專利名稱：一種增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及愛德華氏菌疫苗免疫防治技術(shù)，具體是一種可以增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
愛德華氏菌(Edwardsiella sp.)，是當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要病原菌之一，目前包含遲緩愛德華氏菌(E. tarda)、鮰魚愛德華氏菌(E.1ctaluri)和?？茞鄣氯A氏菌(E.hoshinae)三個種，其宿主范圍十分廣泛，魚類、兩棲類、爬行類、鳥類以及包括人類的哺乳類都有感染報道，且呈世界性分布，普遍存在于淡水和海水環(huán)境中，主要分布在中國、澳大 利亞、日本、印度、以色列、馬來群島、美國、巴拿馬等熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)。從1962年首次報道至今，該病原對多種魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。采用抗生素和化學(xué)藥物等方法進(jìn)行預(yù)防或治療，往往帶來諸如病原的耐藥性、藥物殘留以及水環(huán)境的污染等弊端，也引起了食品安全及環(huán)境污染等相關(guān)問題。當(dāng)前在水生動物疾病防控方面，以疫苗免疫技術(shù)為基礎(chǔ)的綜合防控技術(shù)體系是被國際上普遍認(rèn)可、接受并積極推廣的病害控制技術(shù)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)處對愛德華氏菌疫苗有了較為廣泛的研究，并取得了一系列的研究成果。其中傳統(tǒng)疫苗(包括滅活疫苗、細(xì)胞提取物、佐劑疫苗)因具有制作簡單，成本低、安全性高等優(yōu)點(diǎn)成為各種疫苗形式的首選，但研究表明，愛德華氏菌與其他病原菌不同，常規(guī)滅活疫苗所產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果不盡理想。Gutierrez和Miyazaki (1994)研究中福爾馬林滅活的愛德華氏菌注射免疫日本鰻的相對保護(hù)率(RPS)僅為12. 5—25% ;Sun等(2011)報道用愛德華氏菌的單價滅活疫苗免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus)的RPS只有33. 3% ;我們前期實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)技術(shù)制作的E. tarda滅活疫苗的相對保護(hù)率(RPS)也不到40%。近期,Hossain和Kawai (2009)和Hossain等(2011)報道了米用高壓滅活(600psi,5min)的方式制備的愛德華氏菌滅活疫苗具有較好的免疫效果，腹腔注射日本鰻(Anguillajaponica)后，其RPS在80% — 85%范圍內(nèi)。但高壓的方法存在技術(shù)局限性，例如設(shè)備代價非常高，技術(shù)難度大，難以對大批量細(xì)菌進(jìn)行生產(chǎn)性的操作。近年來，隨著生物工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，愛德華氏菌新型疫苗不斷涌現(xiàn)，并在水生動物實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的應(yīng)用前景，例如DNA疫苗(Jiao等(2009)、亞單位疫苗(Liu等(2005)，Jiao等(2009)、菌蛻疫苗(Kwon等(2007)、減毒活疫苗(Mo等，2007 ；Xiao等，2011)等也有較多報道，，但出于應(yīng)用安全性、研制周期及成本等因素考慮，這些新型疫苗仍然得不到商品化的應(yīng)用。總體來說，愛德華氏菌疫苗的免疫效果不盡理想，近年來，人們已開始重視佐劑在其免疫技術(shù)中的應(yīng)用，并取得了一定的成果。佐劑是非特異性免疫增強(qiáng)劑，與抗原混合使用可以增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。Castro等(2008)研究結(jié)果用滅活愛德華氏菌疫苗與商業(yè)佐劑MontanideISA 763 AVG (Seppic, France)聯(lián)合使用，I次注射接種免疫大菱鲆，其RPS在6個月后仍然超過90%，而此時單一注射免疫滅活組的RPS只有20% ;上述的Sun等(2011)的報道中，當(dāng)滅活的愛德華氏菌與鰻弧菌(Vibrio anguillarum)等另三種菌聯(lián)合使用時,其RPS可達(dá)到70. 