專利名稱：海蓬子提取物抑制酪氨酸酶活性的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海蓬子提取物在抑制酪氨酸酶活性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于酪氨酸酶是合成黑色素的關(guān)鍵，因此目前的大多數(shù)皮膚美白產(chǎn)品都是在化妝 品中添加了酪氨酸酶抑制劑，通過破壞酪氨酸酶活性，從而達(dá)到減少皮膚中黑色素的目的。對(duì)苯二酚因?yàn)閮r(jià)格便宜，效果好，曾是最廣泛使用的美白劑之一。對(duì)苯二酚和維甲 酸的混合配方，對(duì)消除紫外線和激素導(dǎo)致的黑色素沉積頗為有效。不過后來有研究表明，對(duì) 苯二酚會(huì)誘發(fā)白血病。自從2001年起，歐洲已經(jīng)禁止在美白化妝品中添加對(duì)苯二酚。曲酸、壬二酸、乙二醇酸、煙酰胺、熊果素等化學(xué)物都可以抑制酪氨酸酶，也被用于 美白化妝品中。有些酪氨酸酶抑制劑發(fā)揮作用時(shí)，需要借助汞(即水銀)做催化劑，因此有 些美白化妝品中還含有一定量的汞。化妝品公司不僅推出各種“純天然”新產(chǎn)品，還不斷嘗 試一些“高新”技術(shù)。比如2007年，法國某公司研制出一種含有反義寡聚核苷酸的美白產(chǎn) 品。反義寡聚核苷酸可以特異性抑制靶基因表達(dá)，近年來多用于基因治療。該公司研究人 員發(fā)表的論文稱，將反義寡聚核苷酸的美白產(chǎn)品外敷在皮膚上，可以抑制皮膚細(xì)胞中酪氨 酸酶基因的表達(dá)，美白效果達(dá)到30%多。不過，反義寡聚核苷酸一般不容易進(jìn)入細(xì)胞，在基 因治療中，需要注射進(jìn)入人體。所以，這種外敷的“基因治療”法，其真實(shí)效果不免令人懷疑。美白產(chǎn)品除了外敷的化妝品，還有內(nèi)服的藥劑，目前比較常見的是一種叫做谷胱 甘肽的有機(jī)物，在體內(nèi)與銅離子結(jié)合后，可以抑制酪氨酸酶活性。隨著酪氨酸酶抑制劑在美白型化妝品中的不斷開發(fā)及應(yīng)用，以及“純天然化妝品” 回歸主流的趨勢下，天然產(chǎn)物酪氨酸酶抑制劑的開發(fā)研究越來越得到重視。酪氨酸合成酶 抑制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域用于治療和預(yù)防黑色素瘤、黃褐斑等色素沉著性疾病，在化妝品領(lǐng)域用 于人體肌膚的美白，在食品工業(yè)領(lǐng)域用于預(yù)防果蔬因褐變而失鮮變質(zhì)，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域因酪氨 酸合成酶是昆蟲賴以生存的關(guān)鍵酶而成為最有前景的生物殺蟲藥劑之一，因而酪氨酸合成 酶抑制劑的開發(fā)有著廣闊的應(yīng)用前景。海蓬子為黎科莖肉質(zhì)化真鹽生植物，利用海水灌溉，基本無需噴灑農(nóng)藥，種植管理 簡單、不生病蟲害。海蓬子營養(yǎng)價(jià)值極高，是上佳的無公害綠色保健食品。除作為蔬菜之外 還具有藥用、保健及制造建材等價(jià)值?，F(xiàn)代研究證明海蓬子中含有黃酮類物質(zhì)，黃酮類化 合物具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗衰老、減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基的作用。這 與抑制酪氨酸合成酶活性有一定的聯(lián)系。海蓬子(SH)被一些居住在沿海地區(qū)的人用作民 間醫(yī)藥蔬菜。以往的研究表明，植物可刺激細(xì)胞因子和一氧化氮釋放，并表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié) 作用。另據(jù)報(bào)道，在小鼠電感試驗(yàn)中，海蓬子具有預(yù)防高脂飲食引起的高血糖和高血脂癥 作用。在海蓬子所有藥理作用研究中，抗氧化作用是研究最廣泛的。例如，通過用海蓬子提 取物分解新的綠原酸的反應(yīng)中可以發(fā)現(xiàn)海蓬子具有強(qiáng)大的抗氧化活性，并能有效保護(hù)質(zhì)粒 DNA。同時(shí)海蓬子的某種酶的誘導(dǎo)抗氧化和抗凝作用也被廣泛研究。在一個(gè)卵巢切除誘導(dǎo) 的氧化應(yīng)激模型中，海蓬子提取物能夠抑制肝臟炎癥和肝硬化。