜的”T細(xì)胞表位，它們在動物物種或動物群體的大部分個(gè)體中是活性的，這些表位優(yōu)選被引入到疫苗中，從而降低在同一種疫苗中對大量不同類似物的需求。
根據(jù)本發(fā)明，混雜表位可以是天然存在的人T細(xì)胞表位，例如，來自于破傷風(fēng)類毒素(例如P2和P30表位)、白喉類毒素、流感病毒血凝素(hemagluttinin)(HA)和P.falciparum CS抗原的表位。
近年來，已鑒定出大量其他混雜的T細(xì)胞表位。特別是已鑒定了能夠與由不同HLA-DR等位基因編碼的大部分HLA-DR分子進(jìn)行結(jié)合的肽，它們是所有可能引入到依照本發(fā)明使用的類似物中的T細(xì)胞表位。參見以下參考文獻(xiàn)中所討論的表位，它們因此通過參考結(jié)合于此WO98/23635(Frazer IH等，assigned to The University of Queensland)；Southwood S等，1998，J.Immunol.1603363-3373；Sinigaglia F等，1988，Nature 336778-780；Chicz RM等，1993，J.Exp.Med 17827-47；Hammer J等，1993，Cell 74197-203；和Falk K等，1994，Immunogenetics 39230-242。后面的參考文獻(xiàn)也涉及HLA-DQ和HLA-DP配體。因?yàn)樗性谶@五個(gè)參考文獻(xiàn)中所列出的表位都具有相同的基元，所以它們都相應(yīng)的作為用于本發(fā)明的候選的天然表位。
備選地，表位可以是任何人工T細(xì)胞表位，它能夠與大部分MHC II類分子結(jié)合。在WO 95/07707中所述的pan DR表位肽(“PADRE”)和在相關(guān)文獻(xiàn)Alexander J等，1994，Immunity 1751-761中(二個(gè)內(nèi)容均結(jié)合于此作為參考)是根據(jù)本發(fā)明使用的令人感興趣的表位的候選者。應(yīng)該注意的是，在這些文章中公開的最有效的PADRE肽在C-和N-末端具有D-氨基酸，以提高給藥時(shí)的穩(wěn)定性。然而，本發(fā)明主要目的是在于，整合相關(guān)的表位作為類似物的一部分，然后其在APCs的溶酶體分割內(nèi)部被酶降解，以使隨后在MHC-II分子的范圍中呈遞，因此在本發(fā)明使用的表位中整合D-氨基酸不是有利的。
一個(gè)特別優(yōu)選的PADRE肽是具有氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA(SEQ ID NO17)或其免疫原性有效的亞序列。該肽和其它具有相同MHC限制性缺陷的表位是優(yōu)選的T細(xì)胞表位，應(yīng)在發(fā)明方法中使用的類似物中存在。這樣的超混雜表位可供本發(fā)明最簡單的實(shí)施方案所用，其中僅有一個(gè)單獨(dú)的類似物呈遞給接種的動物的免疫系統(tǒng)。
如上所述，APP或Aβ的修飾也可包括引入將修飾的淀粉樣蛋白原性多肽定位于APC或B淋巴細(xì)胞的第一部分。例如，第一部分可以是B淋巴細(xì)胞特異表面抗原或APC特異表面抗原的特異結(jié)合配偶體。許多這樣的特異表面抗原在本領(lǐng)域中是已知的。例如，該部分可以是一種糖，且在B淋巴細(xì)胞或APC上有其受體(例如甘露聚糖或甘露糖)。備選地，第二部分可以是半抗原。而且特異識別APCs或淋巴細(xì)胞上表面分子的抗體片段也可用作第一部分(表面分子可以是，例如，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的FCγ受體，例如FCγRI或，選擇的任何其它特異表面標(biāo)志物，如CD40或CTLA-4)。應(yīng)注意的是，所有這些舉例的導(dǎo)向分子也可用作佐劑的一部分，參見以下所述。
作為將類似物定位于特定細(xì)胞類型以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的一個(gè)選擇或補(bǔ)充，可通過包含上述刺激免疫系統(tǒng)的第二部分來增加免疫系統(tǒng)的應(yīng)答水平。這種第二部分的典型例子是細(xì)胞因子、熱激蛋白或分子伴侶，以及其有效部分。
根據(jù)本發(fā)明使用的合適細(xì)胞因子是那些通常也在疫苗組合物中作為佐劑起作用的細(xì)胞因子，即，例如干擾素γ(IFN-γ)、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；備選地，細(xì)胞因子分子的功能部分足以作為第二部分。關(guān)于應(yīng)用這種細(xì)胞因子作為佐劑物質(zhì)，參見如下討論。
根據(jù)本發(fā)明，用作第二部分的合適的熱激蛋白或分子伴侶可以是HSP70、HSP90、HSC70、GRP94(也已知為gp96，參閱，Wearsch PA等，1998，Biochemistry 375709-19)和CRT(鈣網(wǎng)蛋白)。
備選地，第二部分可以是一種毒素，例如李斯特菌溶胞素(listeriolycin)(LLO)、脂質(zhì)A和熱不穩(wěn)定的腸毒素。而且，許多分支桿菌衍生物，例如MDP(胞壁酰二肽)、CFA(完全弗氏佐劑)和海藻糖二酯TDM及TDE也是令人感興趣的可能選擇。
同樣，引入增強(qiáng)將類似物呈遞到免疫系統(tǒng)的第三部分是本發(fā)明一個(gè)重要實(shí)施方案。本領(lǐng)域已展現(xiàn)該原理的幾個(gè)實(shí)施例。例如，已知可利用布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)蛋白A中的棕櫚酰脂化(lipidation)錨以提供自身輔佐的多肽(參見例如WO 96/40718)-似乎脂化的蛋白形成膠粒樣的結(jié)構(gòu)，具有由多肽的脂化錨部分的核和從該處伸出的分子的其余部分，從而導(dǎo)致抗原決定簇的多重呈遞。因此，該方法和使用不同的脂化錨(例如，肉豆寇基、肉豆寇基、法呢基、香葉基-香葉基基團(tuán)、GPI錨和N-?；视王セ?的相關(guān)方法的應(yīng)用是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，特別是由于在重組產(chǎn)生的蛋白中提供這樣的脂化錨是非常直接的，僅需要使用例如天然存在的信號序列作為類似物的融合配偶體。另一種可能性是使用補(bǔ)體因子C3的C3d片段或C3本身(參見，Dempsey等，1996，Science 271，348-350 and Lou & Kohler，1998，Nature Biotechnology16，458-462)。
本發(fā)明另一個(gè)可選擇的、導(dǎo)致優(yōu)選地呈遞多個(gè)(例如，至少2個(gè))拷貝的APP或Aβ的重要表位區(qū)到免疫系統(tǒng)的實(shí)施方案是將類似物共價(jià)偶聯(lián)到特定分子上，即，上述的變異體d和e。例如，可使用聚合物，如糖例如葡聚糖，參見，例如Lees A等，1994，Vaccine 121160-1166；Lees A等，1990，J Immunol.1453594-3600，而且甘露糖和甘露聚糖是有用的備選物。來自于例如大腸桿菌和其他細(xì)菌的整合膜蛋白也是有用的結(jié)合配偶體。傳統(tǒng)的載體分子，例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素和牛血清白蛋白(BSA)也是優(yōu)選的和有用的結(jié)合配偶體。
將APP或Aβ衍生的物質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)到多羥基聚合物例如糖上的優(yōu)選實(shí)施方案涉及使用至少一個(gè)APP或Aβ衍生的肽和至少一個(gè)外源T輔助細(xì)胞表位，它們是分別偶聯(lián)到多羥基聚合物上(即，外源T輔助細(xì)胞表位和APP或Aβ衍生的氨基酸序列不互相融合，而是連接到隨后作為載體骨架的多羥基聚合物上)。而且，當(dāng)合適的具有APP或Aβ衍生的肽區(qū)域的B細(xì)胞表位通過短肽序列構(gòu)建時(shí)，這樣的實(shí)施方案是最優(yōu)選的-這是因?yàn)樵摲椒ㄊ且环N能在所得的免疫試劑中實(shí)現(xiàn)所選擇的表位的多重呈遞的非常方便的途徑。但是，也可能僅僅將此處已描述的類似物偶聯(lián)到多羥基聚合物骨架上，即，APP或Aβ衍生的物質(zhì)不連接到骨架上而與外源TH表位分開。
特別優(yōu)選地是通過可被肽酶切割的酰胺鍵將外源T輔助細(xì)胞表位和APP或Aβ衍生的(多)肽偶聯(lián)。該策略的效果是APCs能夠吸收結(jié)合物，同時(shí)能夠加工該結(jié)合物，隨后在MHC II類范圍中呈遞外源T細(xì)胞表位。
完成肽偶聯(lián)(感興趣的是APP或Aβ衍生的肽和外源表位)的一個(gè)方法是用tresyl(三氟乙基磺?；?基團(tuán)或其他合適的活化基團(tuán)例如，馬來酰亞胺基(maleimido)、p-Nitrophenyl cloroformate(活化OH基，在肽和多羥基聚合物之間形成肽鍵)和甲苯磺?；?對-甲苯磺酰基)活化合適的多羥基聚合物。例如，如WO 00/05316和US 5,874,469(二者結(jié)合于此作為參考)所述可能制備活化的多糖，并將它們偶聯(lián)到APP或Aβ衍生的肽或多聚氨基酸以及偶聯(lián)到通過傳統(tǒng)的固相或液相肽合成技術(shù)制備的T細(xì)胞表位上。得到的產(chǎn)物包括多羥基聚合物骨架(例如，葡聚糖骨架)，該骨架通過其N末-端或通過其他可利用的氮部分連接來源于APP或Aβ和來源于外源T細(xì)胞表位的多聚氨基酸。如果需要，可能合成已保護(hù)了除N-末端一個(gè)氨基外的所有可用氨基的APP或Aβ肽，隨后將得到的被保護(hù)的肽連接到三氟乙基磺酰基化的葡聚糖部分，最后，對得到的結(jié)合物去保護(hù)。該方法的特定實(shí)施例在下面的實(shí)施例中進(jìn)行描述。
除了使用WO 00/05316和US 5,874,469中教導(dǎo)的水溶性多糖分子，同樣可使用交聯(lián)的多糖分子，從而在多肽和多糖間獲得微粒狀的結(jié)合物-相信這將導(dǎo)致改善將多肽呈遞到免疫系統(tǒng)，因?yàn)檫_(dá)到了兩個(gè)目標(biāo)，即當(dāng)注射該結(jié)合物時(shí)可獲得一種局部的沉積效應(yīng)，以及得到對APCs而言是有吸引力的靶目標(biāo)的粒子。用這樣微粒系統(tǒng)的方法也在實(shí)施例中詳述。
在APP或Aβ中引入修飾的優(yōu)先選擇區(qū)域的注意事項(xiàng)是，a)保留已知和預(yù)測的B細(xì)胞表位，b)保留三級結(jié)構(gòu)，c)避免B細(xì)胞表位在“生產(chǎn)細(xì)胞”等上呈遞，無論如何，如上所述，很容易篩選一組已在不同位置引入T細(xì)胞表位的類似物。
由于本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案是人Aβ的下調(diào)，所以優(yōu)選地上述APP或Aβ多肽是人的APP或Aβ多肽。在該實(shí)施例中，特別優(yōu)選地是，APP或Aβ多肽通過用至少一個(gè)等長或不同長度并包含外源TH表位的氨基酸序列取代SEQ ID NO2中至少一個(gè)氨基酸序列已經(jīng)被修飾。修飾的淀粉樣蛋白原性APP和Aβ的優(yōu)選實(shí)施例以P2和P30表位為例圖示在圖1中。在實(shí)施例中詳細(xì)討論了該構(gòu)建體的基本原理。
更具體地，包含(或全部)引入到SEQ ID NO2中的氨基酸序列的TH可在SEQ ID NO2的任何一個(gè)氨基酸中被引入。也就是說，引入可能是在氨基酸1-770任何一個(gè)之后，但優(yōu)選地是在SEQ ID NO2中的671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713和714位氨基酸的任何一個(gè)之后。可結(jié)合以刪除氨基酸1-671的任何一個(gè)或全部，或氨基酸715-770的任何一個(gè)或全部。另外，當(dāng)應(yīng)用取代技術(shù)時(shí)，與引入相結(jié)合，可以刪除SEQ ID NO2中的氨基酸671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713和714中的任何一個(gè)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是呈遞不包括任何SEQ ID NO2亞序列的類似物，所述亞序列與啟動T細(xì)胞應(yīng)答的MHC II類分子有效結(jié)合。
這種設(shè)計(jì)免疫原以使免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗Aβ免疫應(yīng)答的策略的基本原理如下應(yīng)注意，當(dāng)用配制在足以強(qiáng)烈破壞體內(nèi)對自身蛋白耐受的佐劑中的大量自身蛋白如Aβ進(jìn)行免疫時(shí)，存在一種風(fēng)險(xiǎn)，即在一些接種個(gè)體中免疫應(yīng)答不能簡單地通過終止免疫而被終止。這是因?yàn)樵谶@種個(gè)體中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答最可能是由自身蛋白的天然TH表位所引起的，其副作用是接種的個(gè)體的自身蛋白自身將作為免疫試劑發(fā)揮作用因此已經(jīng)建立了一個(gè)自免疫條件。
優(yōu)選的方法，其包括外源TH表位的應(yīng)用必須是發(fā)明人最了解的，還沒有觀察到這種效應(yīng)，因?yàn)榭棺陨砻庖邞?yīng)答是由外源TH表位誘導(dǎo)的，并且發(fā)明人已反復(fù)證實(shí)由優(yōu)選技術(shù)所引發(fā)的誘導(dǎo)的在終止免疫后實(shí)際上降低。但是，理論上它可能在少數(shù)個(gè)體中發(fā)生，即個(gè)體被免疫，也可由相關(guān)自身蛋白的自源TH表位引發(fā)免疫應(yīng)答-當(dāng)考慮的自體蛋白相對豐富時(shí)，例如Aβ，則這是更相關(guān)的，而其他治療相關(guān)的自體蛋白僅在局部存在或在體內(nèi)數(shù)量很低，以至于不可能發(fā)生“自身免疫效應(yīng)”。因此，避免該效應(yīng)的一個(gè)簡單方式是完全避免在免疫原中用作TH表位(因?yàn)槎逃?個(gè)氨基酸的肽不能用作為TH表位，所以使用更短的片段是一個(gè)簡單可行的方法)的肽序列的包含體。因此，本發(fā)明的該實(shí)施方案也用于確保免疫原不包括作為“自身刺激TH表位”的靶APP或Aβ的肽序列，所述“自身刺激TH表位”包括僅包含在靶蛋白的序列中的保守取代的序列，使其可另外用作TH表位。
呈遞APP或Aβ類似物的免疫系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施例包括應(yīng)用包含至少一個(gè)不與MHC二級分子有效結(jié)合的APP或Aβ衍生肽的模擬肽，及至少一個(gè)外源T輔助細(xì)胞表位。另外，優(yōu)選地，APP或Aβ衍生肽具有B細(xì)胞表位。如果免疫類似物包含一個(gè)或多個(gè)以連續(xù)序列或包含外源T輔助細(xì)胞表位的插入序列所代表的B細(xì)胞表位，則該類似物是十分有利的。
而且，當(dāng)通過短肽序列構(gòu)建攜帶APP或Aβ區(qū)的合適的B細(xì)胞表位，使其決不與MHC II類分子有效結(jié)合時(shí)，這種實(shí)施方案是最優(yōu)選的。因此，選擇的B細(xì)胞表位或淀粉樣蛋白原性多肽的表位應(yīng)包括至多SEQ ID NO2的9個(gè)連續(xù)氨基酸。更短的肽是優(yōu)選的，例如那些具有至多淀粉樣蛋白原性多肽氨基酸序列的8、7、6、5、4或3個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。
優(yōu)選地，類似物包括至少SEQ ID NO2的一個(gè)亞序列，使得每個(gè)這樣的至少一個(gè)亞序列獨(dú)立地由選自9個(gè)連續(xù)氨基酸、8個(gè)連續(xù)氨基酸、7個(gè)連續(xù)氨基酸、6個(gè)連續(xù)氨基酸、5個(gè)連續(xù)氨基酸、4個(gè)連續(xù)氨基酸和3個(gè)連續(xù)氨基酸的APP或Aβ的氨基酸序列組成。
特別優(yōu)選地是，連續(xù)氨基酸在選自SEQ ID NO2的殘基672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713和714的氨基酸殘基開始。
蛋白/肽接種；類似物的配制和給藥當(dāng)通過給藥動物而實(shí)現(xiàn)將類似物呈遞給動物免疫系統(tǒng)時(shí)，多肽的配制遵循本領(lǐng)域中公認(rèn)的原理。
