專利名稱：用于傷口愈合的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的制作方法
用于傷口愈合的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移本申請是分案申請，原申請的申請日為1997年4月11日，申請?zhí)枮?971953 . 0(PCT/US97/07301)，發(fā)明名稱為“用于傷口愈合的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移”。1.介紹本發(fā)明涉及將編碼感興趣治療蛋白的DNA提呈和直接轉(zhuǎn)移到哺乳動物修復(fù)細(xì)胞中的新型體內(nèi)方法。該方法涉及將含有感興趣DNA的基質(zhì)(本文稱為“基因活化基質(zhì)”)植入新鮮的傷口部位。正常起源于傷口周圍活組織的修復(fù)細(xì)胞增殖并遷移到該基因活化基質(zhì)中，在其中它們遇到該DNA，將其吸收并進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)染的修復(fù)細(xì)胞因此用作原位生物反應(yīng)器(定位于該傷口部位中)，產(chǎn)生使該傷口愈合的藥物(DNA編碼的RNA、蛋白等等)。本發(fā)明還涉及可以用于實(shí)施本發(fā)明以轉(zhuǎn)移該感興趣DNA的藥用組合物。這類組合物包括與該感興趣DNA聯(lián)用的合適的基質(zhì)。2.
背景技術(shù)：
2. 1 傷口愈合目前可利用的傷口愈合療法涉及給與治療蛋白。這類治療蛋白可以包括參與正常愈合過程的調(diào)節(jié)因子，諸如系統(tǒng)性激素、細(xì)胞因子、生長因子和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的其它蛋白。報(bào)道具有這種傷口愈合能力的生長因子、細(xì)胞因子和激素包括例如蛋白轉(zhuǎn)化生長因子-β 超家族(TGF-β) (Cox，D.A.，1995，Cell Biology International，19 :357-371)、 酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF) (Slavin, J.，1995，Cell Biology International, 19 431-444)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和諸如甲狀旁腺激素(PTH)之類的鈣調(diào)節(jié)劑。許多問題與在傷口愈合療法中使用治療蛋白(即細(xì)胞因子)有關(guān)。首先，治療蛋白的純化和/或重組生產(chǎn)常常是一個(gè)昂貴耗時(shí)的過程。盡管進(jìn)行了最大的努力，但是純化的蛋白制劑常常不穩(wěn)定，使得貯存和使用麻煩，蛋白的不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致意外的對該宿主有毒的炎癥性反應(yīng)(對于蛋白分解產(chǎn)物)。第二，治療蛋白(即細(xì)胞因子)的系統(tǒng)性傳遞可能與未受傷組織的嚴(yán)重的不良副作用有關(guān)。由于傳遞到機(jī)體特定細(xì)胞和組織的效率低，需要給與高劑量的蛋白，以確保足夠量的該蛋白到達(dá)合適的組織靶。由于蛋白水解降解，所述蛋白在機(jī)體內(nèi)的半衰期短，所述蛋白也必須重復(fù)給與，這可能導(dǎo)致對所述治療蛋白的免疫反應(yīng)。由于給與的蛋白的多效性，高劑量的治療蛋白的循環(huán)常常是有毒的，并且可能產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。第三，重組蛋白的外源傳遞的效率低。已經(jīng)試圖通過治療蛋白的固定化將高劑量的蛋白的給與限制在靶部位。然而，該治療方法對于重復(fù)給藥而言使該蛋白的再給與復(fù)雜化。第四，對于諸如膜受體、轉(zhuǎn)錄因子和胞內(nèi)結(jié)合蛋白之類的各種蛋白而言，生物學(xué)活性取決于正確地表達(dá)和在該細(xì)胞中的定位。對于許多蛋白而言，當(dāng)所述蛋白在所述細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行翻譯后修飾時(shí)，發(fā)生正確的細(xì)胞定位。因此，這類蛋白不能以這一方式外源給與來進(jìn)行吸收和正確地在該細(xì)胞內(nèi)定位。正如這些問題所證明的，目前用于傷口愈合的重組蛋白療法是有缺點(diǎn)的，因?yàn)樗鼈儾荒芴峁┮粋€(gè)合理的方法用于傳遞外源蛋白。這些蛋白(即細(xì)胞因子)通常是以生理量在其作用位點(diǎn)產(chǎn)生的，并且有效地傳遞到細(xì)胞表面的信號受體。2. 2基因治療基因治療最初設(shè)想為將功能活性的治療基因傳遞到靶細(xì)胞中用于更正遺傳缺陷的特異性基因置換療法。最初對體細(xì)胞基因治療的努力曾依賴于將基因?qū)虢M織的間接方法，稱為離體基因治療，例如從機(jī)體取出靶細(xì)胞，用攜帶重組基因的載體轉(zhuǎn)染或感染，然后再植入機(jī)體中(自體細(xì)胞轉(zhuǎn)移)。目前可利用各種各樣的轉(zhuǎn)染技術(shù)，將DNA體外轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中；包括磷酸鈣-DNA沉淀法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移或用重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。已經(jīng)提出將DNA轉(zhuǎn)移到各種不同細(xì)胞類型的這類離體治療方案，所述細(xì)胞包括上皮細(xì)胞(美國專利4，868，116 ；Morgan和Mullligan的W087/00201 ； Morgan 等，1987，Science 237 :1476-1479 ；Morgan 和 Mulligan，美國專利 4，980，沘6 號)、 內(nèi)皮細(xì)胞(W089/05345)、肝細(xì)胞(W089/07136 ；Wolff 等，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :3344-3348 ；Ledley 等，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5335-5339 ；Wilson 和 Mulligan, W089/07136 ；Wilson 等，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :8437-8441)、成纖維細(xì)胞(Palmer 等，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84 :1055-1059 ；Anson 等，1987，Mol. Biol. Med. 4 :11-20 ；Rosenberg 等，1988，kience 242 :1575-1578 ；Naughton 禾口 Maughton， 美國專利4，963，489)、淋巴細(xì)胞(Anderson等，美國專利5，399，346號；Blaese，R. Μ.等， 1995，Science 270 :475-480)和造血干細(xì)胞(Lim, B.等，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :8892-8896 ；Anderson 等，美國專利 5，399，346 號)。最近已經(jīng)試圖用脂質(zhì)體中捕獲的(Ledley等，1987，J. PediatricsllO 1)、或在含有病毒包膜受體蛋白的蛋白脂質(zhì)體中(Nicolau等，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 80 1068)捕獲的DNA制劑以及用偶聯(lián)到聚賴氨酸-糖蛋白載體復(fù)合物的DNA進(jìn)行體內(nèi)的直接基因轉(zhuǎn)移。