近來，具有皮膚再生作用的海蓬子提取物的飲料和綠色食品已經(jīng)制定，然而海蓬子對(duì)皮膚的藥理作用尚未調(diào)查。黑色素起著保護(hù)皮膚免受太陽輻射的紫外線對(duì)人體皮膚的有害影響，并具有清除 有毒藥物和化學(xué)品的重要作用。黑色素生物合成的前兩個(gè)步驟是L_酪氨酸的羥基轉(zhuǎn)化為 3，4-二羥基-苯丙氨酸(L-多巴)和L-多巴氧化成ο-多巴醌。這種ο-苯醌是非常被動(dòng) 的，自發(fā)形成黑色素沉著，造成了嚴(yán)重的人類審美的問題。多功能的酪氨酸酶是含有銅元素 的活性酶，分子量在60-70KDa之間。抑制L-酪氨酸的羥基轉(zhuǎn)化成L-多巴，并抑制L-多巴 氧化成ο-多巴醌，并作為已知合成的關(guān)鍵酶。據(jù)報(bào)道稱抗氧化劑通過氧化酪氨酸酶來抑制 其活性，抑制化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生黑色素，它們改變了形成黑色素的結(jié)構(gòu)，并展現(xiàn)出美白的效果。 研究表明由于海蓬子的抗氧化活性物質(zhì)在其組織中，研究其提取物的潛能，可用來作為皮 膚的抗氧化劑和美白劑。因?yàn)?，肌膚的美白主要是受黑色素含量和酪氨酸酶活性的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的揭示海蓬子提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用，為預(yù)防和治療色 素沉著疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本發(fā)明的技術(shù)方案分別制備海蓬子水提物、海蓬子醇提物、海蓬子超聲波水提 物、海蓬子超聲波醇提物，分別經(jīng)蒸餾濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮得到濃縮物，對(duì)酪氨酸合 成酶合成活性的抑制作用進(jìn)行了研究。為化妝品行業(yè)提供新的天然酪氨酸合成酶抑制劑。本發(fā)明的有益效果當(dāng)今研究和開發(fā)利用生長于廣袤海岸荒漠和海灘上的鹽生植 物，已成為當(dāng)今世界農(nóng)業(yè)的重大課題，在鹽堿地上耕作是一種新的思維方式。因?yàn)楹Ｅ钭由?長在不毛之地的鹽堿地上，土地費(fèi)用比較低。另外，它無蟲害，不需要用農(nóng)藥，也不需要鋤 草，海蓬子種植管理費(fèi)用不高。因而海蓬子提取物可以作為天然美白活性物質(zhì)應(yīng)用于美白 護(hù)膚品和功能食品，也可以作為預(yù)防和治療黑色素瘤等色斑疾病的藥物進(jìn)行開發(fā)。為化妝 品行業(yè)提供了新的廉價(jià)的天然美白素材。


圖1實(shí)施例1中各種提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果圖。圖2實(shí)施例2中不同濃縮方式對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果。圖3實(shí)施例3中乙醇的配伍作用對(duì)海蓬子提取物抑制酪氨酸酶活性的效果。圖4實(shí)施例4中對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞酪氨酸酶活性的抑制率分析。圖5實(shí)施例5中對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞黑色素合成抑制的培養(yǎng)效果圖。圖6實(shí)施例5中對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞黑色素合成的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1各種提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果分析海蓬子水(醇)提物的制備 取研磨好的海蓬子粉末3g加入60mL蒸餾水(或60mL體積分?jǐn)?shù)為60 %乙醇)浸 泡24h，回流提取Ih0
