專利名稱：豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型+豬鏈球菌7型的三價(jià)滅活疫苗及制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的疫苗主要適用于母豬，公豬及仔豬對(duì)豬鏈球菌病的防治。
背景技術(shù)：
近年來豬鏈球菌病在國(guó)內(nèi)外集約化養(yǎng)豬場(chǎng)的感染率和發(fā)病率日益提高，所造成的經(jīng)濟(jì)損失日漸嚴(yán)重，已成為危害現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。已知豬鏈球菌有33種血清型，其中的2型可引起豬急性敗血癥、腦膜腦炎、關(guān)節(jié)炎和急性死亡，也可導(dǎo)致生豬從業(yè)人員中的特定人群感染和死亡，是一種重要的人畜共患傳染病(Wisselink等,2002)。國(guó)外自1968年荷蘭首次報(bào)道人感染腦膜炎病例以來，已有300多人因感染豬鏈球菌而死亡。在我國(guó)，自七十年代以來，該病已在全國(guó)二十多個(gè)省市發(fā)生或流行，造成了不同程度的經(jīng)濟(jì)損 失。2005年6 8月，四川省資陽市、內(nèi)江市等地區(qū)暴發(fā)了豬鏈球菌2型病，并導(dǎo)致204人感染，38人死亡(趙戰(zhàn)勤等，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007)。近年來豬鏈球菌2型病在我國(guó)廣泛存在并嚴(yán)重流行，已成為當(dāng)前嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種主要疫病，而且給人類也造成了嚴(yán)重的危害；同時(shí)發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌7型致病有不斷上升的趨勢(shì)，其發(fā)病率高、潛伏期長(zhǎng)、造成飼料報(bào)酬率降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失；而馬鏈球菌獸疫亞種(蘭氏分群中為C群鏈球菌)在我國(guó)豬場(chǎng)仍時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重危害著我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)。目前市售商品疫苗只有豬鏈球菌2型及豬鏈球菌2型+馬鏈球菌獸疫亞種二價(jià)疫苗，但當(dāng)前豬鏈球菌7型也較常見，現(xiàn)有疫苗不能對(duì)其起到預(yù)防作用，而且市售商品疫苗需多次免疫，成本較高，對(duì)豬只的應(yīng)激較大。因此市場(chǎng)上急需發(fā)明一種新的能同時(shí)預(yù)防豬鏈球菌2型病，豬鏈球菌7型病和馬鏈球菌獸疫亞種三種疾病滅活疫苗以解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種豬鏈球菌三價(jià)滅活疫苗，該滅活疫苗為馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型+豬鏈球菌7型的三價(jià)滅活疫苗，該滅活疫苗能同時(shí)有效的預(yù)防豬鏈球菌2型病，豬鏈球菌7型病和馬鏈球菌獸疫亞種三種疾病，而且只需一針免疫，減少了豬只的應(yīng)激，降低了成本，達(dá)到“一針多防”的效果，且不存在散毒的隱患。本發(fā)明的滅活
疫苗安全可靠。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種豬鏈球菌三價(jià)滅活疫苗的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案申請(qǐng)人:制備了一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，該滅活疫苗含有保藏號(hào)為CCTCCNO M2011405的馬鏈球菌獸疫亞種XS的抗原，保藏號(hào)為CCTCC NO M2011282的豬鏈球菌2-LT的抗原和保藏號(hào)為CCTCC NO M2011160的豬鏈球菌7-YZ的抗原及佐劑；所述的抗原已滅活；所述佐劑為白油。上述三種菌株的抗原在所述的滅活疫苗中的配比比例相等(I I I)，所述的三種菌株的抗原的總體積占所述疫苗總體積的40% 45%。申請(qǐng)人:提供了一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制備方法，其步驟包括如下內(nèi)容a.將豬鏈球菌2-LT (保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011282)、豬鏈球菌7-YZ (保藏號(hào)為CCTCCNO M2011160)和馬鏈球菌獸疫亞種XS (保藏號(hào)為CCTCC NO M2011405)分別在TSB培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)(該培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司)，分別得到豬鏈球菌2-LT菌液，豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液。b.