另外，“基因槍”已經(jīng)用來將基因傳遞到細(xì)胞中(澳大利亞專利9068389號)。甚至已經(jīng)推測可以在液體載體溶液中配制裸露的DNA或結(jié)合脂質(zhì)體的DNA，以用于注射到胞間隙將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中(Feigner，W090/11092)。與目前設(shè)計(jì)的無論是離體還是體內(nèi)的基因治療有關(guān)的一個(gè)最大的問題，也許是不能有效地將DNA轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞群體中，以達(dá)到該基因產(chǎn)物在體內(nèi)的高水平表達(dá)。病毒載體被認(rèn)為是最有效的系統(tǒng)，已經(jīng)用重組復(fù)制缺陷型病毒載體離體和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)(即感染)細(xì)胞。 這類載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒以及皰疹病毒載體。盡管病毒載體高度有效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，但與其使用有關(guān)的主要缺點(diǎn)包括許多病毒載體不能感染非分裂細(xì)胞； 與插入誘變有關(guān)的問題；對該病毒的炎癥性反應(yīng)和潛在的輔助病毒的產(chǎn)生，和/或有害病毒的產(chǎn)生和傳播給其它人類患者。除了大多數(shù)細(xì)胞類型吸收和表達(dá)外源DNA的效率低外，還發(fā)現(xiàn)許多靶細(xì)胞群體在機(jī)體中的數(shù)目是如此的低，使得將DNA提呈給特定靶細(xì)胞類型的效率甚至進(jìn)一步減小。目前，沒有將DNA導(dǎo)向靶細(xì)胞群體的效率提高的方案或方法。3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及將DNA特異性地導(dǎo)向和轉(zhuǎn)移到參與傷口愈合的哺乳動物修復(fù)細(xì)胞中以在該傷口部位表達(dá)治療產(chǎn)物的新方法。本發(fā)明的方法包括將基因活化基質(zhì)給與到機(jī)體的新鮮傷口部位。在這種設(shè)定中，修復(fù)細(xì)胞定位到該傷口部位，在此它們受轉(zhuǎn)染，最后產(chǎn)生DNA 編碼的促進(jìn)傷口愈合的藥物(RNA、蛋白等等)。
本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)在傷口愈合過程中有活性的修復(fù)細(xì)胞增殖并從周圍組織遷移到該傷口區(qū)域，然后浸潤該基因活化基質(zhì)。該基質(zhì)作為一個(gè)支架，促進(jìn)細(xì)胞向內(nèi)生長，進(jìn)而通過該DNA附近局部累積修復(fù)細(xì)胞而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)移。在該基質(zhì)中，修復(fù)細(xì)胞令人驚訝地有效吸收該DNA，并將其表達(dá)為翻譯產(chǎn)物(即蛋白)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即反義產(chǎn)物和核酶)。 然后，所述轉(zhuǎn)染的修復(fù)細(xì)胞作為局部的生物反應(yīng)器，在體內(nèi)放大該基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。盡管在本方法中可以使用任何數(shù)目的DNA序列，但優(yōu)選的DNA序列是編碼翻譯產(chǎn)物(即蛋白)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即反義產(chǎn)物或核酶)的DNA序列，所述產(chǎn)物(a)促進(jìn)組織修復(fù)； 或(b)能夠破壞疾病過程(由此允許正常組織發(fā)生愈合)。本發(fā)明克服了目前用于涉及給與治療蛋白的傷口愈合方法的缺點(diǎn)。首先，既穩(wěn)定又無毒的DNA可以安全地以高劑量體內(nèi)給與。第二，重復(fù)的給藥盡管是可能的，但它是不需要的。吸收和表達(dá)該DNA的細(xì)胞在該傷口部位提供基因產(chǎn)物的供應(yīng)源。第三，本發(fā)明可以以滿足短暫給藥要求的方式實(shí)施。例如，該DNA可以存在于整合到所述靶細(xì)胞基因組中的載體中。這樣，所有的子細(xì)胞都將含有并表達(dá)所述轉(zhuǎn)染的DNA，由此作為連續(xù)的該治療藥物源起作用。相反，可以利用非整合系統(tǒng)，其中該DNA不整合到該基因組中，該基因不傳遞給子細(xì)胞。在這樣一種情況下，當(dāng)傷口愈合過程完成而不再需要該基因產(chǎn)物時(shí)，將不表達(dá)該基因產(chǎn)物。通過實(shí)施例證明本發(fā)明，所述實(shí)施例表明基因可以在多種受傷軟組織和硬組織中可重現(xiàn)地體內(nèi)轉(zhuǎn)染和表達(dá)。具體地說，表明本發(fā)明的方法克服了目前可利用的基因治療方法相關(guān)的問題。本發(fā)明方法提供將基因轉(zhuǎn)移到適量的修復(fù)細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)功能作用，即在無任何醫(yī)師進(jìn)一步的尋靶或細(xì)胞鑒定的情況下實(shí)現(xiàn)?；蛑委煹捏w內(nèi)方法需要不常起作用的某種形式的尋靶。在本發(fā)明方法中，尋靶不是問題。照此類推，該DNA非常象“誘捕器”中的“誘餌”:已經(jīng)增殖的無意的修復(fù)細(xì)胞遇到該DNA，然后遷移到該基因活化基質(zhì)中。這些細(xì)胞再意外地能夠吸收DNA，并將其表達(dá)為治療劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法用作藥物傳遞系統(tǒng)，通過將DNA轉(zhuǎn)移到哺乳動物修復(fù)細(xì)胞中，以刺激軟組織和硬組織的修復(fù)和組織再生。所述修復(fù)細(xì)胞是正常到達(dá)待治療傷口區(qū)域的那些細(xì)胞。因此，沒有與獲得合適的本發(fā)明治療組合物所應(yīng)該應(yīng)用于的靶細(xì)胞相關(guān)的困難。所需的即是將基因活化基質(zhì)植入該傷口部位。該生物學(xué)環(huán)境的性質(zhì)使得合適的修復(fù)細(xì)胞在醫(yī)師沒有進(jìn)一步尋靶或細(xì)胞鑒定的情況下，主動地吸收和表達(dá)該 “誘餌” DNA。在另一實(shí)施方案中，采用生物學(xué)基質(zhì)和合成基質(zhì)的本發(fā)明方法可以用來將DNA轉(zhuǎn)移到哺乳動物的修復(fù)細(xì)胞中，以刺激骨骼再生。在再一實(shí)施方案中，采用生物學(xué)基質(zhì)和合成基質(zhì)的本發(fā)明方法可以用來將DNA轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞中，以刺激韌帶和腱的修復(fù)。采用生物學(xué)基質(zhì)和合成基質(zhì)的本發(fā)明方法還可以用來將DNA轉(zhuǎn)移到哺乳動物修復(fù)細(xì)胞中，以刺激骨骼肌的修復(fù)和/或血管的修復(fù)。用于實(shí)施本發(fā)明的DNA可以包括編碼促進(jìn)組織修復(fù)或能夠破壞疾病過程的翻譯產(chǎn)物(即蛋白)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即反義產(chǎn)物或核酶)的任何DNA。例如，該DNA可以包括編碼諸如生長因子、細(xì)胞因子、激素等等之類的治療上有用的蛋白的基因。另外，該DNA可以編碼反義分子或核酶分子，這些分子可以抑制編碼抑制傷口愈合或誘導(dǎo)炎癥的蛋白的mRNA 的翻譯。