9%，該結(jié)果中鰻弧菌等其他三種菌滅活疫苗起到了愛德華氏菌滅活疫苗免疫佐劑的作用。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中疫苗佐劑種類較少，且應(yīng)用效果各有差異，其中應(yīng)用于愛德華氏菌疫苗的佐劑報道甚少，因此開發(fā)其新型高效佐劑對于該病原的免疫防控具有重要意義。￠-1, 3-葡聚糖是一種多糖，主要來源于包括谷物、酵母、部分真菌和海藻中。研究證實(shí)葡聚糖自身具有特殊的分子結(jié)構(gòu)使其易被免疫系統(tǒng)識別及接受，可有效激活巨噬細(xì)胞、嗜中性白血球等，刺激釋放細(xì)胞因子及特異性抗體的生成，并誘導(dǎo)機(jī)體的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高機(jī)體的免疫功能。3 -葡聚糖還具有清除游離基、抗輻射、抗腫瘤、溶解膽固醇，預(yù)防高脂血癥作用，對濾過性病毒、真菌、細(xì)菌等引起的感染也具有一定的抵抗作用，目前在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)已有著較廣泛應(yīng)用。葡聚糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用主要是作為非特異性免疫增強(qiáng)劑使用，例如常見添加到蝦飼料中用于提高對蝦的非特異性抗病力，也有作為魚類飼料添加劑用以非特異性地提高魚的抗病力，葡聚糖的添加具有增強(qiáng)水生動物對病原的抵抗力，促進(jìn)生長，并可提高動物的生產(chǎn)性能及飼料利用率，但目前沒有將葡聚糖作為愛德華氏菌疫苗的佐劑的研究報道、專利或應(yīng)用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑及其應(yīng)用方法，以提高愛德華氏菌疫苗抗原接種后的免疫效果。本發(fā)明所述的一種增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑，為從谷物、酵母、真菌或海藻中獲得的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品；以及及具有增強(qiáng)免疫接種效果的，對上述的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品進(jìn)行人工改造、合成的產(chǎn)物。上述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品的該制品的￠-1, 3-葡聚糖，或具有增強(qiáng)疫苗接種效果的3 -1, 3-葡聚糖的人工改造、合成產(chǎn)物。本發(fā)明的增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑的使用方法，包括如下三種方式I)與疫苗抗原混合制成疫苗制劑使用；2)制成不包含疫苗抗原的佐劑制劑，在免疫接種前與疫苗抗原混合后同時使用；3)與疫苗抗原不同時使用。對于第I種方式，加入到包含疫苗抗原的針劑、浸浴劑或口服劑中，上述佐劑有效成分與疫苗抗原重量比為1/10—1000/1，其免疫接種途徑可以為注射免疫、創(chuàng)傷免疫、浸浴免疫、口服免疫或其他將佐劑有效成分和疫苗抗原導(dǎo)入到水生動物體內(nèi)的任何免疫接種途徑。對于第2種方式，含有上述佐劑有效成分的制劑在疫苗抗原對水生動物進(jìn)行免疫接種前臨時添加到含有疫苗抗原的制劑中并充分混勻，添加量為疫苗抗原重量的1/10—1000/1，其免疫接種方式可以為注射、創(chuàng)傷、浸浴或口服免疫。對于第3種方式，加入到水生動物飼料或浸浴水體中的上述佐劑的有效成分與飼料或浸浴水體重量比為1/100000—1/100，添加時間為疫苗制劑對待免疫水生動物進(jìn)行注射、創(chuàng)傷、浸浴或口服免疫接種前3日至接種后30日以內(nèi)，實(shí)施I一5日的投喂或浸浴等免疫增強(qiáng)操作。以上免疫應(yīng)用方式使佐劑有效成分P -1, 3-葡聚糖在愛德華氏菌疫苗抗原與水生動物免疫系統(tǒng)作用時達(dá)到一定的濃度，從而讓免疫細(xì)胞在遞呈、加工、識別疫苗抗原的過程中受到葡聚糖的刺激，使免疫細(xì)胞的活性得以進(jìn)一步提高，從而更好地活化免疫系統(tǒng)對疫苗抗原的應(yīng)答，有效增強(qiáng)疫苗抗原的免疫效果。