海蓬子超聲波水(醇)提物的制備取研磨好的海蓬子粉末3g加入60mL蒸餾水(或60mL體積分?jǐn)?shù)為60 %乙醇)浸 泡半小時(shí)，煮沸30min，冷卻至室溫，用超聲波(59kHz，500W，65°C )提取lh。酪氨酸合成酶活性抑制率的測定取上述海蓬子提取液2mL，加pH 6. 8的磷酸鹽緩沖液ImL與2. Ommol/L的酪氨酸 溶液2mL，待混合均勻后在冰浴中迅速加入酪氨酸合成酶溶液lmL，混勻，37°C溫育lOmin， 于412nm處測定吸光度。酪氨酸合成酶抑制率(1% )計(jì)算公式為I%= [(A-B)-(C-D)]/[A-B] X 100A 未加提取物樣品的加酶混合液所測的吸光度；B 未加提取物樣品亦未加酶的混合液所測的吸光度；C 加提取物樣品和酶的混合液所測的吸光度；D 加提取物樣品而未加酶的混合液所測的吸光度通過圖1可以清晰地看到，由于乙醇的配伍作用，醇提物比水提物對(duì)酪氨酸合成 酶的抑制效果更顯著；因?yàn)槌暡ㄆ扑榧?xì)胞的空化作用和強(qiáng)化傳質(zhì)的機(jī)械作用，從而更有 利于海蓮子活性物的釋出，表現(xiàn)為超聲波的醇提物比超聲波的水提物具有更強(qiáng)的抑制作 用。故最適宜選取超聲波醇提方案來提取海蓬子中酪氨酸合成酶的抑制劑。實(shí)施例2不同濃縮方式對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果分析用蒸餾法濃縮提取液置于6000r/min離心4min，得上清液，置于沸水鍋里，直至試管內(nèi)的液體揮 發(fā)至大概5mL。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法濃縮提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以60°C濃縮蒸發(fā)lh，混合液于6000r/min離心4min，得上清液。由圖2可以看出，蒸發(fā)濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取物這兩種不同濃縮條件，對(duì)酪 氨酸合成酶活性的抑制率影響不是很大。說明海蓬子提取物中抑制酪氨酸合成酶活性的成 分受溫度的影響不顯著。實(shí)施例3乙醇的配伍作用對(duì)海蓬子提取物抑制酪氨酸酶活性的效果分析從圖3可知，用水回流濃縮后的海蓬子醇提取物對(duì)酪氨酸合成酶有明顯抑制效 果，與未加提取液相比，酶促反應(yīng)時(shí)間曲線下移；至于海蓬子醇提取物的酶促反應(yīng)時(shí)間曲線 繼續(xù)下移，說明由于乙醇的配伍作用，海蓬子醇提取物對(duì)酪氨酸合成酶的抑制效果更加顯 著?？傊?，兩種方式處理的海蓬子醇提取物對(duì)酪氨酸合成酶都有明顯的抑制效果。實(shí)施例4對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響將活化菌體以2%的接種量接種到種子培養(yǎng)基中(葡萄糖5%，(NH4)2SO4O. 06%, K2HPO4O. 5%, MgSO4. 7Η20 0. 04%, NaCl 0. 1 %，酵母抽提物 0. 04%，121°C滅菌 20 分鐘。)， 控制pH 6. 5，300C，150r/min搖瓶培養(yǎng)4d。IOOOOr離心5min，收集菌體，菌體經(jīng)去離子水洗 滌兩遍，棄去上清，得到濕菌體待用。稱取2g濕菌體，采用無菌去離子水制成2g/100mL的 菌懸液。取含不同濃度海蓬子提取物的溶液5mL(空白對(duì)照為5mL去離子水)，放入IOOmL 三角瓶中，再分別加5mL上述菌懸液(每樣重復(fù)三遍)，再添加40mL種子培養(yǎng)基，在最佳培 養(yǎng)條件下置于搖床中，150r/min振蕩培養(yǎng)48h后，IOOOOr離心5min，棄去培養(yǎng)基，加入PBS洗滌兩次，加入1 %的TritonX-IOO溶液振蕩5分鐘，加入L-Dopa溶液，37°C反應(yīng)30分鐘， 于492nm檢測吸光度值。從圖4可知，酪氨酸酶活性受所添加海蓬子的劑量增加而活性降低，即酪氨酸酶 活性被抑制率提高。海蓬子(100yg/ml)對(duì)酪氨酸酶的抑制率達(dá)到59. 1 %。實(shí)施例5對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞黑色素合成的影響將活化菌體以2%的接種量接種到種子培養(yǎng)基中，控制pH 6. 5,30°C,150r/min搖 瓶培養(yǎng)4d。IOOOOr離心5min，收集菌體，菌體經(jīng)去離子水洗滌兩遍，棄去上清，得到濕菌體 待用。稱取2g濕菌體，采用無菌去離子水制成2g/100mL的菌懸液。