編碼感興趣治療產(chǎn)物的DNA與基質(zhì)結(jié)合或浸入基質(zhì)，以形成基因活化基質(zhì)。一旦制備了該基因活化基質(zhì)，則將其置于該哺乳動物的傷口部位。通過實(shí)施例證明本發(fā)明，在所述實(shí)施例中證明基因有效地在體內(nèi)轉(zhuǎn)移到正在修復(fù)和再生的組織中并進(jìn)行表達(dá)。3. 1 定義本文所用的以下術(shù)語具有下面指出的含義?；蚧罨|(zhì)(GAM)本文定義為含有編碼感興趣治療劑的DNA的任何基質(zhì)材料。 例如，將基因活化基質(zhì)置于哺乳動物宿主機(jī)體的傷口部位，以增強(qiáng)傷口愈合。修復(fù)細(xì)胞本文定義為對組織損傷作出反應(yīng)而被刺激進(jìn)行遷移和增殖的任何細(xì)胞。 修復(fù)細(xì)胞是傷口愈合反應(yīng)的一個(gè)組分。這類細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管外膜細(xì)胞、單核炎癥細(xì)胞、分葉核炎癥細(xì)胞和肉芽組織細(xì)胞。傷口部位定義為該宿主中由創(chuàng)傷性組織損傷產(chǎn)生的或者由外科手術(shù)或者誘導(dǎo)或者引起的組織損害產(chǎn)生的任何位置。4.附圖描述

圖1A.纖維性骨不連合的股骨切骨術(shù)模型。在成年不再作為種鼠的(retired)雄性Sprague-Dawley大鼠的股骨手術(shù)進(jìn)行5mm的切骨術(shù)。這里所示的裂縫代表整個(gè)對照組的特征，哺乳動物宿主或者接受單獨(dú)的切骨術(shù)(n = 3)、切骨術(shù)加上膠原海綿(n = 10)或和切骨術(shù)加上含有對照(標(biāo)記基因)質(zhì)粒DNA的膠原海綿(n = 23)。普通的X光片顯示剛剛手術(shù)后的對照大鼠的股骨。所述裂縫用由一塊板和四個(gè)釘構(gòu)成的外部固定器固定。所述皮膚切口用金屬小夾閉合。圖1Β.普通X光片，顯示手術(shù)后9周的對照大鼠股骨切骨術(shù)。圓形的手術(shù)邊緣(箭頭)是由反應(yīng)性骨形成產(chǎn)生的，并與骨不連合性骨折的典型放射照片外觀一致。圖1C.手術(shù)后3周的裂縫組織的組織學(xué)切片，顯示正在增殖的修復(fù)成纖維細(xì)胞和包埋在水腫的胞外基質(zhì)中的毛細(xì)血管。也存在由淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成的病灶性炎性浸潤。圖1D.來自9周對照裂縫的組織學(xué)切片，顯示致密的纖維性組織。Icm = 20 μ m(C 和D)。圖2.編碼小鼠BMP-4的pGAMl構(gòu)建物(construct)的示意圖。顯示CMV啟動子、 BMP-4編碼序列、HA表位和牛生長激素多腺苷酸化信號的位置。圖3A.修復(fù)成纖維細(xì)胞的BMP-4的表達(dá)。在植入含有pGAMl質(zhì)粒DNA的基因活化基質(zhì)后4周，利用抗HA抗體和免疫過氧化物酶法在經(jīng)Bouins固定、脫礦質(zhì)、石蠟包埋的組織切片中檢測到質(zhì)粒編碼的BMP-4的表達(dá)。箭頭指示成纖維細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)(左上角的顯微照片)的陽性(紅褐色)染色的例子。這些細(xì)胞基于紡錘形形態(tài)、成束生長和I型前膠原免疫染色陽性(未顯示)被鑒定為成纖維細(xì)胞。與兔免疫前血清或不與第一抗體一起溫育的連續(xù)切片為陰性。用與抗HA. 11抗體溫育的假手術(shù)對照(單獨(dú)的膠原海綿)也獲得了陰性結(jié)果(右上角的顯微照片)。在與該HA. 11抗體溫育的對照切片中一致觀察到巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的假陽性染色。左下角的顯微照片中顯示了 PGAMl轉(zhuǎn)移后3周新形成的骨島。新骨與肉芽組織的形成有關(guān)。在右下角的顯微照片中顯示新形成骨的高倍視圖。箭頭指示新的骨小梁表面上推定的成骨細(xì)胞。用蘇木精和曙紅(上部顯微照片)或用Gomori三色法(Gomori trichrome mothod)將裂縫組織染色(富含膠原蛋白的組織出現(xiàn)綠色，下部顯微照片)。Icm = 20mm(上部顯微照片)。圖3B.該動物的平片放射照片(手術(shù)后23周)。在平片放射照片(左圖)中，箭頭指示該切骨術(shù)裂縫的大致位置，該裂縫充滿放射性密集的組織。請注意，已經(jīng)除去了外部固定器。案如雜色圖示所表明的，發(fā)生骨質(zhì)重建。箭頭指出鄰近該裂縫處的骨中缺損(放置釘?shù)慕Y(jié)果)。這時(shí)兩個(gè)遠(yuǎn)側(cè)釘子部位完全愈合(未顯示)。全封固照片(右圖)顯示來自所示動物裂縫的Gomori三色染色的組織切片(處死后)。箭頭指出該裂縫，它由于充分整合的骨皮質(zhì)而成為平面。骨髓間隙(或該裂縫間隙)中的圓形缺損由放置最內(nèi)側(cè)的固定器的釘子而產(chǎn)生。顯微照片底部的組織破裂是樣品處理的人工產(chǎn)物。圖4A.編碼人PTH1-34的pGAM2構(gòu)建物的示意圖。顯示驅(qū)動PTHl-M表達(dá)的上游長末端重復(fù)(箭頭)、ΡΤΗ1-34編碼序列、驅(qū)動neo表達(dá)的SV40啟動子(箭頭)、ne0編碼序列、pBR序列和下游長末端重復(fù)的位置。圖4B. PTH1-34的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)驅(qū)動體內(nèi)的新骨形成。平片放射照片顯示在接受含有pGAM2質(zhì)粒DNA的基因活化基質(zhì)的動物中植入后9周時(shí)5mm的切骨術(shù)裂縫的新骨橋連(bridging)。箭頭指出該裂縫中的放射性密集的組織。這里所示的結(jié)果代表用另一只動物試驗(yàn)的特征。圖5.通過雙質(zhì)粒GAM的體內(nèi)新骨形成。(頂部)平片放射照片顯示在接受含有 PGAMl加上pGAM2質(zhì)粒DNA的基因活化基質(zhì)的動物中植入后4周時(shí)5mm裂縫的新骨橋連。 箭頭指出該裂縫中的放射性密集的組織(組織學(xué)上證明為骨)。(底部)除去該外部固定器后(5周前；總共為手術(shù)后17周)，頂部照片中所示裂縫的平片放射照片。箭頭指出該裂縫的位置，該裂縫除在近側(cè)手術(shù)邊緣附近有一條礦質(zhì)化不足的組織外，其中充滿放射性密集的組織。正如雜色圖案所示，發(fā)生廣泛的重建反應(yīng)。這里所示結(jié)果代表用另一只動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的特征。圖6.腺病毒介導(dǎo)的體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)移到骨修復(fù)和再生細(xì)胞中。將UltraFiber 植入物在AdCMVlacZ病毒溶液(IOici-IO11空斑形成單位或PFU/ml)浸泡6分鐘，然后植入該切骨術(shù)部位。讓該缺損愈合3周，在此期間通過每周的放射照片檢查監(jiān)測該傷口的愈合反應(yīng)進(jìn)程。到3周為止，估計(jì)該缺損的40%充滿骨痂組織。處死該哺乳動物宿主，將組織在Bouins 固定液(fixation)中固定，然后采用標(biāo)準(zhǔn)甲酸溶液脫礦質(zhì)7天。拍攝手術(shù)后3周時(shí)在該切骨術(shù)部位中形成的新骨(骨痂)橫切面的顯微照片。左上圖請注意來自UltraFiber 腺病毒植入物的骨痂組織細(xì)胞的陽性(紅色)β -gal細(xì)胞質(zhì)染色。該結(jié)果表明骨折愈合過程中骨痂細(xì)胞(至少一個(gè)群體)表達(dá)介導(dǎo)感染并由此介導(dǎo)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表面受體。