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)佐劑有效成分的劑量對疫苗免疫效果有重要影響，在佐劑安全濃度范圍以內(nèi)，兩者具有一定的相關(guān)性。當(dāng)佐劑有效成分的使用劑量超過安全劑量范圍時，會對水生動物有致死作用，因此有必要針對待免疫水生動物種類及具體的免疫方式條件下進(jìn)行佐劑的給藥方式測試或查明給藥后2— 4周內(nèi)不會導(dǎo)致水生動物死亡的最高劑量，以此確定上述佐劑有效成分在水生動物中使用時的安全劑量。本發(fā)明證實(shí)上述佐劑的有效成分在水生動物體內(nèi)的劑量達(dá)到安全劑量的1/100 — 4/5時可增強(qiáng)疫苗的免疫效果。本發(fā)明的愛德華氏菌疫苗佐劑可應(yīng)用于魚類、兩棲類和爬行類的疫苗免疫接種，包括海水養(yǎng)殖魚類(如牙鲆、大菱鲆、半滑舌鰨、石斑魚、鱸魚、真鯛、軍曹魚、大西洋鮭、河飩等)、半咸水養(yǎng)殖魚類(如羅非魚、虹鱒、鯔魚等)、洄游魚類(如鰻鱺、小黃魚等)、淡水養(yǎng)殖魚類(如青魚、鰱魚、鳙魚、鯉魚、鯽魚、鯰魚、鱖魚、鱘魚、澳洲寶石鱸等)、觀賞魚(如金魚、錦鯉等)、兩棲類(如牛蛙、大鯢等)和爬行類(如鱉、龜、蛇等)的疫苗接種。不同的水生動物的安 全劑量和有效劑量不同，對于特定水生動物的具體應(yīng)用劑量，應(yīng)該進(jìn)行單獨(dú)測試。本發(fā)明的積極效果在于所涉及佐劑可以提高愛德華氏菌疫苗抗原免疫接種后的特異性和非特異性免疫保護(hù)力。對于愛德華氏菌這種胞內(nèi)感染或具有免疫逃避能力的病原的疫苗，本發(fā)明佐劑可有效的增強(qiáng)免疫保護(hù)作用，使用方法安全，對操作人員和環(huán)境無害，因而具有良好的應(yīng)用前景和市場推廣價值。
具體實(shí)施例方式鑒于佐劑有效成分的劑量對疫苗抗原免疫效果有著重要影響，佐劑有效成分的使用劑量過低往往達(dá)不到增強(qiáng)免疫的效果，而過高的使用劑量往往會對水生動物產(chǎn)生不利或致死作用。因此上述佐劑在使用中應(yīng)首先針對具體的水生動物種類、年齡和接種方法等通過疫苗保護(hù)實(shí)驗(yàn)確定上述佐劑有效成分在具體疫苗產(chǎn)品中的安全劑量范圍及最佳使用濃度。在愛德華氏菌疫苗制劑中佐劑有效成分的濃度為lmg/g — 20mg/g(佐劑有效成分重量/疫苗制劑重量)，水生動物飼料中佐劑有效成分的濃度為0. lg/kg — 5g/kg(佐劑有效成分重量/飼料重量)，在給藥后水生動物體內(nèi)佐劑有效成分的濃度達(dá)到1. OX 10_3mg/g — 5. Omg/g(佐劑有效成分重量/水生動物體重)。愛德華氏菌疫苗制劑中的抗原成分可以源自于遲緩愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌或?？茞鄣氯A氏菌等愛德華氏菌屬的細(xì)菌的一種或一種以上的的病原的抗原或能在水生動物體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的抗原，也可以是包含源自愛德華氏菌的抗原和其他病原菌或病毒的抗原制成的聯(lián)合疫苗制劑。疫苗抗原的類型可以為滅活菌體、菌蛻成分、弱毒株、減毒株、保護(hù)性抗原、抗原亞單位、抗原決定簇或抗原基因的表達(dá)載體的任何一種或一種以上，上述抗原在疫苗制劑中可是單一種或一種以上以聯(lián)合、整合或多價方式存在，制成的愛德華氏菌疫苗制劑除了抗原或能產(chǎn)生抗原的表達(dá)載體以外，還可包含其它的佐劑、保護(hù)劑、防腐劑、稀釋齊U、溶劑等多種成分。本發(fā)明佐劑在應(yīng)用中可以與疫苗抗原混合使用，也可以制成單一制劑與疫苗抗原混合后同時使用，還可以與疫苗抗原不同時使用。應(yīng)用中的免疫接種方式可以為注射免疫、創(chuàng)傷免疫、浸泡免疫或口服免疫。
本發(fā)明證明酵母提取物中的￠-1, 3-葡聚糖能有效起到愛德華氏菌疫苗佐劑的作用，應(yīng)用中與愛德華氏菌滅活疫苗協(xié)同使用時，能顯著提高愛德華氏菌滅活疫苗的免疫保護(hù)率。所述的￠-1, 3-葡聚糖是從谷物、酵母、真菌或海藻中提取的，本發(fā)明證實(shí)了^ -1, 3-葡聚糖具有增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的功效，因此本發(fā)明的有效成分的功效包含3-1，3-葡聚糖的天然產(chǎn)物、人工改造產(chǎn)物或人工合成產(chǎn)物。