在本領(lǐng)域中，已非常了解包含肽序列作為活性成分的疫苗的制備，如美國專利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792和4,578,770所例證，所有的結(jié)合于此作為參考。典型地，這種疫苗以可注射形式，或者作為液體溶液或混懸液形式而制備；也可以制備適于在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式。也可將制劑乳化?；钚悦庖呓M分通常與藥用的并與活性成分兼容的賦形劑混合。合適的賦形劑是例如，水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇或類似物質(zhì)，及其組合。另外，如果需要，疫苗可包含少量輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑，pH緩沖劑或增強(qiáng)疫苗效力的佐劑；參見，下述佐劑的詳細(xì)討論。
傳統(tǒng)上，疫苗是通過注射腸胃外給藥，例如皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)注射。適于其他給藥方式的另外的制劑包括栓劑，及在某些情況下，口、口含(buccal)、舌下(sublinqual)、腹膜內(nèi)、陰道內(nèi)、肛門、硬膜外、脊柱、顱骨內(nèi)制劑。對于栓劑，傳統(tǒng)結(jié)合劑和載體可包括，例如，聚(亞烷基)二醇(polyalkalene glycols)或甘油三酯；這種栓劑可由包含0.5％-10％，優(yōu)選地1-2％活性成分的混合物形成?？诜苿┌ㄍǔＪ褂玫馁x形劑，例如，藥物級別的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采用溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑或粉末形式，并包含10-95％活性成分，優(yōu)選地為25-70％。對口服制劑，霍亂毒素是令人感興趣的制劑配偶體(也是可能的結(jié)合物配偶體)。
多肽可以中性或鹽形式配制在疫苗中。藥用鹽包括酸式加成鹽(與肽的自由氨基形成)，它用無機(jī)酸，例如鹽酸或磷酸，或有機(jī)酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。用自由羧基形成的鹽也可從無機(jī)堿，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，和有機(jī)堿，例如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等而衍生。
疫苗以與劑量配方一致的方式并以治療有效和具有免疫原性的劑量進(jìn)行給藥。給藥量依賴于待治療的受試者，包括例如，個(gè)體免疫系統(tǒng)引發(fā)免疫應(yīng)答的能力及所需保護(hù)的程度。合適劑量范圍是每次接種幾百微克級的活性成分，優(yōu)選范圍為大約1μg-2,000μg(即使預(yù)期了1-10mg范圍的更高的量)，例如，在大約0.5μg-1,000μg范圍，優(yōu)選是在約1μg-500μg范圍，特別在約10μg-100μg范圍。最初給藥和加強(qiáng)接種的合適療法也是可變的，但典型地是在初次給藥后，隨后進(jìn)行接種或其他給藥。
應(yīng)用方式可以廣泛改變?？蓱?yīng)用任何傳統(tǒng)的給藥疫苗方法。這些包括在固體生理上可接受的基底上或生理上可接受的分散體形式口服施用，腸胃外注射或類似方式。疫苗劑量依賴于給藥途徑，并根據(jù)被接種者年齡和抗原配制而改變。
在疫苗中，一些疫苗的多肽具有足夠免疫原性，而對另一些來說，如果疫苗進(jìn)一步包含佐劑物質(zhì)，則會增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
已知有各種實(shí)現(xiàn)對疫苗的佐劑效果的方法?；驹砗头椒ㄔ凇錞heTheory and Practical Application of Adjuvants″，1995，Duncan E.S.Stewart-Tull(編輯)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6和″VaccinesNew Generationn Immunological Adjuvants″，1995，Gregoriadis G等，(編輯)，Plenum Press，New York，ISBN 0-306-45283-9中進(jìn)行詳細(xì)描述，二者均因此結(jié)合于此作為參考。
特別優(yōu)選的是使用已證明利于破壞對自體抗原的自體耐受的佐劑；實(shí)際上，在自身疫苗中使用非修飾的三萜系化合物多肽作為活性成分時(shí)，這一點(diǎn)是非常必要的。合適佐劑的非限制性實(shí)施例選自免疫導(dǎo)向佐劑；免疫調(diào)節(jié)佐劑，例如毒素、細(xì)胞因子和分支細(xì)菌衍生物；油制劑；聚合物；膠粒形式佐劑；皂苷；免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)(ISCOM基質(zhì))；顆粒；DDA；鋁佐劑；DNA佐劑；γ-菊粉和包封佐劑(encapsulating adjuvant)。通常應(yīng)注意，涉及首先使用的化合物和試劑，類似物中的第二和第三部分的上述內(nèi)容加以必要的變更還涉及它們在本發(fā)明疫苗的佐劑中的應(yīng)用。
佐劑的應(yīng)用包括使用試劑，例如氫氧化鋁或磷酸鋁，通常在緩沖生理鹽水中用量為0.05-0.1％溶液，與糖合成聚合物的混合物(例如，Carbopol)，用量為0.25％溶液，通過用70-101℃溫度分別熱處理30秒-2分鐘的時(shí)間得到的疫苗中蛋白的聚合體，也可能是通過交聯(lián)劑得到的聚合體。也可利用通過用胃蛋白酶處理的抗白蛋白的抗體(Fab片段)再活化得到的聚合體，與細(xì)菌細(xì)胞例如C.parvum或內(nèi)毒素或革蘭氏陰性菌的脂多糖組分的混合物，在生理上可接受的油類賦形劑例如二縮甘露醇單油酸酯(Aracel A)中的乳劑或與用作阻斷替代物(block substitute)的20％全氟化碳(Fluosol-DA)溶液的乳劑。與油例如鯊烯和IFA的混合物也是優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，DDA(二甲基二(十八烷基)溴化銨)與DNA及γ-菊粉一樣，是一種感興趣的佐劑候選物，而且弗氏完全佐劑和不完全佐劑及皂樹皂苷，例如QuilA和QS21與RIBI一樣是令人感興趣的。進(jìn)一步的可能性是單磷酰脂類A(MPL)，上述的C3和C3d及胞壁酰二肽(MDP)。
已知脂質(zhì)體制劑也具有佐劑效果，因此依照本發(fā)明，脂質(zhì)體佐劑是優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)類型(ISCOMO基質(zhì))佐劑也是優(yōu)選的選擇，特別是由于已表明該類型佐劑能夠通過APCs上調(diào)MHC II類分子的表達(dá)。ISCOM基質(zhì)由來源于皂樹皂苷的皂苷(三萜類化合物)、膽固醇和磷脂組成(可選擇性地餾分)。當(dāng)與免疫原性蛋白混合時(shí)，所得到的顆粒制劑即為已知為ISCOM顆粒，其中皂苷占60-70％重量/重量，膽固醇和磷脂為10-15％重量/重量，蛋白為10-15％重量/重量。關(guān)于免疫刺激復(fù)合物的組成及應(yīng)用的詳細(xì)資料可在例如上述關(guān)于佐劑的教材中找到，而且，Morein B等.，1995，Clin.Immunother.3461-475和Barr IG和Mitchell GF，1996，Immunol.and Cell Biol.748-25(二者均結(jié)合于此作為參考)提供了制備完全的免疫刺激復(fù)合物的指導(dǎo)。
另一個(gè)非常令人感興趣(因此是優(yōu)選的)的實(shí)現(xiàn)佐劑效果的可能性是應(yīng)用在Gosselin等，1992(其因此結(jié)合于此作為參考)所描述的技術(shù)。簡單地說，對相關(guān)抗原例如本發(fā)明中的抗原的呈遞，可通過將抗原連接到抗單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上的Fcγ受體的抗體(或抗原結(jié)合的抗體片段)上而增強(qiáng)。特別地是已證明抗原和抗FcγRI的結(jié)合物對接種而言可增強(qiáng)免疫原性。
其他可能性涉及使用上述導(dǎo)向及免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)(尤其細(xì)胞因子)作為淀粉樣蛋白原性多肽的修飾形式中第一和第二部分的候選者。就此而論，合成的細(xì)胞因子誘導(dǎo)物，如多聚IC，也是一種可能性。
合適的分枝桿菌衍生物選自胞壁酰二肽、完全弗氏佐劑、RIBI和海藻糖的二脂例如TDM和TDE。
合適的免疫導(dǎo)向佐劑選自CD40配體和CD40抗體或其特異結(jié)合片段(參見上述討論)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4。
合適的聚合物佐劑選糖例如葡聚糖、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖；塑料聚合物例如；和膠乳例如膠乳珠。
然而另一個(gè)感興趣的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方式是在“有效淋巴結(jié)”(VLN)(由ImmunoTherapy，Inc.，360 Lexington Avenue，New York，NY10017-6501發(fā)明的私人醫(yī)療裝置)中包括免疫原(任選地與佐劑和藥用載體及媒介物一起)。VLN(一種薄的管狀裝置)模擬淋巴結(jié)的結(jié)構(gòu)和功能。在皮下插入VLN可創(chuàng)造一個(gè)細(xì)胞因子和趨化因子高漲的無菌炎癥位點(diǎn)。T細(xì)胞和B細(xì)胞及APCs很快對危險(xiǎn)信號產(chǎn)生應(yīng)答，找到該發(fā)炎位點(diǎn)并在VLN孔狀基質(zhì)內(nèi)容累積。已表明當(dāng)使用VLN時(shí)，引起對抗原的免疫應(yīng)答所需的必需抗原劑量下降，而且用VLN進(jìn)行接種所達(dá)到的免疫保護(hù)超過了用Ribi作為佐劑的傳統(tǒng)免疫所達(dá)到的保護(hù)。該技術(shù)也在尤其Gelber C等，1998，″Elicitation of Robust Cellular and Humoral ImmuneResponses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical DeviceDesignated the Virtual LymphNode″，在″From the Laboratory to theClinic，Book of Abstracts，十月第12-151998，Seascape Resort，Aptos，Calfornia″中進(jìn)行了簡單描述。
已表明在很多情況下疫苗的微粒制劑可增加蛋白抗原的免疫原性，因此這也是本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。以抗原與聚合物、脂類、糖或其它適于制備顆粒的分子的共-制劑制備微粒，或者微?？梢允莾H包含抗原本身的均一顆粒。
基于聚合物的微粒的實(shí)施例是基于PLGA和PVP的顆粒(Gupta，R.K.等，1998)，其中聚合物和抗原縮合成固體顆粒?；谥惖奈⒘？芍苽涑芍惸z粒(也稱為脂質(zhì)體)，在膠粒中包封抗原(Pietrobon，P.J.1995)。基于糖的微粒典型地是由合適的可降解糖例如淀粉或脫乙酰殼多糖來制備。糖和抗原混合，并以與聚合物顆粒類似的制作過程縮合成顆粒(Kas，H.S.等.1997)。
僅包含抗原的顆?？赏ㄟ^各種噴霧和冷凍干燥技術(shù)來制備。特別適于本發(fā)明的目的的是超臨界流體技術(shù)，它可用來制備可控大小的非常均一的顆粒(York，P.1999 & Shekunov，B.等.1999)。
預(yù)期疫苗應(yīng)每年給藥1-6次，例如一年中對有需要個(gè)體進(jìn)行1、2、3、4、5或6次給藥。以前已表明，使用依照本發(fā)明的優(yōu)選的自身疫苗所誘導(dǎo)的記憶性免疫并不是永久性的，因此免疫系統(tǒng)需要用淀粉樣蛋白原性多肽或修飾的淀粉樣蛋白原性多肽進(jìn)行定期刺激。
由于遺傳差異，不同個(gè)體可能對相同多肽產(chǎn)生不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的疫苗可包含幾種不同的多肽以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，參見以上關(guān)于導(dǎo)入外源T細(xì)胞表位導(dǎo)入的選擇。疫苗可包括兩個(gè)或多個(gè)多肽，其中所有這些多肽如上所定義。
因此疫苗可包括3-20個(gè)不同的修飾或非修飾的多肽，例如3-10個(gè)不同的多肽。
核酸接種作為傳統(tǒng)的基于肽的疫苗給藥方式的備選，核酸接種技術(shù)(也稱為“核酸免疫”，“遺傳免疫”和“基因免疫”)提供了大量吸引人的特征。
首先，相對于傳統(tǒng)疫苗方式，核酸接種不需要大規(guī)模生產(chǎn)具有免疫原性的試劑(例如以工廠規(guī)模來發(fā)酵產(chǎn)生修飾的淀粉樣蛋白原性多肽的微生物的方式)的資源消耗。另外，不需要設(shè)備對免疫原進(jìn)行純化和再折疊。最后，因?yàn)楹怂峤臃N依賴于被接種個(gè)體的生化裝備來產(chǎn)生所導(dǎo)入核酸的表達(dá)產(chǎn)物，所以希望發(fā)生表達(dá)產(chǎn)物的最適翻譯后加工過程；這在自身疫苗接種情況中是特別重要的，因?yàn)槿缟纤觯糂細(xì)胞表位的有效部分應(yīng)在修飾分子中得到保留，而且因?yàn)樵砩螧細(xì)胞表位可通過任何(生物)分子(例如糖、脂類、蛋白等)的部分進(jìn)行構(gòu)建。因此，免疫原的天然糖基化和脂化模式對整個(gè)免疫原性非常重要，最好通過具有產(chǎn)生免疫原的宿主來保證這一點(diǎn)。
因此，本發(fā)明變體a-c的優(yōu)選實(shí)施方案包含，將編碼類似物的核酸引入到動物細(xì)胞，從而獲得被導(dǎo)入核酸的細(xì)胞的體內(nèi)表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)將類似物呈遞到免疫系統(tǒng)。
在該實(shí)施方案中，導(dǎo)入的核酸優(yōu)選的是DNA，它的形式可以是，裸露的DNA、與帶電荷或不帶電荷的脂類配制的DNA、配制在脂質(zhì)體中的DNA、包括在病毒載體中的DNA、與利于轉(zhuǎn)染的蛋白或多肽配制的DNA、與導(dǎo)向蛋白或多肽配制的DNA、與鈣沉積試劑配制的DNA、偶聯(lián)惰性載體分子的DNA、包封在聚合物例如PLGA(參見WO 98/31398中描述的技術(shù))或殼多糖或脫乙酰殼多糖中的DNA，和與佐劑配制的DNA。在本文中應(yīng)注意，實(shí)際上所有關(guān)于在傳統(tǒng)疫苗制劑中適于使用的佐劑的考慮都可應(yīng)用于DNA疫苗制劑。因此，此處關(guān)于在基于多肽的疫苗中使用佐劑的所有內(nèi)容加以變更適于在核酸接種技術(shù)中使用。
關(guān)于上面已詳述的基于多肽的疫苗的給藥途徑和給藥方案，它們也可應(yīng)用于本發(fā)明的核酸疫苗中，及以上關(guān)于適于多肽的給藥途徑和給藥方案的所有討論加以變更適用于核酸。對此應(yīng)增加的是，核酸疫苗適于靜脈內(nèi)和動脈內(nèi)給藥。另外，在本領(lǐng)域中眾所周知，核酸疫苗可通過使用所謂基因槍進(jìn)行給藥，因此給藥的這種方式和等價(jià)方式也是本發(fā)明的一部分。最后，已報(bào)道在核酸給藥中應(yīng)用VLN得到良好的結(jié)果，因此這種特別給藥方式是特別優(yōu)選的。
另外，作為免疫試劑的核酸可以包括編碼第一、第二和/或第三部分，例如上述免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)如作為有用佐劑討論的細(xì)胞因子，的區(qū)域。本實(shí)施方案的優(yōu)選方案包括使類似物的編碼區(qū)和免疫調(diào)節(jié)物的編碼區(qū)在不同的閱讀框中或至少在不同啟動子控制下。從而避免類似物或表位作為對于免疫調(diào)節(jié)物的融合配偶體產(chǎn)生。備選地，可使用兩個(gè)不同核苷酸片段，但這并不是優(yōu)選的，因?yàn)樵谕粋€(gè)分子中具有二者的編碼區(qū)有利于保證其進(jìn)行共表達(dá)。
因此，本發(fā)明也涉及一種誘導(dǎo)產(chǎn)生抗APP或Aβ抗體的組合物，該組合物包含-本發(fā)明的核酸片段或載體(參見以下載體的論述)，和-如上討論的藥用和免疫上可接受的媒介物和/或載體和/或佐劑。
在正常情況下，編碼變異體的核酸以載體形式導(dǎo)入，其中在病毒啟動子的控制下進(jìn)行表達(dá)。關(guān)于本發(fā)明載體的更詳細(xì)討論參見以下討論。而且可獲得核酸疫苗制劑和應(yīng)用的詳細(xì)描述，參見，Donnelly JJ等，1997，Annu.Rev.Immunol.15617-648和Donnelly JJ等，1997，LifeSciences 60163-172。這些參考文件均結(jié)合于此作為參考。