左上圖用β-gal抗體載體加上非特異性兔LgG抗體混合劑(cocktail)染色的連續(xù)切片的陰性對照。下圖注意到在充滿UltraFiber 和AdRSVntlacZ的切骨術(shù)部位中軟骨細(xì)胞的陽性(紅色)β-gal核染色。該結(jié)果證明該抗β-gal抗體靈敏的特異性，并確實(shí)證明該切骨術(shù)裂縫中該標(biāo)記基因產(chǎn)物的表達(dá)。圖7. pGAM2質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)移到修復(fù)成纖維細(xì)胞導(dǎo)致該大鼠切骨術(shù)模型中的新骨生長。平片放射照片顯示接受含有PGAMl加上pGAM2質(zhì)粒DNA的基因活化基質(zhì)的動物中植入后6周時(shí)5mm裂縫的新骨橋連。箭頭指出該裂縫中放射性密集組織(組織學(xué)證明為骨)。5.發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及將DNA提呈和轉(zhuǎn)移到哺乳動物修復(fù)細(xì)胞中以表達(dá)治療劑的體內(nèi)方法。 本發(fā)明方法涉及將基因活化基質(zhì)植入或置于新鮮的傷口部位。傷口愈合通常是協(xié)調(diào)固定不變的事件順序，包括(a)組織破壞和正常組織結(jié)構(gòu)的喪失；(b)細(xì)胞壞死和出血；止血(形成血塊)；(c)分葉核炎癥細(xì)胞和單核炎癥細(xì)胞的浸潤，同時(shí)血管充血和組織水腫；(d)單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)溶解該血塊以及損傷細(xì)胞和組織 (e)形成肉芽組織(纖維組織形成和血管生成)。已經(jīng)在大量哺乳動物種中產(chǎn)生的所有組織和器官的傷口中觀察到這種細(xì)胞事件的順序(feiilet等，1994，Curr. Opin. Cell. Biol. 6 717-725)。因此，上述細(xì)胞順序是所有哺乳動物組織修復(fù)的普遍方面。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)參與傷口愈合過程的修復(fù)細(xì)胞通常增殖并遷移到組織損傷部位，并浸潤該基因活化基質(zhì)。令人驚訝的是，通常難以有效地體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染的這些修復(fù)細(xì)胞被該傷口愈合過程激活增殖時(shí)，極其有效地吸收和表達(dá)DNA。利用該特征，設(shè)計(jì)本發(fā)明方法以有效地將一種或多種編碼治療劑的DNA分子轉(zhuǎn)移到正在增殖的修復(fù)細(xì)胞中。所述方法涉及在哺乳動物宿主的傷口部位給與含有編碼翻譯產(chǎn)物(即治療蛋白)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即反義產(chǎn)物或核酶)的基因活化基質(zhì)。該傷口可以由創(chuàng)傷性組織損傷產(chǎn)生，或者由外科手術(shù)誘導(dǎo)或引起的組織損傷產(chǎn)生。當(dāng)增殖中的修復(fù)細(xì)胞遷移到基因活化基質(zhì)中并與其接觸時(shí)，它們吸收并表達(dá)感興趣DNA，由此放大該治療劑(蛋白質(zhì)或RNA)的量。所述轉(zhuǎn)染的修復(fù)細(xì)胞因此作為局部的生物反應(yīng)器起作用，產(chǎn)生影響該局部修復(fù)環(huán)境的治療劑。例如所述轉(zhuǎn)染修復(fù)細(xì)胞產(chǎn)生的生長因子或細(xì)胞因子將結(jié)合并刺激表達(dá)同源細(xì)胞表面受體的靶效應(yīng)細(xì)胞，由此刺激和放大與傷口愈合過程正常相關(guān)的生理事件級聯(lián)。另一方面，所述修復(fù)細(xì)胞可以吸收并表達(dá)抑制傷口愈合過程拮抗劑活性的蛋白質(zhì)的編碼DNA。該DNA也可以編碼反義或核酶RNA分子，這些分子可以用來抑制編碼炎癥蛋白或抑制傷口愈合或引起過度纖維化的其它因子的mRNA的翻譯?？梢圆捎酶鞣N各樣的技術(shù)，將本發(fā)明的基因活化基質(zhì)轉(zhuǎn)移給所述患者。例如，當(dāng)刺激傷口愈合和再生時(shí)，可以將所述基質(zhì)直接轉(zhuǎn)移到該傷口部位，即骨折的骨、損傷的結(jié)締組織等等。對于皮膚修復(fù)方面的使用，將于皮膚表面給與所述基質(zhì)。對于器官再生方面的使用，將所述基質(zhì)手術(shù)置于該器官的傷口中。由于本發(fā)明方法基于修復(fù)細(xì)胞正常遷移到傷口部位并進(jìn)行增殖，以及浸潤到位于該傷口部位的基因活化基質(zhì)中，然后吸收DNA，因此應(yīng)該理解，所述基質(zhì)必須轉(zhuǎn)移到機(jī)體已經(jīng)誘導(dǎo)上述愈合過程的部位中。本發(fā)明的一個(gè)特別重要的特征在于，可以工程改造該修復(fù)過程，以導(dǎo)致或者形成瘢痕組織和/或者組織再生。例如，所述治療蛋白在該傷口部位的過量表達(dá)可以導(dǎo)致?lián)p傷組織再生，而不形成瘢痕組織。在諸如骨修復(fù)的許多情況下，需要這種再生，因?yàn)轳：劢M織不能理想地用來支持正常的機(jī)械功能。另一方面，可能希望在縫線周圍形成疤痕組織，以將固有的弱組織保持在一起。因此，本發(fā)明方法可以用來刺激傷口愈合，或者形成瘢痕組織， 或者不形成瘢痕組織，這取決于所表達(dá)的治療蛋白的類型和水平。將質(zhì)粒DNA直接從基質(zhì)轉(zhuǎn)移到哺乳動物修復(fù)細(xì)胞中通過促進(jìn)刺激傷口愈合過程， 具有多種優(yōu)點(diǎn)。首先，與昂貴的常規(guī)蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法的相比，有利的是DNA構(gòu)建物的產(chǎn)生和純化容易。第二，基質(zhì)可以用作其中或其本身促進(jìn)細(xì)胞向內(nèi)生長并增殖的結(jié)構(gòu)支架。因此，它們促進(jìn)基因轉(zhuǎn)移靶向修復(fù)細(xì)胞。第三，直接基因轉(zhuǎn)移可能是藥物傳遞的一個(gè)良好方法，用以傳遞正常進(jìn)行復(fù)雜的生物合成加工的分子或必須正確定位于細(xì)胞膜中的受體。這些類型的分子如果外源傳遞到細(xì)胞，則不能起作用。本發(fā)明也涉及藥用組合物，它包含含有用于傷口愈合的DNA的基質(zhì)。本發(fā)明的組合物一般由生物相容的、或骨相容的基質(zhì)材料組成，所述材料含有編碼感興趣治療蛋白的 DNA。本發(fā)明克服了與目前用于傷口愈合應(yīng)用的重組蛋白治療具體相關(guān)的缺點(diǎn)。首先， 直接基因轉(zhuǎn)移是一個(gè)合理的策略，它允許轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(a)制造生理量的、以組織特異性和順序特異性(context-specific)方式修飾的治療蛋白，以及(b)在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下將該蛋白傳遞到合適的細(xì)胞表面信號受體。由于上述原因，預(yù)期這類分子的外源傳遞與顯著的給藥和傳遞問題有關(guān)。第二，重復(fù)的給藥盡管是可能的，但用基因活化基質(zhì)技術(shù)并不需要重復(fù)給藥可以用很好建立的緩釋傳遞技術(shù)精細(xì)地控制細(xì)胞攝取DNA，或者轉(zhuǎn)染DNA的整合可能與長期的重組蛋白表達(dá)有關(guān)。本發(fā)明方法可以普遍適用于涉及許多不同的細(xì)胞、組織和器官的傷口 ；肉芽組織的修復(fù)細(xì)胞(feiilet等，1994，Curr. Opin. Cell. Biol. 6 :717-725)是使用本發(fā)明方法的靶。 