取含不同濃度海蓬子 提取物的溶液5mL (空白對(duì)照為5mL去離子水)，放入IOOmL三角瓶中，再分別加5mL上述菌 懸液(每樣重復(fù)三遍)，再添加40mL種子培養(yǎng)基，在最佳培養(yǎng)條件下置于搖床中，150r/min 振蕩培養(yǎng)48h后，向其加入同等體積的lmol ^L-1NaOHjirc加熱攪拌Ih后，以6000r -min"1 離心15min棄沉淀，合并上清液。將定性濾紙103多次過濾后的上清液再經(jīng)微孔濾膜 (0. 45 μ m)真空抽濾3次后，收集的濾液用6mol · L^HCl調(diào)pH至2 3左右，靜置4h后沸 水浴加熱30min，6000r · mirT1離心lOmin，蒸餾水洗滌沉淀至中性，烘干得到黑色素粗品。 從圖5可知，添加了海蓬子提取物的培養(yǎng)液顏色呈黃綠色，而對(duì)照為深褐色；經(jīng)檢測由圖6 可知，添加了 ΙΟΟμ g/ml海蓬子提取物的培養(yǎng)液中，細(xì)胞所分泌的黑色素含量僅有241 μ g/ ml，而空白中達(dá)到972 μ g/ml，為添加海蓬子提取物的4倍之多。進(jìn)一步說明，海蓬子提取物 由于抑制了出芽短梗霉細(xì)胞的酪氨酸酶合成活性，從而抑制了細(xì)胞黑色素的分泌。
權(quán)利要求
根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蓬子提取物在抑制酪氨酸酶活性中的應(yīng)用，其特征是本發(fā)明所述的海蓬子提取物，是指海蓬子水提物、海蓬子醇提物、超聲波水提物、超聲波醇提物。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的海蓬子提取物，其特征是海蓬子水提物、海蓬子醇提物、超 聲波水提物、超聲波醇提物均分別經(jīng)蒸餾濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮所得濃縮物。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的海蓬子提取濃縮物，其特征是對(duì)酪氨酸合成酶活性的抑制 作用研究結(jié)果表明，蒸餾濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮對(duì)提取物的抑制率幾乎沒有影響。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蓬子提取物在抑制酪氨酸酶活性中的應(yīng)用，其特征是這 四種提取物對(duì)以酪氨酸為底物的酪氨酸酶抑制作用存在顯著性差異；抑制率分別為水提 物32. 48%，醇提物62. 37%，超聲波水提物43. 56%，超聲波醇提物75. 81%。其中海蓬子 超聲波醇提物表現(xiàn)出最好的抑制作用。為預(yù)防和治療色素沉著疾病提供依據(jù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蓬子提取物在抑制酪氨酸酶活性中的應(yīng)用，其特征是海 蓬子提取物在抑制出芽短梗霉細(xì)胞酪氨酸酶活性、細(xì)胞黑色素合成方面都表現(xiàn)出了較好的 效果。
全文摘要
本發(fā)明涉及海蓬子提取物抑制酪氨酸酶活性的應(yīng)用。本發(fā)明所述的海蓬子提取物，是指海蓬子水提物、海蓬子醇提物、超聲波水提物、超聲波醇提物，分別經(jīng)蒸餾濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮所得濃縮物，提供了其對(duì)酪氨酸合成酶活性的抑制作用研究結(jié)果。結(jié)果表明，蒸餾濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮對(duì)提取物的抑制率幾乎沒有影響。這四種提取物對(duì)以酪氨酸為底物的酪氨酸酶抑制作用存在顯著性差異。抑制率分別為水提物32.48％，醇提物62.37％，超聲波水提物43.56％，超聲波醇提物75.81％。其中海蓬子超聲波醇提物表現(xiàn)出最好的抑制作用。為預(yù)防和治療色素沉著疾病提供依據(jù)。
文檔編號(hào)A61P17/00GK101953764SQ20101028169
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者余曉紅, 劉漢文, 張龍, 申玉香, 許偉, 邵榮, 鄭清, 陳洪興 申請(qǐng)人:鹽城工學(xué)院