活疫苗第三個(gè)將如在變體a-c中所定義的類似物有效呈遞給免疫系統(tǒng)的備選是應(yīng)用活疫苗技術(shù)。在活體接種中，對免疫系統(tǒng)的呈遞通過對動物給藥一種轉(zhuǎn)化了編碼類似物的核酸片段或整合這種核酸片段的載體的非致病性微生物而得以實(shí)現(xiàn)。該非致病性微生物可以是任何合適的減弱的細(xì)菌菌株(通過傳代或通過重組DNA技術(shù)除去致病性表達(dá)產(chǎn)物而被減弱)，例如，牛分支桿菌BCG.、非致病性鏈球菌屬菌種、大腸桿菌、沙門氏菌屬菌種、霍亂弧菌、志賀氏菌屬等。關(guān)于制備活疫苗的技術(shù)發(fā)展水平的綜述可參見，如Saliou P，1995，Rev.Prat.451492-1496和Walker PD，1992，Vaccine 10977-990，二者均結(jié)合于此作為參考。
關(guān)于在這種活疫苗中所用核酸片段和載體的詳細(xì)信息，參見以下討論。
作為細(xì)菌活疫苗的備選，以下討論的本發(fā)明的核酸片段可以整合到無毒的病毒疫苗載體，例如牛痘菌株或任何其他合適的痘病毒中。
通常，非致病性微生物或病毒僅對動物進(jìn)行一次性給藥，但在特定情況下，在一生中可能有必要多于一次給藥該微生物以維持保護(hù)性免疫。甚至預(yù)期以上對多肽接種的詳細(xì)免疫方案也可用于活疫苗或病毒疫苗中。
備選地，活或病毒疫苗接種與之前或之后的多肽和/或核酸接種相結(jié)合。例如，可以用活疫苗或病毒疫苗產(chǎn)生初級免疫，隨后用多肽或核酸方法進(jìn)行增強(qiáng)免疫。
微生物或病毒可以用包含編碼第一、第二和/或第三部分區(qū)域的核酸，例如以上述的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)例如作為有用佐劑的細(xì)胞因子的形式，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本實(shí)施方案的優(yōu)選方案包括使類似物的編碼區(qū)和免疫調(diào)節(jié)物的編碼區(qū)在不同的閱讀框中或至少在不同啟動子控制下。從而避免類似物或表位作為對于免疫調(diào)節(jié)物的融合配偶體而產(chǎn)生。備選地，可使用兩種不同核苷酸片段作為轉(zhuǎn)化試劑。當(dāng)然，可以提供在同一個(gè)閱讀框具有第一和/或第二和/或第三部分作為表達(dá)產(chǎn)物，本發(fā)明的類似物，根據(jù)本發(fā)明，這種實(shí)施方案是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的方法在疾病治療中的應(yīng)用如以上討論所理解，本發(fā)明提供的方法允許控制以淀粉樣蛋白沉積物為特征的疾病。在本文中，AD是本發(fā)明方法的主要靶目標(biāo)，但其他以包含淀粉樣蛋白沉積物的Aβ為特征的疾病也是可行的靶目標(biāo)。因此，本發(fā)明下調(diào)淀粉樣蛋白活性的方法的一個(gè)重要實(shí)施方案包括治療和/或預(yù)防和/或改善AD或其他以淀粉樣蛋白沉積物為特征的疾病，根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法包含將APP或Aβ下調(diào)至淀粉樣蛋白的量顯著下降的程度。
特別優(yōu)選地是淀粉樣蛋白的下降導(dǎo)致淀粉樣蛋白形成和淀粉樣蛋白降解/清除之間的平衡發(fā)生倒置，即，淀粉樣蛋白降解/清除的速度超過淀粉樣蛋白形成的速度。通過仔細(xì)控制對有需要個(gè)體免疫的數(shù)量和免疫效果，有可能得到一種隨著時(shí)間過去的平衡，其導(dǎo)致淀粉樣蛋白沉積物的凈下降而沒有額外的副作用。
備選地，如果在一個(gè)個(gè)體中，本發(fā)明的方法不能清除或降低已存在的淀粉樣蛋白沉積物，本發(fā)明的方法可用于達(dá)到新淀粉樣蛋白形成的臨床上的顯著降低，從而顯著延長疾病癥狀沒有惡化的時(shí)間。應(yīng)通過測定淀粉樣蛋白(認(rèn)為它與沉積的物質(zhì)達(dá)到平衡)的血清濃度，或通過利用正電子發(fā)射斷層掃描(positron-emission tomography)(PET)來掃描，參見Small GW，等，1996，Ann N Y Acad Sci 80270-78，來監(jiān)測淀粉樣蛋白沉積速度。
本手段和方法可用于以類似方式治療或改善的其它疾病和癥狀已在“發(fā)明背景”中進(jìn)行提及，或列于以下以“其他淀粉樣疾病和與之相關(guān)的蛋白”為標(biāo)題的部分。
發(fā)明的肽，多肽和組合物如同從上述內(nèi)容而言是顯然的，本發(fā)明是基于以下概念，即對個(gè)體進(jìn)行抗APP或Aβ抗原免疫，以達(dá)到致病性相關(guān)的淀粉樣蛋白沉積物的數(shù)量降低。達(dá)到這種免疫的優(yōu)選方式是使用此處所述的類似物，從而提供本領(lǐng)域中以前沒有公開的分子。
認(rèn)為，此處討論的類似物自身具有發(fā)明性，因此本發(fā)明的一個(gè)重要部分適于如上所述的類似物。因此，任何此處所闡述的關(guān)于修飾的APP或Aβ的內(nèi)容與本發(fā)明描述的淀粉樣蛋白原性類似物相關(guān)，而且任何這樣的內(nèi)容加以變更適于這些類似物的描述。
應(yīng)注意，優(yōu)選的修飾的APP或Aβ分子包含的修飾應(yīng)使多肽與APP或Aβ或與其至少有10個(gè)氨基酸長度的亞序列具有至少70％的序列同源性。更高的序列同源性是優(yōu)選的，例如，至少為75％或甚至至少為80、85、90或95％。蛋白和核酸的序列同源性可通過(Nref-Ndif)*100/Nref進(jìn)行計(jì)算，其中Ndif是比對時(shí)兩個(gè)序列中的不同殘基的總數(shù)，其中Nref是一個(gè)序列中殘基數(shù)目。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC具有75％序列同源性(Ndif＝2和Nref＝8)。
本發(fā)明也適于用于檢測本發(fā)明方法的組合物。因此，本發(fā)明也涉及一種包含免疫有效量的上述類似物的免疫組合物，所述組合物進(jìn)一步包含藥用和免疫上可接受的稀釋劑和/或媒介物和/或載體和/或賦形劑和任選的佐劑。換句話說，該發(fā)明部分涉及類似物的制劑，本質(zhì)上如上所述。當(dāng)涉及修飾和非修飾的淀粉樣蛋白原性多肽的制劑用于本發(fā)明的方法來下調(diào)APP或Aβ時(shí)，佐劑、載體和媒介物的選擇相應(yīng)地符合上述已經(jīng)討論的。
根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法制備多肽。更長的多肽通常通過重組基因技術(shù)進(jìn)行制備，包括將編碼類似物的核酸序列導(dǎo)入合適的載體，用該載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，通過宿主細(xì)胞表達(dá)該核酸序列，從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清中回收表達(dá)產(chǎn)物，及隨后的純化和任選地進(jìn)一步修飾，例如，再折疊或衍生化。
優(yōu)選地較短的肽通過熟知的固相或液相肽合成技術(shù)來制備。然而，最近該技術(shù)的進(jìn)展以使可能通過這些方法生產(chǎn)全長的多肽和蛋白，因此它也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)以通過合成方法制備長的構(gòu)建體。
本發(fā)明的核酸片段和載體從以上內(nèi)容可以理解，多聚氨基酸類似物可通過重組基因技術(shù)來制備，也可以通過化學(xué)合成或半合成進(jìn)行制備；當(dāng)修飾包括偶聯(lián)到蛋白載體(例如，KLH、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素和BSA)及非蛋白分子如糖聚合物時(shí)，以及當(dāng)修飾包括在APP或Aβ衍生的肽鏈上增加側(cè)鏈或側(cè)鏈基團(tuán)時(shí)，后兩種選擇是特別相關(guān)的。
對于重組基因技術(shù)而言，當(dāng)然也對核酸免疫而言，編碼類似物的核酸片段是非常重要的化學(xué)產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的一個(gè)重要部分適于編碼本發(fā)明的類似物的核酸片段，即，所述類似物是APP或Aβ衍生的多肽，其包含已被添加或插入融合配偶體的天然序列，或者優(yōu)選地APP或Aβ衍生的多肽，其中其已被通過插入和/或增加，優(yōu)選地通過取代和/或刪除，引入了外源T細(xì)胞表位。本發(fā)明的核酸片段是DNA或RNA片段。
本發(fā)明的核酸片段通常被插入到合適載體中形成攜帶本發(fā)明的核酸片段的克隆或表達(dá)載體；這種新型載體也是本發(fā)明的一部分。關(guān)于本發(fā)明的這些載體的構(gòu)建的詳細(xì)描述在以下關(guān)于轉(zhuǎn)化細(xì)胞和微生物中進(jìn)行討論。根據(jù)應(yīng)用的目的和類型，載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微型染色體或病毒形式，而且在特定細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的裸露DNA也是一種重要的載體。優(yōu)選的本發(fā)明的克隆和表達(dá)載體是可以自主復(fù)制的，因此為了高水平表達(dá)或隨后克隆的高水平復(fù)制而可以達(dá)到高拷貝數(shù)。
本發(fā)明載體的一般輪廓以5′→3′方向和可操作連接而言包括以下特征一個(gè)用于啟動本發(fā)明核酸片段表達(dá)的啟動子，任選地編碼使多肽片段分泌(到細(xì)胞外相，或可應(yīng)用的，到周質(zhì)中)或整合到膜中的引導(dǎo)肽的核酸序列，本發(fā)明的核酸片段，和任選地編碼終止子的核酸序列。當(dāng)對生產(chǎn)菌株或細(xì)胞系中的表達(dá)載體進(jìn)行操作時(shí)，為了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性，優(yōu)選當(dāng)導(dǎo)入到宿主細(xì)胞時(shí)，載體整合到宿主細(xì)胞基因組上。相反，當(dāng)用載體在動物中實(shí)現(xiàn)體內(nèi)表達(dá)時(shí)(即，當(dāng)在DNA接種中應(yīng)用載體時(shí))，由于安全原因，優(yōu)選該載體不能整合到宿主細(xì)胞基因組中；典型地，使用裸露DNA或非整合病毒載體，其選擇對熟悉本領(lǐng)域的人來說是熟知的。
本發(fā)明的載體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明的類似物。這種也是本發(fā)明一部分的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以是用于增殖本發(fā)明的核酸片段和載體，或用于重組生產(chǎn)本發(fā)明的類似物的培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系。備選地，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是合適的活疫苗株，其中已被插入了核酸片段(一個(gè)單一的或多個(gè)拷貝)以實(shí)現(xiàn)將類似物分泌或整合到細(xì)菌細(xì)胞膜或細(xì)胞壁中。
本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是微生物，例如，細(xì)菌(例如，埃希氏菌屬菌種[例如大腸桿菌]、芽孢桿菌屬[例如枯草芽孢桿菌]、沙門氏菌屬或分枝桿菌屬[優(yōu)選地非致病性，例如牛分枝桿菌BCG])、酵母(例如釀酒酵母)和原生動物。備選地，轉(zhuǎn)化細(xì)胞來源于多細(xì)胞機(jī)體，例如真菌、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。最優(yōu)選的是來源于人的細(xì)胞，參見以下細(xì)胞系和載體的討論。最近的結(jié)果已表明使用可商業(yè)獲得的Drosophila melanogaster細(xì)胞系(可從Invitrogen獲得的Schneider 2(S2)細(xì)胞系和載體系統(tǒng))在本申請人的實(shí)驗(yàn)室重組生產(chǎn)多肽具有很好的前景，因此，該表達(dá)系統(tǒng)是特別優(yōu)選的。
為了克隆和/或優(yōu)化表達(dá)，優(yōu)選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠復(fù)制本發(fā)明的核酸片段。表達(dá)核酸片段的細(xì)胞是本發(fā)明優(yōu)選的有用實(shí)施方案；它們可用于小規(guī)?；虼笠?guī)模制備本發(fā)明的類似物，或在非致病性細(xì)菌情況下，作為活疫苗的疫苗組分。
當(dāng)通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的類似物時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物輸送到培養(yǎng)基中或展現(xiàn)在轉(zhuǎn)化細(xì)胞表面是非常方便的，但遠(yuǎn)非是必須的。
當(dāng)已鑒定出一個(gè)有效的生產(chǎn)細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選地是以此為基礎(chǔ)，建立一個(gè)攜帶本發(fā)明的載體，并表達(dá)編碼修飾的淀粉樣蛋白原性多肽的核酸片段的穩(wěn)定細(xì)胞系。優(yōu)選地，該穩(wěn)定的細(xì)胞系分泌或攜帶本發(fā)明的類似物，從而利于其純化。
一般來說，來源于與宿主細(xì)胞兼容的物種并包含復(fù)制子和調(diào)控序列的質(zhì)粒載體與宿主聯(lián)合使用。這種載體通常帶有復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型篩選的標(biāo)記序列。例如，大腸桿菌典型地用pBR322，一種來源于大腸桿菌種(參見，例如Bolivar等，1977)的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。pBR322質(zhì)粒包含氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，從而提供容易的方式來鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。pBR質(zhì)粒或其他微生物質(zhì)?；蚴删w也必須包括，或被修飾而包括可用于原核微生物表達(dá)的啟動子。
那些最常用于重組DNA構(gòu)建的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等，1978；Itakura等，1977；Goeddel等，1979)和色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，1979；EP-A-0 036 776)。雖然這些啟動子是最常用的，但其他微生物啟動子已被發(fā)現(xiàn)和使用，關(guān)于其核苷酸序列的詳細(xì)信息已進(jìn)行報(bào)道，從而使熟練技術(shù)人員將它們有功能地連接到質(zhì)粒載體上(Siebwenlist等，1980)。來源于原核生物的某些基因可在大腸桿菌中從其自身啟動子序列進(jìn)行有效表達(dá)，從而排除通過人工方式增加另一個(gè)啟動子的需要。
除了原核生物，也可以應(yīng)用真核微生物，例如酵母培養(yǎng)物，此處啟動子應(yīng)該能夠啟動表達(dá)。雖然通常可獲得大量其他菌株，但釀酒酵母或普通的用包酵母是真核微生物中最常用的。例如，在釀酒酵母表達(dá)中，質(zhì)粒YRp7是常用的(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。該質(zhì)粒已經(jīng)包含trp1基因，它為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變株，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977)，提供一個(gè)選擇標(biāo)記。通過在缺乏色氨酸條件下生長，作為酵母宿主基因組的一個(gè)特征的trp1損傷隨后提供一個(gè)檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。
酵母載體中合適的啟動序列包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其他糖酵解酶類(Hess等，1968；Holland等，1978)，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動子。在構(gòu)建合適的表達(dá)質(zhì)粒過程中，與這些基因相關(guān)的終止序列也連接到表達(dá)載體中所需表達(dá)序列的3′端以提供mRNA的聚腺苷酸化和終止作用。
其他具有生長條件調(diào)控的轉(zhuǎn)錄的附加優(yōu)勢的啟動子是，乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、和上述甘油醛-3-磷酸脫氫酶、以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)域。任何包括酵母兼容的啟動子、復(fù)制起始點(diǎn)和終止序列的質(zhì)粒載體是適用的。