本文在3種動物模型(狗、大鼠和兔)和5種組織(骨、腱、韌帶、血管和骨骼肌)中，應(yīng)用三種標(biāo)記基因(β-半乳糖苷酶、熒光素酶和堿性磷酸酶)、三種啟動子系統(tǒng)(CMV、RSV、LTR和 SV40)、兩種類型的基質(zhì)(生物學(xué)的和合成的)證明了本發(fā)明。在所有情況下，遷移到該基因活化基質(zhì)中的修復(fù)細(xì)胞都被成功地轉(zhuǎn)染。詳細(xì)地說，在將或者編碼BMP-4的質(zhì)粒構(gòu)建物、或者編碼PTH1-34的質(zhì)粒構(gòu)建物基因轉(zhuǎn)移到修復(fù)成纖維細(xì)胞后，功能性結(jié)果(骨生長)已得到證實(shí)，其中BMP-4作為成骨細(xì)胞分化和生長的信號傳導(dǎo)開關(guān)起作用(WoZney，1992，Mol. Reprod. Dev. 32 :160-167 ；Reddi,1994, Curr.Opin.Genet. Deve. 4 :737-744)， M PTH1-34 募集(recruit)骨原細(xì)胞(Orloff 等，1992，Endocrinology 131 :1603-1611 ；Dempster 等 1995，Endocrin. Rev. 4 :247-250)。51所述基因活化基質(zhì)可以按照本發(fā)明配制和使用任何生物相容性的、含有編碼感興趣治療劑的DNA的基質(zhì)材料，所述感興趣治療劑諸如翻譯產(chǎn)物(即治療蛋白)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即反義分子或核酶)。本發(fā)明的基因活化基質(zhì)可以得自任何生物相容材料。這類材料可以包括(但不限于)生物可降解性或非生物可降解性材料，所述材料配制成支持細(xì)胞附著和生長的支架、 粉末或凝膠?；|(zhì)可以得自合成聚合物或天然存在的蛋白，諸如膠原、其它胞外基質(zhì)蛋白或其它結(jié)構(gòu)大分子。加入該基質(zhì)中的DNA可以編碼各種治療劑中的任何一種，這取決于設(shè)計(jì)的治療用途。這類蛋白可以包括生長因子、細(xì)胞因子、激素或能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化或生理功能的任何其它蛋白。所述DNA也可以編碼反義分子和核酶分子，所述分子抑制抑制傷口修復(fù)和 /或誘導(dǎo)炎癥的蛋白的翻譯。所述轉(zhuǎn)染DNA不需要整合到靶細(xì)胞中，實(shí)際上，在該基因活化基質(zhì)中使用非整合性DNA是本發(fā)明的最佳實(shí)施方案。這樣，當(dāng)傷口愈合過程完成，不再需要該基因產(chǎn)物時(shí)，將不表達(dá)該基因產(chǎn)物。
含有生物相容性基質(zhì)和DNA的治療藥盒為本發(fā)明另一方面。在某些情況下，所述藥盒含有預(yù)形成的基因活化基質(zhì)，由此允許醫(yī)師直接在機(jī)體內(nèi)給與該基質(zhì)?；蛘?，所述藥盒可以含有形成基因活化基質(zhì)所必需的組分。在這種情況下，在醫(yī)師可以混合所述組分以形成該基因活化基質(zhì)，然后該基因活化基質(zhì)可以通過置于機(jī)體內(nèi)而用于治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)可以用來包被外科裝置，諸如縫合材料或植入物。在本發(fā)明的再一實(shí)施方案中，基因活化基質(zhì)可以包括現(xiàn)成可用的海綿、管、急救繃帶、凍干組分、凝膠、貼劑或粉末和telfa pad。5. 1. 1所沭基質(zhì)材料在本發(fā)明的一個(gè)方面，制備這樣的組合物，其中編碼該感興趣治療劑的DNA與基質(zhì)結(jié)合或浸漬到基質(zhì)中，以形成基因活化基質(zhì)。所述基質(zhì)組合物的功能是(i)促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞的向內(nèi)生長(尋靶)；和(ii)含有DNA(傳遞)。一旦制備該基因活化基質(zhì)，則將其貯存以備將來使用，或立即置于該傷口部位?？梢杂糜诒景l(fā)明的組合物、裝置和方法中的基質(zhì)的類型事實(shí)上是無限制的，可以包括生物學(xué)基質(zhì)和合成基質(zhì)。該基質(zhì)具有通常與“生物相容”有關(guān)的所有特征，因?yàn)楫?dāng)將其給與哺乳動物宿主時(shí)，它不產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)、過敏反應(yīng)或其它不良反應(yīng)。這種基質(zhì)可以由天然材料或合成材料制成。在希望在機(jī)體內(nèi)留下持久結(jié)構(gòu)的情況下，所述基質(zhì)可以為非生物降解性的；或當(dāng)僅需要短期表達(dá)該治療蛋白時(shí)，所述基質(zhì)可以為生物降解性的。所述基質(zhì)采用海綿、植入物、管、telfa pad、急救繃帶、繃帶、墊、凍干組分、凝膠、貼劑、粉末或納米粒子 (nanoparticle)形式。另外，基質(zhì)可以設(shè)計(jì)為允許在較長時(shí)間內(nèi)緩釋該DNA。根據(jù)具體情況和待治療傷口的部位，基質(zhì)材料的選擇會不同。可以使用諸如美國專利5，270，300(通過引用結(jié)合到本文中)中描述的那些基質(zhì)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，在基質(zhì)的選擇上，可以考慮物理和化學(xué)特性，諸如生物相容性、生物降解性、強(qiáng)度、 剛度、界面性質(zhì)和甚至美觀。合適的基質(zhì)既傳遞該DNA分子，也作為哺乳動物修復(fù)細(xì)胞可以遷移通過的原位支架。當(dāng)所述基質(zhì)將保持較長時(shí)間時(shí)，可以使用非生物降解性基質(zhì)，諸如燒結(jié)羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽、其它生物陶瓷材料和金屬材料，特別是鈦。合適的陶瓷傳遞系統(tǒng)是美國專利4，596，574中描述的，該專利通過引用結(jié)合到本文中。所述生物陶瓷可以在組成上改變，諸如為鈣-鋁酸鹽-磷酸鹽；可以將它們加工以改變特定的物理和化學(xué)特性，諸如孔徑大小、顆粒大小、顆粒形狀和生物降解性。也可以使用聚合基質(zhì)，包括如美國專利 4，521，909和4，563，489中分別描述的丙烯酸酯聚合物和乳酸聚合物，這些專利通過引用結(jié)合到本文中。有用聚合物的詳細(xì)例子是原酸酯、酸酐、丙烯-延胡索酸酯共聚物的那些聚合物，或一種或多種Y-羥基羧酸單體的聚合物，這些單體例如為Y-羥基金酸(乙醇酸) 和/或Y-羥丙酸(乳酸)。本發(fā)明的一個(gè)特別重要的方面是它與矯形外科植入物和界面和人造關(guān)節(jié)結(jié)合的應(yīng)用，所述植入物和界面和人造關(guān)節(jié)包括植入物本身和植入物的功能部件，諸如外科螺釘、 釘子等等。在最佳實(shí)施方案中，設(shè)想將所述金屬表面或植入物或其一部分的表面(諸如鈦表面)涂上對核酸具有親和力的材料，最優(yōu)選涂上羥基磷灰石，然后對所述涂布的金屬進(jìn)一步涂上希望轉(zhuǎn)移的基因或核酸。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以容易地對諸如羥基磷灰石之類的該吸收性材料的可用化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行操作，以控制它對核酸的親和力。