天然的3-1，3-葡聚糖可提取自谷物、酵母、部分真菌和海藻等，對于不改變3 -1, 3-葡聚糖核心分子結(jié)構(gòu)的人工改造產(chǎn)物或人工合成及仿制的產(chǎn)物可能增強(qiáng)或減弱本發(fā)明所涉及的功效，只要這種功效依然保留，就仍屬于本專利的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的使用方法如下(I)佐劑安全劑量的確定制備包含P -葡聚糖的0. 1%—10%的PBS (pH7. 2)溶 液，經(jīng)0. 22 y m的濾膜過濾除菌，再用不同濃度的上述佐劑接種待免疫水生動物，接種方式可以是注射免疫、創(chuàng)傷免疫、浸泡免疫或口服免疫。免疫水生動物觀察2周，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定該佐劑安全劑量。(2)愛德華氏菌疫苗制劑制備及使用滅活疫苗制備中，向愛德華氏菌懸液中加入甲醛(36. 5—38%, w/v)，調(diào)節(jié)其終濃度為0. 3%—l%，4°C過夜，用PBS (pH7. 2)清洗3次后，制備一定濃度的滅活疫苗。將安全劑量范圍內(nèi)的佐劑與滅活疫苗按一定的比例混合后對待免疫水生動物進(jìn)行免疫接種，再將水生動物進(jìn)行正常養(yǎng)殖管理即可。使用減毒活疫苗時，則無需進(jìn)行滅活處理。(3)疫苗產(chǎn)品中佐劑最佳劑量的確定疫苗制劑的使用方法可以有以下三種方式1)與疫苗抗原混合制成疫苗制劑使用；或者2)制成單一制劑與疫苗抗原混合后同時使用；或者3)與疫苗抗原不同時使用。對于第I種方式，加入到包含愛德華氏菌疫苗抗原的針劑、浸浴劑或口服劑中上述佐劑有效成分與疫苗抗原重量比為1/10—1000/1，其免疫接種方式可以為注射、創(chuàng)傷、浸浴或口服免疫。對于第2種方式，上述佐劑有效成分在愛德華氏菌疫苗制劑對水生動物進(jìn)行免疫接種前臨時添加并充分混勻，添加量為疫苗抗原重量的1/10—1000/1，其免疫接種方式可以為注射、創(chuàng)傷、浸浴或口服免疫。對于第3種方式，加入到水生動物飼料或浸浴水體中的上述佐劑的有效成分與飼料或浸浴水體重量比為1/100000—1/100，添加時間為愛德華氏菌疫苗制劑對待免疫水生動物進(jìn)行注射、創(chuàng)傷、浸浴或口服免疫接種前3日至接種后15日以內(nèi)，實(shí)施I一5日的投喂或浸浴等免疫增強(qiáng)操作。待免疫水生動物經(jīng)上述疫苗制劑接種后，30— 60天后進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，通過14—60天后的相關(guān)生理生化指標(biāo)(如增重率、抗體效價等)及相對保護(hù)率(RPS)等免疫指標(biāo)的分析，以確定佐劑的最佳使用劑量。實(shí)施例1:0-1，3-葡聚糖對大菱鲆(Scophthatmus maximus)注射安全劑量的確
定選用健康大菱鲆(11. 4±1. 8) g，試驗(yàn)前在水泥池中暫養(yǎng)2周后，置于圓形玻璃鋼桶(盛水0. 7米3)中，流水養(yǎng)殖，水溫為18±2°C，鹽度28%?！?%。，24小時連續(xù)充氣。試驗(yàn)期間按魚體重3%投喂配合飼料，日投喂3次，每日換水并清污2次。注射前對大菱鲆用MS222(I 9000 )進(jìn)行浸泡麻醉處理。分別用濃度為2、5、8、10和20 mg/mL的P _1，3-葡聚糖腹腔注射20尾大菱鲆，注射劑量為100 u L/尾，觀察14天。各實(shí)驗(yàn)組大菱鲆14天中死亡情況見表1，由結(jié)果確定P -1, 3-葡聚糖對大菱鲆的最大安全腹腔注射劑量為1000 u g/尾，即87. 7 u g/g (葡聚糖/魚體重)。表1. 0 -1, 3-葡聚糖對大菱鲆注射安全劑量試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑，其特征是上述佐劑為從谷物、酵母、真菌或海藻中獲得的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品；以及及具有增強(qiáng)免疫接種效果的，對上述的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品進(jìn)行人工改造、合成的產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑，其特征在于所述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品的有效成分為β -1,3-葡聚糖。