除了微生物，來源于多細(xì)胞機(jī)體的細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。原則上，不論來自脊椎動物或無脊椎動物培養(yǎng)物，任何這種細(xì)胞培養(yǎng)物是可用的。但是，對脊椎動物細(xì)胞的興趣最大，而且近年來以培養(yǎng)物的形式(組織培養(yǎng)物)脊椎動物的增殖已成為常規(guī)操作程序(Tissue Culture，1973)。這種有用宿主細(xì)胞系的例子是VERO和Hela細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系和W138，BHK，COS-7293，草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(SF)細(xì)胞(作為完整表達(dá)系統(tǒng)而商品化獲自，加以變更(i.a.)Protein Sciences，1000 Research Parkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.和獲自Invitrogen)，以及MDCK細(xì)胞系。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的細(xì)胞系是從Invitrogen，PO Box 2312，9704 CH Groningen，The Netherlands獲得的S2。
這種細(xì)胞的表達(dá)載體通常包括(如果必須)復(fù)制起始位點(diǎn)、位于待表達(dá)基因前面的啟動子、以及任何必須的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。
對于在哺乳動物細(xì)胞中使用，表達(dá)載體上的調(diào)控功能通常由病毒物質(zhì)提供。例如，通常所用的啟動子來源于多瘤病毒、腺病毒2、更經(jīng)常為猿猴病毒40(SV40)。由于SV40病毒的早期和晚期啟動子很容易作為也包括SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的片段從病毒中獲得，因此二者是特別有用的(Fiers等，1978)。只要包括從Hind III位點(diǎn)開始向位于病毒復(fù)制起點(diǎn)的Bgl I位點(diǎn)延伸大約250bp的序列，也可使用更小或更大的SV40片段。另外，也可能，而且通常是想要的，利用與所需基因序列正常相關(guān)的啟動子或調(diào)控序列來提供與宿主細(xì)胞系統(tǒng)兼容的調(diào)控序列。
復(fù)制起點(diǎn)可通過載體構(gòu)建來提供以包括外源起點(diǎn)，例如可來源于SV40或其他病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BSV)，或者通過宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制來提供。如果載體整合到宿主細(xì)胞染色體中，后者通常是足夠的。
有用類似物的鑒定對熟練技術(shù)人員來說，很清楚地知道并不是天然存在的APP或Aβ的所有可能的變異或修飾均能夠在動物中引起與天然形式交叉反應(yīng)的抗體。但是，建立一個(gè)對達(dá)到此處所述的免疫反應(yīng)性的最低要求的修飾的淀粉樣蛋白原性分子進(jìn)行有效標(biāo)準(zhǔn)篩選并不困難。因此，可能利用一種方法來鑒定能夠在動物物種中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗非修飾的淀粉樣蛋白原性多肽的抗體的修飾的淀粉樣蛋白原性多肽，其中非修飾的淀粉樣蛋白原性多肽是(無免疫原性的)自身蛋白，該方法包含-通過肽合成或遺傳工程技術(shù)制備一組本發(fā)明的互不相同的類似物，其中氨基酸已被增加到、插入到、刪除自或取代到動物物種的APP或Aβ的氨基酸序列中，從而產(chǎn)生一組包含對動物物種而言是外源的T細(xì)胞表位的氨基酸序列，或制備一組編碼一組互不相同的類似物的核酸片段，-檢測該組類似物或核酸片段的成員通過動物物種誘導(dǎo)產(chǎn)生抗非修飾的APP或Aβ抗體的能力，和-鑒定和任選分離在物種中顯著誘導(dǎo)抗非修飾的APP或Aβ抗體產(chǎn)生的該組類似物的成員，或者鑒定和任選分離由該組核酸片段的成員編碼的，在動物物種中顯著誘導(dǎo)抗非修飾的APP或Aβ抗體產(chǎn)生的多肽表達(dá)產(chǎn)物。
在該文中，“互不相同的修飾的淀粉樣蛋白原性多肽組”是不相同的類似物的集合，例如，它可以根據(jù)上述討論的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇(例如，結(jié)合圓二色性、NMR光譜學(xué)和/或X-射線衍射圖譜分析的研究)。該組僅由少數(shù)成員組成，但可以預(yù)料該組可能包括幾百個(gè)成員。
對組中成員的檢測最終在體內(nèi)進(jìn)行，但可使用許多縮小適于本發(fā)明目的的修飾分子數(shù)量的體外試驗(yàn)。
由于引入外源T細(xì)胞表位的目的是通過T細(xì)胞的輔助來支持B細(xì)胞應(yīng)答，因此先決條件是由類似物誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的體外增殖檢測來檢測T細(xì)胞增殖。簡而言之，從受試者中獲得富含T細(xì)胞的樣本并隨后保持培養(yǎng)。將培養(yǎng)的T細(xì)胞與受試者的APCs接觸，該APCs預(yù)先吸收了修飾的分子，并進(jìn)行處理以呈遞其T細(xì)胞表位。監(jiān)測T細(xì)胞的增殖，并與合適的對照(例如，培養(yǎng)基中的T細(xì)胞與具有處理的完整天然淀粉樣蛋白原性多肽的APCs接觸)進(jìn)行比較。備選地，可通過測定T細(xì)胞應(yīng)答它們的外源T細(xì)胞的識別而釋放的相關(guān)細(xì)胞因子的濃度來測定增殖。
已經(jīng)賦予了高度的可能性，即每種類型組的至少一個(gè)類似物能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗APP或Aβ的抗體，可能制備一種免疫組合物，其包含至少一種能夠在動物物種中誘導(dǎo)抗非修飾的APP或Aβ的抗體的類似物，其中非修飾的APP或Aβ是自身蛋白，該方法包含將組中在動物物種中顯著誘導(dǎo)與APP或Aβ反應(yīng)的抗體產(chǎn)生的成員與藥用和免疫上可接受的載體和/或媒介物和/或稀釋劑和/或賦形劑混合，任選地結(jié)合以至少一種藥用和免疫上可接受的佐劑。
上述多肽組的檢測通過以下方法可簡便地完成，首先制備大量本發(fā)明的互不相同的核酸序列或載體，將這些插入到合適的表達(dá)載體中，用載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞(或宿主動物)，及實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的核酸序列的表達(dá)。在這些步驟之后進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的分離。優(yōu)選地，核酸序列和/或載體用包含實(shí)行分子擴(kuò)增技術(shù)，例如PCR或通過核酸合成的方法進(jìn)行制備。
特異的淀粉樣蛋白原性靶目標(biāo)除了最常與阿爾茲海默氏病相關(guān)的蛋白，APP、ApoE4和Tau外，其他通過直接存在于AD腦的病斑或纏結(jié)中或通過與發(fā)展AD的危險(xiǎn)增加有明顯遺傳關(guān)系，而以某種方式與AD相關(guān)的蛋白有很長的名單。這些抗原的大部分，如果不是所有，與上述Aβ、APP、早老素和ApoE4一起是本發(fā)明的特定實(shí)施方案中假定的靶蛋白。這些假定的靶蛋白已經(jīng)在WO01/62284中詳細(xì)討論。因此，這些假定的靶目標(biāo)在此處僅簡要提及，而更詳細(xì)的背景討論可在WO 01/62282中找到，該文結(jié)合于此作為參考α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)；α2-巨球蛋白；ABAD(結(jié)合Aβ肽的醇脫氫酶)；APLP1和-2(淀粉樣蛋白前體樣蛋白1和-2)；AMY117；Bax；Bc1-2；博來霉素水解酶；BRI/ABRI；嗜鉻粒蛋白A；Clusterin/ApoJ；CRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)結(jié)合蛋白；EDTF(內(nèi)皮衍生的毒素因子)；類肝素硫酸蛋白聚糖；人腦衰蛋白應(yīng)答介導(dǎo)蛋白-2；Huntingtin(亨廷頓舞蹈病蛋白質(zhì))；ICAM-I；IL-6；溶酶體相關(guān)抗原CD68；P21 ras；PLC-δ1(磷脂酶C同工酶δ1)；血清淀粉樣P成分(SAP)；突觸泡蛋白；Synuclein(α-synuclein或NACP)；和TGF-b1(轉(zhuǎn)化生長因子b1)。
此前所述的用于下調(diào)APP或Aβ的方式和方法可與治療例如，活性特異性免疫治療結(jié)合對抗任何這些其他淀粉樣蛋白原性多肽，。
除了阿爾茲海默氏病，腦部淀粉樣蛋白血管病也是一種當(dāng)前公開的技術(shù)的合適靶目標(biāo)的疾病。
應(yīng)考慮到多數(shù)抗APP或Aβ的免疫方法限制為產(chǎn)生對天然APP或Aβ交叉反應(yīng)的抗體的免疫。然而，在某些情況下，誘導(dǎo)CTL應(yīng)答形式的細(xì)胞免疫來抗提呈來自淀粉樣蛋白原性多肽的MHC I類表位的細(xì)胞，是令人感興趣的——這在以下情況是有利的，即產(chǎn)APP或Aβ的細(xì)胞數(shù)量的降低并不造成嚴(yán)重的副作用。在需要CTL應(yīng)答情況下，優(yōu)選利用申請人WO00/20027中的教導(dǎo)。這兩個(gè)文獻(xiàn)的內(nèi)容因此結(jié)合于此作為參考。
免疫原載體如上所述，可以獲得包含T輔助細(xì)胞表位和代表或包括B細(xì)胞表位的APP或Aβ肽、共價(jià)連接到作為媒介物的無免疫原性的聚合物上，例如多價(jià)的活化的多羥基聚合物上、將作為僅包含免疫相關(guān)部分的疫苗分子發(fā)揮作用的分子，而且是上述公開的變體d和e中感興趣的實(shí)施方案。例如，如果疫苗的靶目標(biāo)是自身抗原，例如APP或Aβ，可使用混雜的或所謂通用的T輔助細(xì)胞表位。另外，增強(qiáng)免疫應(yīng)答的成分也可以共偶聯(lián)到媒介物上，從而作為佐劑。這些成分可以是甘露糖，吞噬作用激素、胞壁酰二肽、CpG基序等。在這種情況下，不必進(jìn)行隨后的疫苗產(chǎn)物的佐劑配制，產(chǎn)物可以以純水或鹽水的形式給藥。
通過與T輔助細(xì)胞表位一起偶聯(lián)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位，也可能產(chǎn)生特異于產(chǎn)生CTL表位的抗原的CTL。APC例如巨噬細(xì)胞的促進(jìn)產(chǎn)物吸收到細(xì)胞溶膠中的物質(zhì)，例如甘露糖，也可與CTL和T輔助細(xì)胞表位一起共偶聯(lián)到媒介物上，并增強(qiáng)CTL應(yīng)答。
B細(xì)胞表位和T輔助細(xì)胞表位(P2和P30)在終產(chǎn)物中的比例根據(jù)合成步驟中這些肽濃度的改變而改變。如上所述，免疫原性分子可以在合成步驟中通過在碳酸鹽緩沖液中添加如下物質(zhì)，例如甘露糖、吞噬作用激素、CpG基序或其他免疫刺激物質(zhì)(此處所述)而被標(biāo)記，如果必要，使用這些物質(zhì)的胺化了的衍生物進(jìn)行標(biāo)記。
如上所述，如果用不溶的活化的多羥基聚合物與包含APP或AβB細(xì)胞表位和T輔助細(xì)胞表位的肽進(jìn)行連接，則可通過固相合成來進(jìn)行，收獲終產(chǎn)物并通過洗滌和過濾純化。與三氟乙基磺?；罨亩嗔u基聚合物偶聯(lián)的成分(肽，標(biāo)記物等)可在低pH下，例如pH4-5，加入到多羥基聚合物中，從而通過被動擴(kuò)散在“凝膠”中進(jìn)行均勻發(fā)布。隨后，升高pH到pH 9-10，啟動肽和標(biāo)記物上伯氨基團(tuán)與多羥基聚合物上的三氟乙基磺?；鶊F(tuán)反應(yīng)。當(dāng)肽和如免疫刺激物質(zhì)偶聯(lián)后，將凝膠磨碎，形成大小適于免疫的顆粒。
因此這種免疫原包含a)至少一個(gè)來源于APP或Aβ的第一氨基酸序列，其中至少一個(gè)第一氨基酸序列包含至少一個(gè)B細(xì)胞和/或至少一個(gè)CTL表位，和b)至少一個(gè)包含外源T輔助細(xì)胞表位的第二氨基酸序列，其中至少第一和至少第二氨基酸序列的每一個(gè)均偶聯(lián)到藥用活化的多羥基聚合物載體上。
為了將氨基酸序列偶聯(lián)到多羥基聚合物上，通常需要使用合適的能與氨基酸序列形成必要連接的反應(yīng)基團(tuán)“活化”多羥基聚合物。
術(shù)語“多羥基聚合物”意圖具有與WO 00/05316相同的含義，即，多羥基聚合物確實(shí)具有該申請中詳細(xì)教導(dǎo)的相同特征。因此，多羥基聚合物可以是水溶性的或水不溶性的(從而在制備免疫原時(shí)需要不同合成步驟)。多羥基聚合物可選自天然存在的多羥基化合物和合成的多羥基化合物。
特定的和優(yōu)選的多羥基聚合物是多糖，選自acetan、支鏈淀粉、樹膠瓊脂-瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、阿拉伯樹膠、角叉藻聚糖(carregeenan)、纖維素、環(huán)糊精、葡聚糖、丹麥瓊脂、半乳甘露聚糖、明膠、ghatti、葡聚糖、糖元、瓜耳膠、刺梧桐、konjac/A、刺槐豆膠、甘露聚糖、果膠、車前草、出芽短梗霉聚糖、淀粉、tamarine、黃蓍膠、黃原膠、木聚糖、和木葡聚糖，葡聚糖是特別優(yōu)選的。
然而，多羥基聚合物也可以選自高度分支的聚乙烯亞胺(PEI)、tetrathienylene vinylene、纖維B(poly-paraphenyl terephtalamide的長鏈)、聚氨基甲酸乙酯、聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(2-羥基甲基丙烯酸乙酯)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙烯基醇、聚丙烯酸、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酰胺、聚乙烯-共-乙烯基乙酸酯、聚乙二醇和衍生物、聚甲基丙烯酸、聚交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(乙交酯-共-交酯)(PLGA)、聚酐和聚原酸酯。
所述多羥基聚合物的(重)均分子量(即活化前)典型地是至少1,000，例如至少2,000，優(yōu)選地在2,500-2,000,000的范圍，更優(yōu)選地在3,000-1,000，000的范圍，特別是在5,000-500,000范圍。已在實(shí)施例中表明平均分子量在10,000-200,000范圍的多羥基聚合物是特別有利的。
優(yōu)選地，多羥基聚合物水溶性程度在室溫下至少為10mg/ml，優(yōu)選地至少為25mg/ml，例如至少為50mg/ml，特別是至少為100mg/ml，例如至少為150mg/ml。已知葡聚糖甚至如此處活化后，仍可以達(dá)到水溶性的要求。
對一些最感興趣的多羥基聚合物，未活化的多羥基聚合物(即，活化前的天然多羥基聚合物)中C(碳原子)和OH基團(tuán)(羥基)之間的比例在1.3-2.5的范圍，例如1.5-2.3，優(yōu)選地為1.6-2.1，特別是在1.85-2.05的范圍。不受任何特定理論所限制，認(rèn)為未活化的多羥基聚合物的這種C/OH比例代表親水性高度有利的水平。聚乙烯醇和多糖是達(dá)到該要求的多羥基聚合物的實(shí)例。認(rèn)為上述比例對活化的多羥基聚合物來說大約是一樣的，因?yàn)榛罨壤龖?yīng)該是相當(dāng)?shù)偷摹?br> 術(shù)語“多羥基聚合物載體”意圖指攜帶氨基酸序列的免疫原部分。作為一般規(guī)律，多羥基聚合物載體具有其外部限制，其中的氨基酸序列可被肽酶，例如加工免疫原的抗原呈遞細(xì)胞中的肽酶切割。因此，多羥基聚合物載體可以是具有活化基團(tuán)的多羥基聚合物，其中活化基團(tuán)和氨基酸序列之間的鍵可被APC中的肽酶切割，或者多羥基聚合物載體可以是具有活化基團(tuán)和例如連接物，如單個(gè)L-氨基酸或多個(gè)D-氨基酸的多羥基聚合物，其中連接物的最后部分可與氨基酸序列連接，并被APC中的肽酶切割。
如上所述，多羥基聚合物具有官能團(tuán)(活化基團(tuán))，它促進(jìn)將肽錨定到載體上。本領(lǐng)域中已知許多可應(yīng)用的官能團(tuán)，例如，tresyl(三氟乙基磺?；?、馬來酰亞胺基、p-nitrophenyl cloroformate、溴化氰、甲苯磺酰基(對-甲苯磺?；?、triflyl(三氟甲磺酰基)、五氟苯磺酰基和乙烯基砜基團(tuán)。本發(fā)明中官能團(tuán)的優(yōu)選實(shí)施例是三氟乙基磺酰基、馬來酰亞胺基、甲苯磺酰基、三氟甲磺?；⑽宸交酋；-nitrophenyl cloroformate和乙烯基砜基團(tuán)，在它們中三氟乙基磺?；ⅠR來酰亞胺基和甲苯磺?；翘貏e相關(guān)的。