分別向步驟a培養(yǎng)好的豬鏈球菌2-LT株菌液、豬鏈球菌7_YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液，按總量(體積比)加入O. 3% O. 4%的甲醛溶液，置于37°C滅活48 72小時(shí)，期間每隔3 4小時(shí)攪拌I次，收集得到各滅活菌液。 C.將步驟b收集得到的滅活的豬鏈球菌2-LT菌液、豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液按體積比I : I : I混合，得到混合滅活菌液，再將吐溫-80與上述制備 的混合滅活菌液按體積比4 6 94 96，優(yōu)選為4 96，制成水相。將白油(購(gòu)自?？松梨诠?、司本-80和硬脂酸鋁按體積比為94 6 I 2，優(yōu)選為94 6 I的比例制成油相。將水相與油相按40% 45% 55% 60%體積比混合，優(yōu)選為40% 60%。將水相緩慢加入油相均質(zhì)3 5分鐘后，制成均勻乳劑，即為油乳劑滅活疫苗。本發(fā)明的三價(jià)油乳劑滅活疫苗的保存條件為2 8°C。d、將步驟c得到的油乳劑滅活疫苗進(jìn)行分裝即為產(chǎn)品。上述抗原菌株的分離鑒定方法如下所述I.豬鏈球菌2型菌株LT株(豬鏈球菌2-LT)的分離、篩選和鑒定申請(qǐng)人:從2004年9月湖北省羅田縣某豬場(chǎng)送檢的有神經(jīng)癥狀、急性死亡豬的心血中分離得到一株具有致病性的豬鏈球菌2型菌株(編號(hào)LT株)。經(jīng)鑒定后將該菌株命名為豬鏈球菌2-LT (Streptococcus suis 2-LT),于2011年8月9日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2011282(具體分離及鑒定方法見實(shí)施例I)。2.豬鏈球菌7-YZ的分離、篩選和鑒定申請(qǐng)人:于2005年8月從湖南省永州市某豬場(chǎng)送檢的病料中分離得到一株豬鏈球菌7型菌株(編號(hào)為YZ株)，經(jīng)鑒定后將該菌株命名為豬鏈球菌7-YZ (Streptococcus suis7-YZ)。該菌株于2011年5月5日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2011160(具體分離及鑒定方法見實(shí)施例2)。3.馬鏈球菌獸疫亞種XS株的分離、篩選和鑒定申請(qǐng)人:從浙江省蕭山某豬場(chǎng)患病豬關(guān)節(jié)中分離得到一株馬鏈球菌獸疫亞種(編號(hào)為XS株)，經(jīng)鑒定后將該菌株命名為馬鏈球菌獸疫亞種XS(Str印tococcus equi subsp.zooepidimicusXS)。該菌株于2011年11月22日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2011405(具體分離及鑒定見實(shí)施例3)。上述三個(gè)抗原菌株的微生物學(xué)特征豬鏈球菌2型，豬鏈球菌7型和馬鏈球菌獸疫亞種菌株均為鏈球菌屬，其中豬鏈球菌2型和豬鏈球菌7型細(xì)菌大小為0. lmm-1. 0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊，革蘭氏染色呈陽性、成雙或短鏈狀。馬鏈球菌獸疫亞種菌種大小約為0. 5 1cm，陳舊培養(yǎng)物中菌體呈卵圓形，固體培養(yǎng)基中該菌以單個(gè)或短鏈形式存在，液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)物形成長(zhǎng)鏈，菌體表面能形成莢膜。本發(fā)明的豬鏈球菌三價(jià)滅活疫苗主要應(yīng)用于豬場(chǎng)中種豬和仔豬對(duì)豬鏈球菌病的預(yù)防，降低豬場(chǎng)豬鏈球菌病的發(fā)病率，提高仔豬存活率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)預(yù)防豬鏈球菌2型，豬鏈球菌7型和馬鏈球菌獸疫亞種引起的疾病，對(duì)于同血清型的免疫保護(hù)效果達(dá)到85%以上，相對(duì)于目前的商品疫苗來講，可以單針免疫較多的血清型，達(dá)到“一針防多病”的目的，且使用方便，減少了豬只應(yīng)激，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO : I是擴(kuò)增⑶H基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 2是擴(kuò)增CPS2J基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 3是擴(kuò)增CPS7J基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 4是擴(kuò)增SodA基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 5是擴(kuò)增類M蛋白基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 6是擴(kuò)增Fnz基因的核苷酸序列。圖I :一種豬鏈球菌通用引物擴(kuò)增的PCR示意圖。圖中M DNA分子Marker ; I 4 :豬鏈球菌分離菌株和豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)菌株；5 :豬鏈球菌LT分離株。圖2 :—種豬鏈球菌2型引物擴(kuò)增的PCR示意圖。圖中I :豬鏈球菌2-LT分離株；2 =DNA分子Marker3 5 :豬鏈球菌分離株；6 陰性對(duì)照(H20。圖3 : —種豬鏈球菌通用引物擴(kuò)增的PCR示意圖。圖中I 4 :挑取的待鑒定的豬鏈球菌；5 :豬鏈球菌7型標(biāo)準(zhǔn)菌株，6 :豬鏈球菌YZ分離株。圖4:豬鏈球菌7型引物擴(kuò)增的PCR示意圖。圖中I :豬鏈球菌7-YZ ;2 4 :挑取的待鑒定的豬鏈球菌5 陰性對(duì)照。圖5 :馬鏈球菌獸疫亞種乳膠凝集示意圖。圖中1，2和4 6分別為A，B，D，F(xiàn)，G群標(biāo)準(zhǔn)乳膠，3為C群標(biāo)準(zhǔn)乳膠。圖6 :馬鏈球菌獸疫亞種引物擴(kuò)展的PCR示意圖。圖中M =DNA分子marker ;1_3 :待鑒定的馬鏈球菌獸疫亞種菌株；4 :分離的馬鏈球菌獸疫亞種XS株