在最佳實(shí)施方案中，設(shè)想生物降解性基質(zhì)可能是最有用的。生物降解性基質(zhì)一般定義為能夠重吸收入機(jī)體的基質(zhì)。與本發(fā)明的組合物、裝置和方法結(jié)合使用的潛在的生物降解性基質(zhì)包括例如生物降解性和化學(xué)上確定的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥基磷灰石、聚乳酸、 聚酐、純化蛋白基質(zhì)和半純化胞外基質(zhì)組合物。其它可以使用的生物相容的生物降解性聚合物是本領(lǐng)域眾所周知的，包括例如(但不限于)聚酯，諸如聚乙交酯、聚丙交酯和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(polylactic polyglycolic acid copolymer, ) ( “PLGA，，)(Langer 禾口 Folkman，1976，Nature 263 797-800)；聚醚，諸如聚己內(nèi)酰胺(“PCL”)；聚酐；聚氰基丙烯酸烷基酯，諸如氰基丙烯酸正丁酯和氰基丙烯酸異丙酯；聚丙烯酰胺 ’聚(原酸酯)；聚磷腈；多肽；聚氨酯；和這類聚合物的混合物。應(yīng)該理解，事實(shí)上現(xiàn)在已知的或后來開發(fā)的適用于緩釋或控釋核酸的任何聚合物都可以用于本發(fā)明。在最佳實(shí)施方案中，所述生物相容性生物降解性聚合物是乙醇酸和乳酸的共聚物(“PLGA”)，其乳酸/乙醇酸單位的比例為大約100/0至大約25/75。用市售的標(biāo)準(zhǔn)分子量的聚苯乙烯通過凝膠滲透色譜測定的該聚合物的平均分子量(“麗”)通常為大約 6，000-700, 000，最好為大約 30，000-120, 000，其特性粘度為 0. 5-10. 5。從按照本發(fā)明的基質(zhì)連續(xù)緩釋或控釋核酸的時(shí)間長短主要取決于該聚合物的MW 和乳酸/乙醇酸的組成比率。一般而言，較高的乳酸/乙醇酸之比，諸如75/25，提供較長時(shí)間的所述核酸緩釋或控釋，而較低的乳酸/乙醇酸之比，提供所述核酸較快速的釋放。所述乳酸/乙醇酸之比最好是50/50。緩釋或控釋的時(shí)間長短也取決于所述聚合物的MW。一般而言，較高M(jìn)W的聚合物提供較長時(shí)間的控釋或緩釋。例如，在制備提供控釋或緩釋大約3個(gè)月的基質(zhì)的情況下，當(dāng)乳酸/乙醇酸的組成比為100/0時(shí)，聚合物優(yōu)選的平均分子量為大約7，000-25, 000 ；當(dāng)乳酸/ 乙醇酸組成比為90/10時(shí)，聚合物優(yōu)選的平均分子量大約為6，000-30，000 ；當(dāng)乳酸/乙醇酸的組成比為80/20時(shí)，聚合物優(yōu)選的平均分子量為大約12，000-30，000?？梢允褂玫牧硪环N類型的生物材料為小腸粘膜下層(SIQ。該SIS移植材料可以由成年豬的一段空腸制備?？梢圆捎弥T如Badybak等1989，J. Surg. Res. 47 :74-80中描述的常規(guī)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行組織樣品的分離。通過除去腸系膜、翻轉(zhuǎn)該腸段，然后通過機(jī)械摩擦技術(shù)除去粘膜和淺表粘膜下層，可以制備SIS材料。在翻回該腸段原來的方位后，沖洗漿膜層和肌肉層，貯存以備進(jìn)一步的使用。另一個(gè)合適材料的具體例子為纖維性膠原，它可以在從組織提取及部分純化后凍干，然后滅菌。也可以由腱或皮膚膠原制備基質(zhì)，同樣可以由諸如Sigma和Collagen Corporation之類的各種各樣的商業(yè)來源獲得。也可以按美國專利4，394，370和4，975，527 中所述制備膠原基質(zhì)，這些專利通過引用結(jié)合到本文中。另外，諸如Yarmas和Burke (美國專利4，505，266)中描述的由膠原和糖胺聚糖 (GAG)制成的網(wǎng)格(lattice)可以用于本發(fā)明的實(shí)施中。該膠原/GAG基質(zhì)可以有效地用作修復(fù)細(xì)胞可以遷移其中的支持物或“支架”結(jié)構(gòu)。諸如Bell的美國專利4，485，097中描述的膠原基質(zhì)也可以用作基質(zhì)材料。所述各種膠原材料也可以是礦化膠原形式。例如，如可以得自Norian Corp.(1025Terra Bella Ave. ,Mountain View,CA,94043)的稱為 UltraFiber 的纖維性膠原植入材料可以用來形成基質(zhì)。美國專利5，231，169(通過引用結(jié)合到本文中)描述了通過在中度攪拌下、在有分散的膠原纖維存在下原位形成磷酸鈣礦質(zhì)來制備礦化膠原。這種制劑可以在將核酸區(qū)段傳遞到骨組織部位方面使用。例如礦化膠原可以用作用于骨折修復(fù)的基因活化基質(zhì)治療藥盒的組成部分。已經(jīng)鑒定出至少20種不同形式的膠原，這些膠原中的每一種都可以用于本發(fā)明的實(shí)施中。例如，可以由透明軟骨純化膠原，同樣可以從動關(guān)節(jié)或生長面分離膠原。從透明軟骨純化的II型膠原是市售的，可以購自例如Sigma Chemical Company，Μ. Louis。得自大鼠尾部腱的I型膠原可以購自例如Collagen Corporation.也可以使用任何形式的重組膠原，重組膠原同樣可以得自表達(dá)膠原的重組宿主細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、哺乳動物和昆蟲細(xì)胞。當(dāng)使用膠原作為基質(zhì)材料時(shí)，可能最好除去位于該膠原分子末端、已知誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的、稱為“端肽”的部分。用于本發(fā)明的膠原如果需要，可以補(bǔ)充其它礦物質(zhì)，諸如磷酸鈣形式的鈣。天然和重組形式的膠原都可以通過與其它礦質(zhì)以該方式混合、吸收或者結(jié)合進(jìn)行補(bǔ)充。512 所沭 DNA本方法和組合物可以使用各種各樣的不同類型的DNA分子。所述DNA分子可以包括基因組、cDNA、單鏈DNA、雙鏈DNA、三鏈DNA、寡核苷酸和Z-DNA。所述DNA分子可以編碼各種各樣的促進(jìn)傷口愈合的因子，包括胞外、細(xì)胞表面和胞內(nèi)RNA和蛋白質(zhì)。胞外蛋白的例子包括生長因子、細(xì)胞因子治療蛋白、激素和激素的肽片段、細(xì)胞因子抑制劑、肽生長和分化因子、白介素、趨化因子、干擾素、集落刺激因子和血管生成因子。這類蛋白質(zhì)例子包括(但不限于)TGF-β分子超家族，該超家族包括5種 TGF-β同種型和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、潛伏TGF-β結(jié)合蛋白LTBP ；角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)；肝細(xì)胞生長因子(HGF)；血小板衍生生長因子(PDGF)；胰島素樣生長因子(IGF)； 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-l、FGF-2等等)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)；因子VIII 和因子IX;促紅細(xì)胞生成素(EPO)；組織纖維溶酶原激活物(TPA)；活化素和抑制素類?？梢杂糜趯?shí)施本發(fā)明的激素包括生長激素(GH)和甲狀旁腺激素(PTH)。胞外蛋白的例子也包括胞外基質(zhì)蛋白，諸如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白。細(xì)胞表面蛋白的例子包括細(xì)胞粘附分子家族(例如整聯(lián)蛋白、選擇蛋白、諸如N-CAM和Ll的Ig家族成員和鈣粘著蛋白)； 細(xì)胞因子信號受體，諸如I型和II型TGF-β受體和FGF受體；以及非信號共同受體，諸如 β聚糖和多配體聚糖。胞內(nèi)RNA和蛋白的例子包括信號傳導(dǎo)激酶家族、諸如踝蛋白和粘著斑蛋白的細(xì)胞骨架蛋白、諸如潛伏TGF-β結(jié)合蛋白家族的細(xì)胞因子結(jié)合蛋白以及核反式作用蛋白，諸如轉(zhuǎn)錄因子和增強(qiáng)因子。所述DNA分子也可以編碼阻斷病理過程的蛋白，由此允許天然傷口愈合過程無障礙地發(fā)生。阻斷因子的例子包括破壞RNA功能的核酶和例如編碼破壞組織完整的酶的組織抑制劑，例如與關(guān)節(jié)炎有關(guān)的金屬蛋白酶抑制劑。人們可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的各種各樣的分子生物學(xué)技術(shù)，獲得編碼感興趣蛋白的DNA區(qū)段。例如可以采用具有基于已知核苷酸序列的序列的引物或探針篩選 cDNA文庫或基因組文庫。也可以用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來產(chǎn)生編碼感興趣蛋白的DNA片段。另一方面，可以由商業(yè)來源獲得所述DNA片段。