如WO 00/05316實(shí)施例1中活化葡聚糖所述或如Gregorius等，J.Immunol.Meth.181(1995)65-73所述，三氟乙基磺?；罨亩嗔u基聚合物可用三氟乙基磺酰基氯化物來制備。
馬來酰亞胺活化的多羥基聚合物可用對-馬來酰亞胺基苯基異氰酸酯如WO 00/05316實(shí)施例3中所述活化葡聚糖進(jìn)行制備。備選地，通過用二胺化合物(通常為H2N-CnH2n-NH2，其中n為1-20，優(yōu)選地為1-8)，例如1，3-二氨基丙烷，過量地衍生三氟乙基磺?；罨亩嗔u基聚合物(例如三氟乙基磺?；罨钠暇厶?TAD))，可以將馬來酰亞胺基團(tuán)引入到多羥基聚合物例如葡聚糖中，隨后用試劑，例如琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基-琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、磺基-琥珀酰亞胺基4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、磺酸基-琥珀酰亞胺基4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)、N-γ-馬來酰亞胺基丁酰氧基-琥珀酰亞胺酯(GMBS)或N-γ-馬來酰亞胺基丁酰氧基-磺基琥珀酰亞胺酯與引入到TAD中的氨基進(jìn)行反應(yīng)。雖然活化的不同試劑和途徑會導(dǎo)致馬來酰亞胺活化產(chǎn)物的馬來酰亞胺功能性和活化所進(jìn)行的母體羥基基團(tuán)的剩余物之間的連接略有不同，但全部都看作“馬來酰亞胺活化的多羥基聚合物”。
甲苯磺?；罨亩嗔u基聚合物可如WO 00/05316實(shí)施例2中活化葡聚糖所述用甲苯磺?；然镏苽?。三氟甲磺?；臀宸交酋；罨亩嗔u基聚合物如甲苯磺?；蛉一酋；罨念愃莆镏苽洌?，使用相應(yīng)的酸式氯化物。
溴化氰活化的多羥基聚合物可通過利用常規(guī)方法使多羥基聚合物與溴化氰反應(yīng)而制備。得到的官能團(tuán)通常是具有兩個(gè)多羥基聚合物的羥基的氰酸酯。
活化程度可表示為自由羥基和活化基團(tuán)(即，官能化的羥基)之間的比例。認(rèn)為多羥基聚合物的自由羥基和活化基團(tuán)間的比例應(yīng)在250∶1和4∶1之間，以在多羥基聚合物的親水性和反應(yīng)性之間達(dá)到有利平衡。優(yōu)選地比例是在100∶1和6∶1之間，更優(yōu)選地是在60∶1和8∶1之間，特別是在40∶1和10∶1之間。
根據(jù)本發(fā)明，用于產(chǎn)生通常應(yīng)用的免疫原的方法中的特別感興趣的活化多羥基聚合物是三氟乙基磺酰基、甲苯磺?；婉R來酰亞胺基活化的多糖，特別是三氟乙基磺酰基活化的葡聚糖(TAD)、甲苯磺?；罨钠暇厶?TosAD)和馬來酰亞胺基活化的葡聚糖(MAD)。
優(yōu)選地，多羥基聚合物載體和所連接的氨基酸序列之間的鍵可被肽酶切割，例如，在APC中在加工抗原過程中具有活性的肽酶。因此優(yōu)選地，至少第一和至少第二氨基酸序列通過酰胺鍵或肽鍵偶聯(lián)到活化的多羥基聚合物上。特別優(yōu)選地是至少第一和至少第二個(gè)氨基酸序列每個(gè)都供給它們的各自酰胺鍵的氮部分。
多羥基聚合物載體可以充分?jǐn)[脫氨基酸殘基，迫使活化基團(tuán)提供肽酶切割鍵部分，但如上所述，載體也可以僅包括一個(gè)間隔區(qū)，所述間隔區(qū)包括至少一個(gè)L-氨基酸。然而，至少第一和至少第二氨基酸序列通常通過氨基酸序列的N-末端的氮連接到多羥基聚合物的活性形式上。
上述本發(fā)明通常應(yīng)用的免疫原可在基本上如此處描述的多肽疫苗的免疫方法中使用。也就是說，此處討論的所有涉及劑量、給藥方式和用于下調(diào)淀粉樣蛋白原性多肽的多肽疫苗制劑的描述加以變更適于通常使用的免疫原。
常規(guī)應(yīng)用的安全接種技術(shù)如上所述，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是使用不能提供自源的可引起抗淀粉樣蛋白原性多肽的免疫應(yīng)答的TH表位的淀粉樣蛋白原性多肽的變異體。
然而，本發(fā)明人認(rèn)為設(shè)計(jì)抗自身疫苗和有效抗自身免疫的策略是一般可用的技術(shù)，其本身具有發(fā)明性。應(yīng)證明特別適于以下情況，即它試圖下調(diào)的自身抗原在體內(nèi)是足夠多的，以至于可能產(chǎn)生免疫應(yīng)答的自身刺激。因此，所有以上本實(shí)施方案范圍的內(nèi)容涉及的提供抗APP或Aβ的抗自身免疫應(yīng)答加以變更可適用于抗其它自身多肽的免疫，特別是那些存在足夠數(shù)量以維持非控制的自動免疫疾病形式的免疫應(yīng)答，由于相關(guān)自身多肽的TH表位引發(fā)免疫應(yīng)答。
實(shí)施例1抗AD免疫的自動接種方法Aβ蛋白敲除小鼠沒有表現(xiàn)出任何異?；虿焕母弊饔玫氖聦?shí)表明，Aβ的清除或數(shù)量的降低是安全的，Zheng H.(1996)。
已發(fā)表的關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行抗轉(zhuǎn)基因人Aβ蛋白的免疫實(shí)驗(yàn)提示，如果可能破壞自身耐受，則可能通過自動反應(yīng)的抗體實(shí)現(xiàn)Aβ的下調(diào)。這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步提示，這種Aβ的下調(diào)潛在地將同時(shí)阻斷病斑的形成，和甚至從腦中清除已形成的Aβ病斑，參見Schenk等(1999)。但傳統(tǒng)上，不可能增加抗自身蛋白的抗體。
因此已發(fā)表的數(shù)據(jù)不能提供阻斷針對真正的自身蛋白的自身耐受的方法。這些數(shù)據(jù)也不能提供關(guān)于如何確保免疫反應(yīng)僅直接或主要針對Aβ沉積物，而不針對細(xì)胞膜結(jié)合的Aβ前體蛋白(APP)，如果這一點(diǎn)看來是必要的話。用現(xiàn)有技術(shù)所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答假定可能以一種非控方式產(chǎn)生針對自身蛋白的免疫應(yīng)答，從而可以產(chǎn)生針對Aβ蛋白部分的不必要的和額外的自動反應(yīng)。因此，使用現(xiàn)有免疫策略最大可能是不能產(chǎn)生針對自身蛋白的強(qiáng)免疫應(yīng)答，另外，由于對CNS中大量細(xì)胞上存在的膜結(jié)合的APP潛在的強(qiáng)交叉反應(yīng)，所以也是不安全的。
本發(fā)明提供針對真正的自身蛋白有效產(chǎn)生強(qiáng)的調(diào)控的免疫應(yīng)答的方法，所述自身蛋白潛在地可能形成病斑并在CNS或機(jī)體其他區(qū)域造成嚴(yán)重疾病。通過該技術(shù)開發(fā)出一種安全而有效的人Aβ蛋白治療疫苗，用于治療AD。
據(jù)此，可能預(yù)料AD，一種預(yù)計(jì)在下個(gè)世紀(jì)將消弱健康護(hù)理系統(tǒng)的疾病，可以被治愈，或這種所述的疫苗至少能夠建立一個(gè)治療該病癥狀和發(fā)展的有效治療方法。該技術(shù)闡述一個(gè)完全新穎的阻斷AD和其他神經(jīng)疾病中淀粉樣蛋白沉積的免疫方法。
在下表中，顯示了35個(gè)預(yù)期的構(gòu)建體。所有表中給出的位置是相對于APP的起始甲硫氨酸(SEQ ID NO2中第一個(gè)氨基酸)，并包括起始和終止氨基酸，例如672-714片段包括氨基酸672和714。P2和P30的起始和終止位置表示在所示位置表位取代APP片段一部分(兩個(gè)位置均包括在取代中)-在大多數(shù)構(gòu)建體中，引入的表位取代表位長度的片段。表中的星號有以下含義*)僅有一個(gè)P2和P30位置表明表位已在所示位置插入到APP衍生物中(表位在臨近給定位置的氨基酸的C末端開始)。
**)構(gòu)建體34包含三個(gè)分別被P30和P2隔開的相同的APP片段。
***)構(gòu)建體35包含九個(gè)被交替的P30和P2表位隔開的相同的APP片段。
APP自身疫苗構(gòu)建體
最感興趣對其產(chǎn)生應(yīng)答的APP部分是43個(gè)氨基酸的Aβ核心肽(Aβ-43，相應(yīng)于SEQ ID NO2中殘基672-714)，它是AD腦中淀粉樣蛋白斑的主要組分。該APP片段是以上列出的所有構(gòu)建體的一部分。
變體1和2包含Aβ-43的APP上游部分，在此處已放置模式表位(modelepitopes)P2和P30。變體1和3-8均包含C-100片段，已表明它是神經(jīng)毒性的-C-100片段相應(yīng)于SEQ ID NO2中氨基酸殘基714-770。在變體3-5中，表位取代C-100片段的部分，而在變體6-8中已插入C-100。
變體9-35僅包含核心Aβ-43蛋白。變體9-13中，P2和P30融合在Aβ-43的任何一末端；在14-21中，P2和P30取代Aβ-43的部分；在22-33中，P2和P30插入到Aβ-43中；34包含三個(gè)分別被P30和P2間隔的相同的Aβ-43片段；35包含9個(gè)由交替的P2和P30表位間隔的Aβ-43重復(fù)。
根據(jù)本發(fā)明，上述Aβ-43蛋白的截短部分也應(yīng)用在免疫原性的類似物中。特別優(yōu)選的是截短體Aβ(1-42)、Aβ(1-40)、Aβ(1-39)、Aβ(1-35)、Aβ(1-34)、Aβ(1-34)、Aβ(1-28)、Aβ(1-12)、Aβ(1-5)、Aβ(13-28)、Aβ(13-35)、Aβ(17-28)、Aβ(25-35)、Aβ(35-40)、Aβ(36-42)和Aβ(35-42)(其中括號中的數(shù)字表示構(gòu)成相關(guān)片段的Aβ-43的氨基酸序列，-例如Aβ(35-42)與SEQ ID NO2中氨基酸706-711相同)。所有這些具有Aβ-43截短部分的變體，可用此處描述的Aβ片段制備，特別是變體9、10、11、12和13。
在某些情況下，優(yōu)選Aβ-43或其片段是突變的。特別優(yōu)選的是取代變異體，其中Aβ-43的35位的甲硫氨酸已被取代，優(yōu)選被亮氨酸或異亮氨酸取代，或簡單的被刪除。特別優(yōu)選的是，由于在淀粉樣蛋白原性多肽或外源TH表位中天然存在，或者由于它已被插入或添加，而僅包含一個(gè)在C-末端的單個(gè)甲硫氨酸的類似物。因此，除了可能位于C-末端的一個(gè)甲硫氨酸外，還優(yōu)選包括外源TH表位的類似物部分無甲硫氨酸。
實(shí)際上，通常優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明使用的APP或Aβ的所有類似物均具有以下特征，即僅包括一個(gè)作為類似物中C-末端氨基酸的單個(gè)甲硫氨酸，其他在淀粉樣蛋白原性多肽或外源TH表位中的甲硫氨酸被刪除或被另一種氨基酸取代。
一個(gè)更感興趣的突變是Aβ-43中19位的苯丙氨酸被刪除或取代，特別優(yōu)選的突變是用脯氨酸取代該苯丙氨酸。
下表中列出一組特別優(yōu)選的用Aβ-43的截短體或突變體構(gòu)建的構(gòu)建體
在該表中，分子中所用的Aβ片段由相對于Aβ(1-42/43)分子的aa 1的氨基酸數(shù)表示，即，1-28表示在分子中使用Aβ(1-42/43)的片段1-28。如果使用2個(gè)或多個(gè)不同片段，二者都表示在表中，即，1-12(a)+13-28(b)表示在分子中使用Aβ(1-42/43)的片段1-12和片段13-28。
而且，如果在構(gòu)建體中存在多于1個(gè)拷貝的相同片段，它在表中指出，即，1-12(x3)表示Aβ(1-42/43)的片段1-12在構(gòu)建體中存在3個(gè)拷貝。
另外，分子中Aβ片段的位置由相對于分子第一個(gè)氨基酸的氨基酸位置表示，即，22-49表示所述Aβ片段在分子中位于從氨基酸22到氨基酸49的位置，包括二者的位置。P2和P30表位的位置同樣所示。如果在分子中使用2個(gè)或多個(gè)不同Aβ片段，它們的位置均表示出來，即，1-12(a)+49-64(b)表示片段(a)在分子中aa 1-12的位置，而片段(b)在aa 49-64的位置。
而且，如果在分子中存在多于1個(gè)拷貝的相同片段，所有這些拷貝的位置均表示出來，即，1-12、34-45、61-72表示在分子中存在3個(gè)拷貝的Aβ片段，分別在位置1-12、34-45和61-72。
最后，每個(gè)分子所示的總長度包括Aβ片段和P2及P30表位。
變體42包含2個(gè)氨基酸取代，在位置19(苯丙氨酸被脯氨酸取代)，在位置35(甲硫氨酸被賴氨酸取代)，如在顯示Aβ片段的列中所示。
關(guān)于在特定位點(diǎn)引入外源T細(xì)胞表位的詳細(xì)信息，參見圖1和以上圖表。
一種另外類型的構(gòu)建體是特別優(yōu)選的。因?yàn)楸景l(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是避免破壞產(chǎn)生APP的細(xì)胞，而需要清除Aβ，因此制備僅包含當(dāng)存在于APP中時(shí)不暴露在細(xì)胞外相的Aβ部分的自身疫苗構(gòu)建體似乎是可行的。因此，這種構(gòu)建體需要包含至少一個(gè)來源于SEQ ID NO2中氨基酸700-714所確定的氨基酸片段的B細(xì)胞表位。因?yàn)檫@種短的多肽片段預(yù)計(jì)只有很弱的免疫原性，因此優(yōu)選這種自身疫苗構(gòu)建體包括幾個(gè)拷貝的B細(xì)胞表位，例如，以具有在本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容中公式I所示的結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體，參見如上所述。在公式I的形式中，術(shù)語淀粉樣蛋白e1-淀粉樣蛋白ex是指x個(gè)包含來源于SEQ ID NO2中氨基酸700-714的氨基酸序列的B細(xì)胞表位。優(yōu)選的備選物是上述淀粉樣蛋白原性(多)肽和選擇的外源T輔助細(xì)胞表位經(jīng)過酰胺鍵偶聯(lián)到多糖載體分子上--在這種方法中，可能進(jìn)行由SEQID NO2中氨基酸700-714所組成的“弱”的表位的多重呈遞，而且也可能選擇B細(xì)胞和T細(xì)胞表位的最適比例。
實(shí)施例2用本發(fā)明的Aβ和修飾的蛋白免疫轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建編碼hAβ43+-34的DNAhAβ43+-34基因通過幾個(gè)步驟進(jìn)行構(gòu)建。首先用引物ME#801(SEQ IDNO10)和ME#802(SEQ ID NO11)，以引物ME#800(SEQ ID NO9)為模板產(chǎn)生PCR片段。ME#800編碼具有大腸桿菌最適密碼子的人Aβ-43片段。ME#801和802對片段增加合適的限制性位點(diǎn)。
純化PCR片段，用Nco I和Hind III進(jìn)行消化，再次進(jìn)行純化，并克隆到Nco I-Hind III消化并純化的pET28b+大腸桿菌表達(dá)載體中。得到的編碼野生型人Aβ-43質(zhì)粒命名為pAB1。
在下一步中，T輔助細(xì)胞表位P2加入到分子的C-末端。引物ME#806(SEQ ID NO12)包含編碼P2表位的序列，從而通過PCR反應(yīng)得到P2和Aβ-43的融合體。
克隆通過用引物ME#178(SEQ ID NO8)和ME#806，并以pAB1作為模板制備PCR片段而進(jìn)行。純化該片段，用Nco I和Hind III進(jìn)行消化，再次進(jìn)行純化，并克隆到Nco I-Hind III消化并純化的pET28b+載體中。得到的質(zhì)粒命名為pAB2。
以類似的方式，制備另一個(gè)具有Aβ-43編碼序列并將另一個(gè)T輔助細(xì)胞表位P30增加到N末端的質(zhì)粒。這是通過用引物ME#105(SEQ ID NO7)和ME#807(SEQ ID NO13)并以pAB1為模板制備PCR片段而進(jìn)行。
純化該片段，用Nco I和Hind III進(jìn)行消化，再次進(jìn)行純化，并克隆到Nco I-Hind III消化并純化的pET28b+載體中。得到的質(zhì)粒命名為pAB3。
在第三步中，第二個(gè)Aβ-43重復(fù)通過引物ME#809(SEQ ID NO14)加入到質(zhì)粒pAB2的P2表位的C末端。同時(shí)ME#809緊隨在Aβ-43重復(fù)之后，創(chuàng)造一個(gè)BamHI位點(diǎn)。PCR片段用引物ME#178和ME#809以pAB2為模板進(jìn)行制備。該片段用Nco I和Hind III進(jìn)行消化，純化并克隆到Nco I-Hind III消化并純化的pET28b+載體中。得到的質(zhì)粒命名為pAB4。
最后，來自pAB3的P30表位-Aβ-43重復(fù)序列克隆到pAB4質(zhì)粒中。這通過用引物ME#811(SEQ ID NO16)和ME#105以pAB3為模板制備PCR片段而進(jìn)行。該片段經(jīng)純化，并在隨后的PCR中與ME#810(SEQ ID NO15)一起作為引物，并以pAB3為模板進(jìn)行PCR。得到的片段進(jìn)行純化，用BamHI和Hind III進(jìn)行消化，并克隆到BamHI-Hind III消化并純化的pAB4質(zhì)粒中。得到的質(zhì)粒pAB5編碼hAB43+-34分子。