3.如權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑，其特征在于所述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品為β -1, 3-葡聚糖，或具有增強(qiáng)疫苗接種效果的β -1, 3-葡聚糖的人工改造、合成產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑的應(yīng)用，是與愛德華氏菌疫苗抗原聯(lián)用免疫接種水生動物。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述佐劑聯(lián)用免疫接種的疫苗抗原包含源自于遲緩愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌或保科愛德華氏菌等愛德華氏菌屬的細(xì)菌的一種或一種以上的疫苗抗原；疫苗抗原類型包括滅活菌體、菌蛻成分、弱毒菌株、減毒菌株、保護(hù)性抗原、抗原亞單位、抗原決定簇或抗原基因表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物的任何一種或一種以上。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述佐劑與疫苗抗原聯(lián)用免疫接種水生動物的應(yīng)用包含以下三種方式上述佐劑與疫苗抗原混合制成疫苗制劑使用，或者制成不含疫苗抗原的佐劑制劑但與疫苗抗原同時使用，或者與疫苗抗原不同時使用。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述佐劑的三種應(yīng)用方式是 (1)與疫苗抗原混合制成疫苗制劑使用時，加入到包含愛德華氏菌疫苗抗原的針劑、浸浴劑或口服劑中上述佐劑的有效成分與疫苗抗原重量比為1/10—1000/1 ； (2)制成不含疫苗抗原的佐劑制劑但與疫苗抗原同時使用時，上述佐劑的有效成分在疫苗制劑對水生動物進(jìn)行免疫接種前臨時添加并充分混勻，添加量為疫苗抗原重量的1/10—1000/1 ； (3)與疫苗抗原不同時使用時，加入到水生動物飼料或浸浴水體中的上述佐劑的有效成分按飼料或浸浴水體重量的1/100000—1/100進(jìn)行添加，添加時間為疫苗制劑對待免疫水生動物進(jìn)行免疫接種前3日至接種后30日以內(nèi)，可以給藥I次或多次。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述水生動物進(jìn)行免疫接種時，可以采用注射免疫、創(chuàng)傷免疫、浸浴免疫、口服免疫或其他將佐劑有效成分和疫苗抗原導(dǎo)入到水生動物體內(nèi)的任何免疫接種途徑。
9.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述佐劑在應(yīng)用前，針對上述佐劑的不同應(yīng)用方式，查明在免疫條件下給藥后14日內(nèi)有效成分對水生動物體的安全劑量范圍，確定上述佐劑的實(shí)際用量，使給藥后有效成分在水生動物體內(nèi)的含量為上述安全劑量的1/100—4/5。
10.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述佐劑及共同應(yīng)用的疫苗免疫接種的水生動物對象包括海水養(yǎng)殖魚類、半咸水養(yǎng)殖魚類、洄游魚類、淡水養(yǎng)殖魚類、觀賞魚類和淡水養(yǎng)殖的兩棲類和爬行類。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)愛德華氏菌疫苗免疫接種效果的佐劑及其應(yīng)用方法。其特征是上述的佐劑提取自谷物、酵母、部分真菌或海藻等原料，其有效成分為包含β-1，3-葡聚糖和β-1，3-葡聚糖的天然、人工改造或人工合成產(chǎn)物。該佐劑的應(yīng)用可增強(qiáng)愛德華氏菌的滅活菌體、菌蛻成分、弱毒菌株、減毒菌株、保護(hù)性抗原、抗原亞單位、抗原決定簇或抗原基因表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物的任何一種或一種以上的愛德華氏菌疫苗抗原接種后的特異性免疫保護(hù)率；應(yīng)用中可以與疫苗抗原混合使用，也可以制成單一制劑但與疫苗抗原同時使用，還可以與疫苗抗原不同時使用。
文檔編號A61P37/02GK102988981SQ201210539588
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者黃倢, 謝國駟, 隋虎辰, 王秀華, 邊慧慧, 史成銀, 劉莉 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所