具有與文獻(xiàn)所述序列不同的序列的基因也包括在本發(fā)明中，只要所述改變或修飾的基因編碼的蛋白仍用來以直接或間接方式刺激傷口愈合。這些序列包括由點(diǎn)突變產(chǎn)生的序列、由遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生的序列或天然產(chǎn)生的等位基因變異體以及通過遺傳工程 (即通過人工)導(dǎo)入的其它修飾。在核苷酸序列中導(dǎo)入用來改變所編碼蛋白或多肽功能性質(zhì)的改變的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。這類修飾包括導(dǎo)致所述氨基酸序列的改變的堿基的缺失、插入或置換?？梢赃M(jìn)行改變使所編碼蛋白的活性增加、其生物學(xué)穩(wěn)定性增加或半衰期增長、改變其糖基化模式、 賦予溫度敏感性或改變該蛋白的表達(dá)模式等等。所有對所述核苷酸序列的這類修飾都包括在本發(fā)明內(nèi)。編碼感興趣翻譯產(chǎn)物或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的DNA可以通過重組工程改造為各種各樣的載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)提供該DNA大規(guī)模的復(fù)制，以供制備基因活化基質(zhì)。這些載體可以設(shè)計(jì)為含有必需元件，以指導(dǎo)在傷口處修復(fù)細(xì)胞吸收的DNA序列的原位轉(zhuǎn)錄和/或翻譯?？梢允褂玫妮d體包括(但不限于)衍生于重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA 的那些載體。例如，可以使用質(zhì)粒載體，諸如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13mp載體系列。噬菌體載體可以包括λ gtlO、AgtlU λ gtl8-23、λ ZAP/R和EMBL噬菌體載體系列?？梢岳玫恼沉］d體包括(但不限于)pJB8、pCV103、pCV107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、 PHSG274、C0S202、C0S203、pffE15, pffE16和卡隆粒9載體系列。也可以使用提供體外轉(zhuǎn)錄 RNA的載體(諸如SP6載體)來產(chǎn)生大量的可以加入基質(zhì)中的RNA。另一方面，可以工程改造重組病毒載體，包括(但不限于)得自病毒的載體，這些病毒諸如皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、 痘苗病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒或牛乳頭瘤病毒。盡管可以使用整合型載體，但對于傷口愈合最好使用不將該基因產(chǎn)物傳遞給許多代子細(xì)胞的非整合型載體。這樣，該基因產(chǎn)物在傷口愈合過程中表達(dá)，由于該基因在后代中被稀釋掉，因此表達(dá)的基因產(chǎn)物量減少?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，來構(gòu)建含有操作性(operatively)與合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號連接的該蛋白編碼序列。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)和合成技術(shù)。參見例如 Sambrook 等，1992,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約)和Ausubel等， 1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates&ffiley Interscience, N. Y.中描述的技術(shù)。編碼感興趣蛋白的基因可以操作性地與各種各樣的不同啟動子/增強(qiáng)子元件連接。這些載體的表達(dá)元件的強(qiáng)度和特異性可以不同。根據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，可以使用多種合適的轉(zhuǎn)錄元件和翻譯元件中的任何一種。該啟動子可以為天然與該感興趣基因連接的啟動子形式。另一方面，該DNA可以位于重組或異源啟動子的控制之下，所述重組或異源啟動子就是不是天然與該基因連接的啟動子。例如，可以使用組織特異性啟動子/增強(qiáng)子元件來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染DNA在特定細(xì)胞類型中的表達(dá)。已經(jīng)描述的并可以使用的表現(xiàn)出組織特異性的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)的例子包括(但不限于)在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift 等，1984，Cell 38 :639-646 ;0rnitz 等，1986，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 :399-409 ；MacDonald，1987，Hepatology 7 :42S_51S)；在胰腺 β 細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，Nature 315 :115-122)；在淋巴樣細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl 等，1984，Cell 38 :647-658 ；Adams 等，1985，Nature318 :533-538 ；Alexander 等，1987，Mol. Cell. Biol. 7 :1436-1444)；在肝臟中有活性的清蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，Genes and Devel. 1 :268-276)；在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf 等，1985，Mol. Cell. Biol. 5 :1639-1648 ；Hammer 等，1987， Science 235 :53-58)；在肝臟中有活性的α-1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987， Genes and Devel. 1 :161-171)；在髓樣細(xì)胞中有活性的β -珠蛋白基因控制區(qū)(Magram等， 1985,Nature 315:338-340 ；Kollias 等，1986，Cell 46 :89-94)；在腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，1987，Cell 48 :703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Siani，1985,Nature 314 =283-286)；和在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素(gonadotropic releasing hormone)基因控制區(qū)(Mason等，1986， Science 234 :1372-1378)?？