所有PCR和克隆程序基本上如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.&Maniatis，T.1989″Molecular cloninga laboratory manual″.第2版.ColdSpring Harbor Laboratory，N.Y.所述來進(jìn)行。
對所有的克隆程序，使用的是大腸桿菌K-12細(xì)胞、菌株Top-10F′(Stratagene，美國)。pET28b+載體從Novagen，美國購買。所有引物在DNA Technology，丹麥合成。
hAB43+-34的表達(dá)和純化如pET28b+系統(tǒng)(Novagen)供應(yīng)商所述，由pAB5編碼的hAB43+-34蛋白在大腸桿菌BL21-Gold Novagen)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
表達(dá)的hAB43+-34蛋白通過洗滌包含體及隨后用BioCad純化工作站(PerSeptive Biosystems，USA)在存在6M脲的情況下進(jìn)行陽離子交換色譜而純化到超過85％的純度。脲隨后以包含降低數(shù)量的脲溶液進(jìn)行逐級透析而除去。最終緩沖液是10mM Tris，pH8.5。
免疫研究人APP(阿爾茲海默氏病前體蛋白)轉(zhuǎn)基因小鼠用于研究。這些小鼠稱為TgRND8+，表達(dá)APP的一種突變形式，其在小鼠腦中導(dǎo)致高濃度Aβ-40和Aβ-42的產(chǎn)生(Janus，C等)。
小鼠(每組8-10只小鼠)用Aβ-42(SEQ ID NO2，殘基673-714通過標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc策略合成)或hAB43+-34變體(實(shí)施例1表中構(gòu)建體34，重組產(chǎn)生)進(jìn)行免疫，以2周間隔共免疫4次。劑量是100mg Aβ或50mghAB43+-34。小鼠在第43天(三次注射后)和第52天(四次注射后)進(jìn)行放血，用血清通過直接Aβ-42ELISA測定抗Aβ-42特異滴度的水平。
下表所示的是平均相對抗Aβ-42滴度。
顯然，當(dāng)用hAB43+-34Aβ變體進(jìn)行免疫時(shí)在三和四次免疫后得到的抗體滴度分別大約是用未改變的野生型Aβ-42作為抗原得到的滴度的4倍和7.5倍。當(dāng)考慮用于免疫的變體的量僅是用于免疫的野生型序列量的50％的事實(shí)時(shí)，該事實(shí)被正確地對待。
實(shí)施例3用活化的多羥基聚合物作為交聯(lián)劑合成Aβ肽共聚物疫苗簡介傳統(tǒng)的結(jié)合物疫苗包括共價(jià)偶聯(lián)到載體蛋白上的(多)肽。該肽包含B細(xì)胞表位，載體蛋白提供T輔助細(xì)胞表位。但是，載體蛋白的大部分作為T輔助細(xì)胞表位的來源通常是無關(guān)的，因?yàn)檎麄€(gè)序列中僅有一小部分包含相關(guān)的T輔助細(xì)胞表位。這種表位作為肽，例如12-15個(gè)氨基酸的肽，來被定義和合成。如果這些肽共價(jià)連接到包含B細(xì)胞表位的肽上，例如通過多價(jià)活化的多羥基聚合物，可獲得僅包含相關(guān)部分的疫苗分子。進(jìn)一步可能提供一種包含B細(xì)胞和T細(xì)胞表位之間優(yōu)化比例的疫苗結(jié)合物。
活化的(acticated)多羥基聚合物的合成多羥基聚合物，例如葡聚糖、淀粉、瓊脂糖等，可用2，2，2-三氟乙基磺?；?三氟乙基磺酰基氯)，或者通過溶解在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的同質(zhì)合成(葡聚糖)，或者通過在例如丙酮中的異質(zhì)合成(淀粉、瓊脂糖、交聯(lián)的葡聚糖)進(jìn)行活化。
在干燥條件下，在補(bǔ)充了磁鐵用于攪拌的500ml圓底燒瓶中，向冷凍干燥的水溶性葡聚糖(4.5g，83mmol，臨床用等級，平均分子量78000)中加入225ml干燥的N-甲基吡咯烷酮(NMP)。將燒瓶放在60口油浴中并進(jìn)行磁力攪拌。溫度在20分鐘內(nèi)增加到92℃。當(dāng)葡聚糖溶解時(shí)，立即將燒瓶從油浴中移去，而且油浴溫度降低到40℃。燒瓶再(agaom)放入油浴中，仍進(jìn)行磁力攪拌，并逐滴加入三氟乙基磺酰基氯(2.764ml，25mmol)。15分鐘后，逐滴加入干燥的吡啶(無水，2.020ml，25mmol)。將燒瓶從油浴中移去，并在室溫下攪拌1小時(shí)。產(chǎn)物(三氟乙基磺?；罨钠暇厶?，TAD)在1200ml冷乙醇(99.9％)中沉淀。在離心機(jī)中2000rpm進(jìn)行離心，輕輕倒出上清，在50ml聚丙烯管中收集沉淀。沉淀溶解在50ml 0.5％醋酸中，在5000ml 0.5％醋酸中透析2次，并進(jìn)行冷凍干燥。TAD以冷凍干燥粉末貯存在-20℃。
不溶性多羥基聚合物，例如瓊脂糖或交聯(lián)的葡聚糖，可通過在例如丙酮中制備多羥基聚合物的混懸液而被三氟乙基磺?；罨?，并以固相合成技術(shù)進(jìn)行合成。活化的多羥基聚合物可通過過濾進(jìn)行收集。合適的方法在，例如Nilsson K和Mosbach K(1987)，Methods in Enzymology135，67頁和在Hermansson GT等(1992)，in″Immobilized Affinity LigandTechniques″，Academic Press，Inc.，87頁中進(jìn)行報(bào)道。
Aβ肽共聚物疫苗的合成TAD(10mg)溶解在100μl H2O中，并加入1000μl碳酸鹽緩沖液，pH9.6中，其含5mg Aβ-42(SEQ ID NO2，殘基673-714)、2.5mg P2(SEQ ID NO4)和2.5mg P30(SEQ ID NO6)。Aβ-42和P2及P30肽均包含被保護(hù)的賴氨酸基團(tuán)它們是1-(4，4-二甲基-2，6-二氧環(huán)己-1-亞基)乙基(Dde)保護(hù)形式的賴氨酸基團(tuán)。通過標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc策略制備肽，其中傳統(tǒng)的Fmoc-Lys(Boc)-OH已被Fmoc-Lys(Dde)-OH(獲自Novabiochem，目錄號04-12-1121)取代，即，賴氨酸中的ε-氨基用Dde取代Boc進(jìn)行保護(hù)。
測定pH值并用1M HCl調(diào)節(jié)到9.6。在室溫下2.5小時(shí)后，加入80％的肼溶液至肼的終濃度為8％，溶液在室溫下再溫育30分鐘，然后立即進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍干燥的產(chǎn)物溶解在水中，并在最終冷凍干燥前用水進(jìn)行充分地透析。
終產(chǎn)物中B細(xì)胞表位(Aβ)和T輔助細(xì)胞表位(P2和P30)的比例可在合成步驟中通過使用不同濃度的這些肽而進(jìn)行改變。另外，終產(chǎn)物可進(jìn)行標(biāo)記，例如用甘露糖(以將結(jié)合物定位到APCs上)，通過在合成步驟向碳酸鹽緩沖液中加入胺化了的甘露糖而實(shí)現(xiàn)。
如果使用不溶性活化的多羥基聚合物連接包含B細(xì)胞表位和T輔助細(xì)胞表位的肽，可以以固相合成來完成到多聚物的偶聯(lián)，收獲終產(chǎn)物并通過洗滌和過濾純化。
如在一般描述中所提及的，當(dāng)前描述的用于制備基于肽的疫苗的方法可應(yīng)用于任何其他多肽抗原中，其中制備純合成的肽疫苗是方便的，及其中所述多肽抗原以一個(gè)單一的肽提供足夠的免疫原性。
實(shí)施例4肽共聚物疫苗的合成將TAD(10mg)溶解在100μl H2O中，并加入1000μl碳酸鹽緩沖液，pH9.6中，含1-5mg肽A(任何感興趣的具有免疫原性的肽！)，1-5mg P2(白喉類毒素P2表位)和1-5mg P30(白喉類毒素P30表位)。測定pH值并用0.1M HCl調(diào)節(jié)到9.6。在室溫下2.5小時(shí)后，將溶液隨后立即進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍干燥的產(chǎn)物溶解在水中，在最終冷凍干燥前，用水進(jìn)行充分透析，或在凝膠過濾柱上進(jìn)行脫鹽。在肽序列中有賴氨酸的情況下，賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基在合成中應(yīng)用Fmoc-Lys(Dde)-OH衍生物通過Dde進(jìn)行保護(hù)(Gregorius和Theisen 2001，投稿中)。偶聯(lián)后，加入80％的肼溶液至肼的終濃度為1-20％，溶液在室溫下再溫育30分鐘，隨后立即進(jìn)行冷凍干燥，并在最終冷凍干燥前，用水進(jìn)行充分透析，或在凝膠過濾柱上進(jìn)行脫鹽。該原理在圖2的示意圖中進(jìn)行闡述。
這類免疫原已被本發(fā)明人應(yīng)用，以布氏疏螺旋體蛋白OspC的C-末端短片段作為“肽A”，并以白喉類毒素(diptheria toxoid)表位(P2或P30)作為肽B。用該抗原的免疫研究結(jié)果表明，只有本發(fā)明的包括OspC片段和與接種小鼠的與MHC單元型相匹配的外源白喉類毒素表位的免疫原能在這些小鼠中誘導(dǎo)與OspC反應(yīng)的抗體產(chǎn)生。相反，一個(gè)僅包含OspC肽的分子不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，對2種免疫原，其中一個(gè)包含OspC，另一個(gè)包含表位，的混合物同樣是這樣。因此斷定在相同的多羥基聚合物載體中的內(nèi)含體是優(yōu)選的，如果不是必需的，以誘導(dǎo)抗短肽半抗原，例如OspC，的抗體產(chǎn)生。
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<221>misc_feature<222>(2014)..(2142)<223>(42/43<400>1atg ctg ccc ggt ttg gca ctg ctc ctg ctg gcc gcc tgg acg gct cgg 48Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg1 5 10 15
gcg ctg gag gta ccc act gat ggt aat gct ggc ctg ctg gct gaa ccc 96Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro20 25 30cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac atg aat gtc cag 144Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln35 40 45aat ggg aag tgg gat tca gat cca tca ggg acc aaa acc tgc att gat 192Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp50 55 60acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc tac cct gaa ctg 240Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu65 70 75 80cag atc acc aat gtg gta gaa gcc aac caa cca gtg acc atc cag aac 288Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn85 90 95tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acc cat ccc cac ttt gtg 336Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val100 105 110att ccc tac cgc tgc tta gtt ggt gag ttt gta agt gat gcc ctt ctc 384Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu115 120 125gtt cct gac aag tgc aaa ttc tta cac cag gag agg atg gat gtt tgc 432Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys130 135 140gaa act cat ctt cac tgg cac acc gtc gcc aaa gag aca tgc agt gag 480Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu145 150 155 160aag agt acc aac ttg cat gac tac ggc atg ttg ctg ccc tgc gga att 528Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile165 170 175gac aag ttc cga ggg gta gag ttt gtg tgt tgc cca ctg gct gaa gaa 576Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu180 185 190agt gac aat gtg gat tct gct gat gcg gag gag gat gac tcg gat gtc 624Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val195 200 205tgg tgg ggc gga gca gac aca gac tat gca gat ggg agt gaa gac aaa 672
Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys210 215 220gta gta gaa gta gca gag gag gaa gaa gtg gct gag gtg gaa gaa gaa 720Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu225 230 235 240gaa gcc gat gat gac gag gac gat gag gat ggt gat gag gta gag gaa 768Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu245 250 255gag gct gag gaa ccc tac gaa gaa gcc aca gag aga acc acc agc att 816Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile260 265 270gcc acc acc acc acc acc acc aca gag tct gtg gaa gag gtg gtt cga 864Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg275 280 285gag gtg tgc tct gaa caa gcc gag acg ggg ccg tgc cga gca atg atc 912Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile290 295 300tcc cgc tgg tac ttt gat gtg act gaa ggg aag tgt gcc cca ttc ttt 960Set Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe305 310 315 320tac ggc gga tgt ggc ggc aac cgg aac aac ttt gac aca gaa gag tac 1008Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr325 330 335tgc atg gcc gtg tgt ggc agc gcc atg tcc caa agt tta ctc aag act 1056Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr340 345 350acc cag gaa cct ctt gcc cga gat cct gtt aaa ctt cct aca aca gca 1104Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala355 360 365gcc agt acc cct gat gcc gtt gac aag tat ctc gag aca cct ggg gat 1152Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp370 375 380gag aat gaa cat gcc cat ttc cag aaa gcc aaa gag agg ctt gag gcc 1200Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala385 390 395 400aag cac cga gag aga atg tcc cag gtc atg aga gaa tgg gaa gag gca 1248Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