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的實(shí)施例。結(jié)合實(shí)施對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述和論證。但是本實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :豬鏈球菌2-LT株的分離和鑒定。待分離的病料——各組織病料是申請(qǐng)人的發(fā)明人于2004年9月分離于湖北羅田某豬場(chǎng)有神經(jīng)癥狀、急性死亡豬的心血中分離得到。其具體分離方法為無菌采集心血接種于TSA (購(gòu)自美國(guó)BD公司)平皿上，370C培養(yǎng)12-24小時(shí)后觀察。挑取直徑為O. lmm-1. Omm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)過夜。將純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。然后用光學(xué)顯微鏡觀察，革蘭氏染色呈陽性、成雙或短鏈狀球菌，對(duì)其傳代純化。豬鏈球菌2型的分類鑒定，采用PCR方法、生化鑒定及玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行了鑒定，具體步驟如下(I)PCR方法鑒定根據(jù)參考文獻(xiàn)(趙戰(zhàn)勤，2007年)合成豬鏈球菌通用引物和豬鏈球菌2型特異性引物。其中豬鏈球菌通用引物JP4和JP5是根據(jù)谷氨酸鹽脫氫酶基因(gdh，基因登錄號(hào)gblEF539838. Il)設(shè)計(jì)上游引物為JP4(5’ -CCATGGACAGATAAAGATGG-3’ )； 下游引物為JP5 (5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3，)，可擴(kuò)增長(zhǎng)度為 689bp 的目的 DNA片段(見SEQ ID NO: I)(其PCR圖片見附圖I)。豬鏈球菌2型的特異性引物是根據(jù)豬鏈球菌具有型特異性的莢膜多糖抗原基因cps2J (基因登錄號(hào)JN024705. I)設(shè)計(jì)上游引物為 Cps2J-F (5，-TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG-3，)，下游引物為cps2J-R(5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’)，可擴(kuò)增長(zhǎng)度為 557bp 目的DNA片段(見SEQ ID NO 2)(其PCR圖片見附圖2)。PCR模板的制備取Iml培養(yǎng)的菌液到無菌的1.5ml離心管中，12000r/min離心5分鐘，去掉上清,用200 μ I無菌水懸浮混勻，100°C水浴中煮10分鐘，然后迅速置于冰上冷卻5分鐘，12000r/min離心2分鐘，上清即為PCR模板。PCR反應(yīng)體系(總體積25 μ I)IOXTaq Buffer2. 5 μ 1,2 μ M dNTPs I. 5 μ 1，20 μ M 上、下游引物各 I μ 1，TaqDNA聚合酶I μ I，無菌水14 μ I,模板4 μ I。退火溫度為94°C30 秒，58°C 60 秒，72°C 40 秒，30 循環(huán)。PCR結(jié)果觀察取PCR 擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物 10 μ I 和 Mark2000plus 5 μ 1，加到含 EB 的 O. 8% (V/V)瓊脂糖膠中，在80伏電壓下電泳30分鐘，然后在紫外線燈下觀察。(2)生化鑒定從TSA平板上挑取步驟(I)中鑒定為陽性的單菌落，進(jìn)行常規(guī)的生化鑒定試驗(yàn)。微量生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，按照該公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。結(jié)果豬鏈球菌2-LT株的各項(xiàng)生化指標(biāo)均符合(見表I)。(3)玻片凝集試驗(yàn)將分離的豬鏈球菌2-LT株接種TSB培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)BD公司)，置37°C搖床170rpm/min，培養(yǎng)8小時(shí)，使0D600達(dá)到I. 3 I. 5，采用玻片凝集的方法對(duì)該菌液進(jìn)行血清學(xué)分型鑒定。