405 410 415gaa cgt caa gca aag aac ttg cct aaa gct gat aag aag gca gtt atc 1296Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile420 425 430cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tct ttg gaa cag gaa gca gcc aac 1344Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn435 440 445gag aga cag cag ctg gtg gag aca cac atg gcc aga gtg gaa gcc atg 1392Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met450 455 460ctc aat gac cgc cgc cgc ctg gcc ctg gag aac tac atc acc gct ctg 1440Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu465 470 475 480cag gct gtt cct cct cgg cct cgt cac gtg ttc aat atg cta aag aag 1488Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys485 490 495tat gtc cgc gca gaa cag aag gac aga cag cac acc cta aag cat ttc 1536Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe500 505 510gag cat gtg cgc atg gtg gat ccc aag aaa gcc gct cag atc cgg tcc 1584Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser515 520 525cag gtt atg aca cac ctc cgt gtg att tat gag cgc atg aat cag tct 1632Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser530 535 540ctc tcc ctg ctc tac aac gtg cct gca gtg gcc gag gag att cag gat 1680Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp545 550 555 560gaa gtt gat gag ctg ctt cag aaa gag caa aac tat tca gat gac gtc 1728Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val565 570 575ttg gcc aac atg att agt gaa cca agg atc agt tac gga aac gat gct 1776Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala580 585 590ctc atg cca tct ttg acc gaa acg aaa acc acc gtg gag ctc ctt ccc 1824Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro595 600 605
gtg aat gga gag ttc agc ctg gac gat ctc cag ccg tgg cat tct ttt 1872Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe610 615 620ggg gct gac tct gtg cca gcc aac aca gaa aac gaa gtt gag cct gtt 1920Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val625 630 635 640gat gcc cgc cct gct gcc gac cga gga ctg acc act cga cca ggt tct 1968Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser645 650 655ggg ttg aca aat atc aag acg gag gag atc tct gaa gtg aag atg gat 2016Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp660 665 670gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat caa aaa ttg 2064Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu675 680 685gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt gca atc att gga 2112Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly690 695 700ctc atg gtg ggc ggt gtt gtc ata gcg aca gtg atc gtc atc acc ttg 2160Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu705 710 715 720gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc att cat cat ggt gtg gtg 2208Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val725 730 735gag gtt gac gcc gct gtc acc cca gag gag cgc cac ctg tcc aag atg 2256Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met740 745 750cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag ttc ttt gag cag atg 2304Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met755 760 765cag aac tag 2313Gln Asn770<210>2<211>770<212>PRT
<213>人<400>2Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg1 5 10 15Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro20 25 30Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln35 40 45Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp50 55 60Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu65 70 75 80Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr lle Gln Asn85 90 95Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val100 105 110Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu115 120 125Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys130 135 140Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu145 150 155 160Lys Ser Thr Ash Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile165 170 175Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu180 185 190Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val195 200 205Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys210 215 220Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu225 230 235 240Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
245 250 255Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile260 265 270Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg275 280 285Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile290 295 300Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe305 310 315 320Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr325 330 335Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr340 345 350Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala355 360 365Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp370 375 380Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala385 390 395 400Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala405 410 415Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile420 425 430Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn435 440 445Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met450 455 460Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu465 470 475 480Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys485 490 495Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe500 505 510
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser515 520 525Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser530 535 540Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp545 550 555 560Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val565 570 575Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala580 585 590Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro595 600 605Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe610 615 620Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val625 630 635 640Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser645 650 655Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp660 665 670Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu675 680 685Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly690 695 700Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu705 710 715 720Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val725 730 735Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met740 745 750Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met755 760 765
Gln Asn770<210>3<211>45<212>DNA<213>破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)<220>
<221>CDS<222>(1)..(45)<223>編碼P2表位的DNA<400>3cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg 45Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)<400>4Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leul 5 10 15<210>5<211>63<212>DNA<213>破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)<220>
<22l>CDS<222>(1)..(63)<223>編碼P30表位的DNA<400>5ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc 48Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15gct agc cac ctg gaa 63Ala Ser His Leu Glu20
<210>6<211>21<212>PRT<213>破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)<400>6Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15Ala Ser His Leu Glu20<210>7<211>21<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物<400>7caactcagct tcctttcggg c 21<210>8<211>21<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物<400>8agatctcgat cccgcgaaat t 21<210>9<211>135<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物<400>9atggatgcag aattccgtca cgactccggt tacgaagttc accaccagaa actggttttc 60ttcgcagaag atgttggttc caacaaaggt gcaatcatcg gtctgatggt tggcggtgtt120gttatcgcga cctag 135<210>10<211>31<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物
<400>10gccggccatg gatgcagaat tccgtcacga c 31<210>11<211>39<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物<400>11gccggaagct tctaggtcgc gataacaaca ccgccaacc 39<210>12<211>84<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物<400>12ccggcaagct tctacagctc ggtgataccg atgaatttgg agttagcttt gatgtactgg60gtcgcgataa caacaccgcc aacc 84<210>13<211>101<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物<400>13gccggccatg ggtttcaaca acttcaccgt tagcttctgg ctgcgtgttc cgaaagttag60cgcgagccac ctggaagatg cagaattccg tcacgactcc g 101<210>14<211>172<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物<400>14gggccaagct tggatccggt cgcgataaca acaccgccaa ccatcagacc gatgattgca60cctttgttgg aaccaacatc ttctgcgaag aaaaccagtt tctggtggtg aacttcgtaa 120ccggagtcgt gacggaactc tgcatccagc tcggtgatac cgatgaattt gg 172<210>15<211>30<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物
<400>15ctggaagatg cagagttccg tcacgactcc 30<210>16<211>35<212>DNA<213>合成的<223>合成的PCR引物<400>16gcgccggatc cttcaacaac ttcaccgtta gcttc35<210>17<211>13<212>PRT<213>合成的<223>合成的HLA DR結(jié)合序列<400>17Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10
權(quán)利要求
1.一種在動物，包括人中體內(nèi)下調(diào)淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)或β-淀粉樣蛋白(Aβ)的方法，該方法包含對所述動物的免疫系統(tǒng)有效呈遞免疫有效量的至少一個(gè)APP或Aβ的類似物，所述類似物在同一個(gè)分子中整合至少一個(gè)APP和/或Aβ的B細(xì)胞表位和至少一個(gè)外源T輔助細(xì)胞表位(TH表位)，使得用所述類似物免疫動物誘導(dǎo)產(chǎn)生抗所述動物的自源APP或Aβ的抗體，其中所述類似物a)是由至少一個(gè)拷貝SEQ ID NO2中殘基672-714的亞序列組成的多聚氨基酸，其中所述外源TH表位通過氨基酸添加和/或插入和/或刪除和/或取代的方式而被引入，其中所述亞序列選自SEQ ID NO2的氨基酸殘基673-714組成的氨基酸序列的殘基1-42、殘基1-40、殘基1-39、殘基1-35、殘基1-34、殘基1-28、殘基1-12、殘基1-5、殘基13-28、殘基13-35、殘基17-28、殘基25-35、殘基35-40、殘基36-42和殘基35-42；和/或b)是包含外源TH表位和打斷的APP或Aβ序列的多聚氨基酸，以使所述類似物不包括任何與引發(fā)T-細(xì)胞應(yīng)答的MHC II類分子有效結(jié)合的SEQ ID NO2的亞序列；和/或c)是包含外源TH表位和APP或Aβ衍生的氨基酸的多聚氨基酸，并在所述類似物的C-末端包含一個(gè)單獨(dú)的甲硫氨酸殘基，其中APP或Aβ中及外源TH表位中的其他甲硫氨酸殘基已被取代或刪除，優(yōu)選已被亮氨酸或異亮氨酸取代；和/或d)是一種包含多羥基聚合物骨架的結(jié)合物，在所述骨架上分別偶聯(lián)如a)中定義的多聚氨基酸和/或如b)中定義的多聚氨基酸和/或如c)中定義的多聚氨基酸；和/或e)是一種包含多羥基聚合物骨架的結(jié)合物，在所述骨架上分別偶聯(lián)1)外源TH表位和2)選自下述的多聚氨基酸如a)中定義的亞序列、如b)中定義的APP或Aβ的打斷的序列、和APP或Aβ衍生的，C末端包含一個(gè)單獨(dú)的甲硫氨酸殘基的氨基酸序列，其中APP或Aβ中和所述外源TH表位中的其他甲硫氨酸殘基已被取代或刪除，優(yōu)選已被亮氨酸或異亮氨酸取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在所述類似物中保留了APP或Aβ的B細(xì)胞表位的實(shí)質(zhì)部分，而且-至少引入一個(gè)第一部分，其使所述類似物定位到抗原呈遞細(xì)胞(APC)或B淋巴細(xì)胞的第一部，和/或-至少引入一個(gè)刺激所述免疫系統(tǒng)的第二部分，和/或-至少引入一個(gè)優(yōu)化所述類似物呈遞到所述免疫系統(tǒng)的第三部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第一和/或第二和/或第三部分通過共價(jià)或非共價(jià)連接到所述APP或Aβ序列中合適的化學(xué)基團(tuán)上而作為側(cè)鏈基團(tuán)被附著。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述類似物包含一種融合多肽。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述氨基酸取代和/或刪除和/或插入和/或添加的引入導(dǎo)致APP或Aβ的完整三級結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)保留。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述類似物包括至少一個(gè)APP或Aβ的B細(xì)胞表位的復(fù)制品和/或引入一種半抗原。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述外源T-細(xì)胞表位在所述動物中是免疫顯性的。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述外源T-細(xì)胞表位是混雜的，例如從天然混雜的T細(xì)胞表位和人工MHC-II結(jié)合肽序列中選擇的外源T細(xì)胞表位。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述天然T-細(xì)胞表位選自破傷風(fēng)類毒素表位如P2或P30，白喉類毒素表位、流感病毒血凝素表位和P.falciparum CS表位。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述類似物包含B細(xì)胞表位，當(dāng)其以所述前體多肽Aβ的細(xì)胞結(jié)合形式存在時(shí)不暴露到細(xì)胞外相。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述類似物缺少至少一個(gè)B細(xì)胞表位，當(dāng)其以所述前體多肽的細(xì)胞結(jié)合形式存在時(shí)暴露到細(xì)胞外相。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述類似物包含至多9個(gè)SEQID NO2的連續(xù)氨基酸，例如至多8個(gè)，至多7個(gè)，至多6個(gè)，至多5個(gè)，至多4個(gè)和至多3個(gè)連續(xù)氨基酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述類似物包含至少一個(gè)SEQ ID NO2的亞序列，使得每個(gè)這樣的至少一個(gè)SEQ ID NO2的亞序列單獨(dú)地由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO2的9個(gè)連續(xù)氨基酸、SEQID NO2的8個(gè)連續(xù)氨基酸、SEQ ID NO2的7個(gè)連續(xù)氨基酸、SEQ ID NO2的6個(gè)連續(xù)氨基酸、SEQ ID NO2的5個(gè)連續(xù)氨基酸、SEQ ID NO2的4個(gè)連續(xù)氨基酸和SEQ ID NO2的3個(gè)連續(xù)氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中所述連續(xù)的氨基酸起始于一種氨基酸殘基，其選自殘基672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713和714。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中對所述免疫系統(tǒng)的呈遞通過使至少兩個(gè)拷貝的Aβ衍生的片段或所述類似物共價(jià)或非共價(jià)連接到能夠?qū)崿F(xiàn)多拷貝抗原決定簇的呈遞的載體分子上而實(shí)現(xiàn)。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，變體d或e，其中所述多聚氨基酸和TH表位通過酰胺鍵連接到所述多羥基聚合物上。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，變體d或e，其中所述多羥基聚合物是多糖。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述類似物已與一種佐劑配制，所述佐劑促進(jìn)破壞對自身抗原的自動耐受。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中有效量的所述類似物通過一種途徑對所述動物給藥，所述途徑選自腸胃外途徑，例如皮內(nèi)、皮下和肌內(nèi)途徑；腹膜途徑；口服途徑；口含途徑；舌下途徑；硬膜外途徑；脊柱途徑；肛門途徑和顱內(nèi)途徑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述類似物的有效量為0.5μg-2,000μg。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，變體a-c，其中所述類似物對所述免疫系統(tǒng)的呈遞是通過將編碼所述類似物的核酸導(dǎo)入到所述動物的細(xì)胞中，從而獲得所述導(dǎo)入的核酸的細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述導(dǎo)入的核酸選自裸露DNA、與帶電荷或不帶電荷的脂類配制的DNA、配制在脂質(zhì)體中的DNA、包括在病毒載體中的DNA、與促進(jìn)轉(zhuǎn)染的蛋白或多肽配制的DNA、與導(dǎo)向蛋白或多肽配制的DNA、與沉淀鈣的試劑配制的DNA、偶聯(lián)到惰性載體分子的DNA、包封在殼多糖或脫乙酰殼多糖中的DNA和與佐劑配制的DNA。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22任一項(xiàng)的方法，它包括每年至少進(jìn)行一次給藥/導(dǎo)入，例如至少2次、至少3次、至少4次、至少6次和至少12次給藥/導(dǎo)入。
24.一種治療和/或預(yù)防和/或改善阿爾茲海默氏病或其他以淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病和癥狀的方法，該方法包含根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法下調(diào)APP或Aβ，以達(dá)到淀粉樣蛋白總量降低或淀粉樣蛋白形成速度具有臨床意義的降低。
25.一種來源于動物APP或Aβ的APP或Aβ類似物，其中引入修飾，所述修飾導(dǎo)致用所述類似物免疫所述動物誘導(dǎo)產(chǎn)生抗所述動物自身APP或Aβ的抗體，而且其中所述類似物如權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所定義。
26.一種包含免疫有效量的根據(jù)權(quán)利要求25的類似物的免疫組合物，所述組合物進(jìn)一步包含藥用和免疫上可接受的載體和/或媒介物和任選地佐劑。
27.一種核酸片段，其編碼權(quán)利要求25的類似物。
28.一種攜帶權(quán)利要求27的核酸片段的載體，例如能夠自主復(fù)制的載體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的載體，其選自質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微型染色體和病毒。
30.權(quán)利要求28或29的載體，在5′→3′方向和可操作連接而言，其包含一種用于啟動權(quán)利要求27的核酸片段表達(dá)的啟動子，任選地編碼使所述多肽片段分泌或整合到膜中的引導(dǎo)肽的核酸序列，權(quán)利要求27的核酸片段，和任選地一種終止子。
31.權(quán)利要求28-30任一項(xiàng)的載體，當(dāng)引入到宿主細(xì)胞中時(shí)，它能夠或不能被整合到所述宿主細(xì)胞基因組中。
32.權(quán)利要求30或31的載體，其中所述啟動子啟動在真核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞中的表達(dá)。
33.一種攜帶權(quán)利要求28-32任一項(xiàng)的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，例如一種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其能夠復(fù)制權(quán)利要求27的核酸片段。
34.權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，它是一種微生物，選自細(xì)菌、酵母、原生動物或來源于多細(xì)胞機(jī)體的細(xì)胞，所述多細(xì)胞機(jī)體選自真菌、昆蟲細(xì)胞例如S2或SF細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。
35.權(quán)利要求33或34的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求28的核酸片段，例如一種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其分泌或在其表面攜帶權(quán)利要求25的類似物。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，變體a-c，其中對所述免疫系統(tǒng)的呈遞通過給藥攜帶編碼和表達(dá)所述類似物的核酸片段的非致病性微生物或病毒而實(shí)現(xiàn)。
37.一種誘導(dǎo)產(chǎn)生抗淀粉樣蛋白的抗體的組合物，所述組合物包含-權(quán)利要求27的核酸片段或權(quán)利要求28-32任一項(xiàng)的載體，和-藥用和免疫上可接受的載體和/或媒介物和/或佐劑。
38.一種穩(wěn)定的細(xì)胞系，其攜帶權(quán)利要求28-32任一項(xiàng)的載體，并表達(dá)權(quán)利要求27的核酸片段，而且任選地分泌或在其表面攜帶權(quán)利要求25的類似物。
全文摘要
發(fā)明了抵抗以淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病的新方法。概括地說，該方法基于抗淀粉樣蛋白前體(APP)或β淀粉樣蛋白(Aβ)的免疫接種。優(yōu)選地免疫接種通過給藥自源APP或Aβ類似物而發(fā)揮作用，所述類似物能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗自源淀粉樣多肽的抗體。特別優(yōu)選地是，以通過修飾而引入一個(gè)或幾個(gè)外源的免疫顯性的混雜型T細(xì)胞表位的自源Aβ作為免疫原。另外也發(fā)明了抗APP或Aβ的核酸免疫接種和使用活疫苗的免疫接種，以及在免疫接種中所用的方法和方式。這些方法和方式包括制備類似物和藥物制品以及核酸片段、載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、多肽和藥物組分的方法。
文檔編號A61K39/10GK1893970SQ02816326
公開日2007年1月10日 申請日期2002年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月20日
發(fā)明者彼得·比爾克·拉斯穆森, 馬丁·羅蘭·詹森, 克勞斯·格雷戈留斯·尼爾森, 彼得·克費(fèi)歐德, 弗洛倫斯·達(dá)爾·德甘 申請人:法麥克薩有限公司