具體操作方法如下取潔凈玻片I張，用微量移液器吸取3 μ I豬鏈球菌(SS)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(購(gòu)自丹麥哥本哈根國(guó)立血清研究所)滴于載玻片上，另吸取3μ I生理鹽水做對(duì)照，然后吸取3μ I菌液分別加入血清和生理鹽水中，充分混勻(注每次加樣都要更換移液器的TIP頭)。輕輕搖動(dòng)載玻片，I 2min后觀察結(jié)果。血清與待檢菌液混合后出現(xiàn)明顯可見的凝集塊，液體變?yōu)橥该?，而鹽水對(duì)照滴仍為均勻混濁狀態(tài)，即判定為凝集反應(yīng)陽性。若血清與菌液混合后為均勻混濁狀態(tài)，沒有出現(xiàn)明顯可見的凝集塊判定為陰性。玻片凝集試驗(yàn)表明，本發(fā)明分離的豬鏈球菌2-LT株僅與豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生凝集反應(yīng)，不與其他血清型凝集。表I豬鏈球菌2型生化鑒定試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，其特征在于，該滅活疫苗含有保藏號(hào)為CCTCC NO:M2011405的馬鏈球菌獸疫亞種XS的抗原，保藏號(hào)為CCTCC NO M2011282的豬鏈球菌2-LT的抗原和保藏號(hào)為CCTCC NO M2011160的豬鏈球菌7-YZ的抗原及佐劑；所述的抗原已滅活；所述佐劑為白油。
2.如權(quán)利要求I所述的豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗，其特征在于，所述的三種抗原的體積比為I : I : 1，所述的抗原的總體積為所述滅活疫苗總體積的40% 45%。
3.一種豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，它包括如下步驟 a.將保藏號(hào)為CCTCCNO :M2011282的豬鏈球菌2-LT菌株，保藏號(hào)為CCTCC NO:M2011160豬鏈球菌7-YZ菌株和保藏號(hào)為CCTCC NO M2011405的馬鏈球菌獸疫亞種XS菌株分別增殖培養(yǎng)，得到豬鏈球菌2-LT菌液，豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液； b.分別向上述培養(yǎng)好的豬鏈球菌2-LT菌液，豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS株菌液中按菌液總體積加入O. 3% O. 4%的甲醛溶液，置于37°C滅活48 72小時(shí)，期間每隔4小時(shí)攪拌I次，即為滅活的菌液； c.將上述收集的滅活的豬鏈球菌2-LT菌液，豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液按體積為I : I : I的比例混合，再將吐溫-80與上述混合菌液按體積比為4 6 94 96混合，制成水相；將白油、司本-80和硬脂酸鋁按體積比為94 6 I 2的比例制成油相；將所述的水相與油相按體積比為I : I. 5的比例混合，將水相緩慢加入油相均質(zhì)3 5分鐘后，制成均勻乳劑，即為滅活疫苗； d.將步驟c得到的滅活疫苗分裝得產(chǎn)品。
4.一種專用于生產(chǎn)權(quán)利要求I所述的豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的菌株，其特征在于該菌株分別是豬鏈球菌2-LT，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCCNO M2011282 ;豬鏈球菌7-YZ，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO:Μ2011160和馬鏈球菌獸疫亞種-XS，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCC NO Μ2011405ο
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬鏈球菌獸疫亞種、豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型的三價(jià)滅活疫苗及制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的滅活疫苗主要適用于母豬，公豬及仔豬對(duì)豬鏈球菌病的防治。本發(fā)明公開了三株專用于制備豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗的菌株的分離、鑒定及應(yīng)用，三株疫苗菌株分別為豬鏈球菌2-LT株(保藏號(hào)為CCTCC NOM2011282)；豬鏈球菌7-YZ株(保藏號(hào)為CCTCC NOM2011160)和馬鏈球菌獸疫亞種XS株(保藏號(hào)為CCTCC NOM2011405)。本發(fā)明的滅活疫苗能夠達(dá)到“一針多防”的效果，減少豬只應(yīng)激，且滅活疫苗安全可靠，不存在散毒的隱患。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102949714SQ201110376199
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者金梅林, 康超, 陳波, 尹珍艷, 徐高原, 陳關(guān)平, 滑亞峰, 陳章表 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司