梢允褂脧脑诓溉閯游锛?xì)胞中生長的病毒基因組中分離的啟動子(例如RSV、痘苗病毒7. 5K、SV40、HSV、腺病毒MLP、MMTR LTR和CMS啟動子)以及通過重組DNA技術(shù)或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動子。在某些情況下，所述啟動子元件可以是組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子，可以在合適的條件下使用，以指導(dǎo)高水平或受調(diào)節(jié)的感興趣基因的表達(dá)。在組成型啟動子控制下的基因表達(dá)不需要存在誘導(dǎo)基因表達(dá)的特定底物，所述表達(dá)將在所有細(xì)胞生長條件下發(fā)生。 相反，由誘導(dǎo)型啟動子控制的基因表達(dá)對誘導(dǎo)物的存在或缺乏應(yīng)答。插入蛋白的編碼序列的充分翻譯也需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰的序列。當(dāng)包括起始密碼子和相鄰序列的完整的編碼序列插入到合適的表達(dá)載體時(shí)，可以不需要額外的翻譯控制信號。然而，當(dāng)僅插入一部分編碼序列時(shí)，必須提供外源翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。此外，該起始密碼子必須與所述蛋白編碼序列在一讀框內(nèi)，以確保所述完整插入片段的翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以來源于各種各樣的來源，既可以是天然的，也可以是合成的。可以通過包含轉(zhuǎn)錄衰減序列、增強(qiáng)子序列等等，增強(qiáng)表達(dá)的效率和控制。除編碼感興趣治療蛋白的DNA序列外，本發(fā)明的范圍還包括可以轉(zhuǎn)染到哺乳動物修復(fù)細(xì)胞中的核酶或反義DNA分子的應(yīng)用。這類核酶和反義分子可以用來抑制編碼抑制疾病過程或傷口愈合過程的基因蛋白的RNA的翻譯，由此允許發(fā)生組織修復(fù)。反義RNA分子的表達(dá)將用來通過與靶mRNA結(jié)合并防止蛋白翻譯，來直接阻斷mRNA 的翻譯。核酶為能夠催化RNA特異性切割的酶性RNA分子，核酶的表達(dá)也可以用來阻斷蛋白翻譯。核酶作用機(jī)制涉及該核酶分子與互補(bǔ)靶RNA的序列特異性雜交然后進(jìn)行核酸內(nèi)切。 特異性地和有效地催化RNA序列核酸內(nèi)切的工程錘頭狀基元核酶分子在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 可以通過編碼該RNA分子的DNA序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA分子?？梢允褂迷谝粋€(gè)或多個(gè)啟動子控制下的在單個(gè)遺傳構(gòu)建物上結(jié)合的多個(gè)基因、或作為相同或不同類型的單獨(dú)的構(gòu)建物制備的多個(gè)基因，這也在本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，可以使用幾乎無限的不同基因和遺傳構(gòu)建物的組合?？梢栽O(shè)計(jì)某些基因組合，使其達(dá)到對細(xì)胞刺激和再生的協(xié)同作用，或其使用可以以另外一種方式導(dǎo)致達(dá)到該目的，任何的和所有的這類組合都將在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)際上，在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了許多協(xié)同作用，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地鑒別可能的協(xié)同基因組合或甚至鑒別基因-蛋白組合。5. 1. 3所述基因活化基質(zhì)的制備在最佳實(shí)施方案中，通過將基質(zhì)材料浸泡在重組DNA貯液中，使所述基質(zhì)或植入物材料與編碼感興趣治療產(chǎn)物的DNA接觸。將該DNA加入該基質(zhì)中所需的DNA量和接觸時(shí)間將取決于所用的基質(zhì)類型，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易確定，而不用過度的實(shí)驗(yàn)。另一方面，該DNA可以包囊于合成聚合物基質(zhì)中，所述聚合物諸如為聚乳酸-聚乙醇酸的嵌段共聚物(參見Langer和Folkman，1976NatureJ63 :797_800，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。 再者，這些參數(shù)可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，而不用過度實(shí)驗(yàn)。例如，用于該基質(zhì)的 DNA構(gòu)建物的量將考慮到各種生物學(xué)因素和醫(yī)療因素而確定。人們可以考慮特定的基因、該基質(zhì)、傷口部位、所述哺乳動物宿主的年齡、性別和膳食和可能影響傷口愈合的任何其它臨床因素，諸如各種因子和激素的血清濃度。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以將生物學(xué)基質(zhì)和合成基質(zhì)和DNA的組合物一起凍干，形成藥用干粉。該基因活化基質(zhì)可以在植入機(jī)體前再水化，或者該基因活化基質(zhì)植入機(jī)體時(shí)可以自然再水化。在某些情況下，諸如植入物、縫線、傷口敷料等醫(yī)療裝置可以用本領(lǐng)域熟知的涂布技術(shù)涂上本發(fā)明的核酸組合物。這類方法包括例如(但不限于)將該裝置浸入該核酸組合物中、用該核酸組合物涂刷該裝置和/或用本發(fā)明的氣霧核酸組合物向該裝置噴霧。然后將該裝置或者于室溫下或者借助于干燥烘箱進(jìn)行干燥，干燥可選地在減壓下進(jìn)行。在所述實(shí)施例中提供涂布縫線的優(yōu)選方法。對于涂有含質(zhì)粒DNA的聚合基質(zhì)的縫線，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用含有總量為大約 0. 01-10mg、最好為大約l-5mg的質(zhì)粒DNA的涂布組合物，對長70cm的縫線涂布大約5-100 次，優(yōu)選大約5-50次，更優(yōu)選大約15-30次涂布，產(chǎn)生治療上有效的均勻涂層。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供涂布的縫線，尤其是涂有含核酸的聚合基質(zhì)的縫線，所述核酸編碼體內(nèi)刺激傷口愈合的治療蛋白?？梢园凑毡景l(fā)明方法和組合物涂布的縫線包括任何天然或合成來源的縫線。典型的縫合材料包括例如(但不限于)絲；棉；亞麻線；聚烯烴，諸如聚乙烯和聚丙烯；聚酯，諸如聚對苯二甲酸乙二酯；羥基羧酸酯的均聚物和共聚物；膠原(普通的或鉻處理的)；腸線 (普通的或鉻處理的)；和縫線代用品，諸如氰基丙烯酸酯。所述縫線可以采用任何便利的形式，諸如編帶(braid)或捻線(twist)，其大小范圍很寬，通常為本領(lǐng)域所用的大小。涂布縫線、尤其是涂有含核酸的聚合基質(zhì)的縫線的優(yōu)勢實(shí)際上覆蓋人類和動物中外科應(yīng)用的每一個(gè)領(lǐng)域，其中所述核酸編碼刺激傷口愈合的治療蛋白。5. 2所述基因活化基質(zhì)的用途本發(fā)明在人類醫(yī)療中適用于種類繁多的傷口愈合情況。這些包括(但不限于)骨修復(fù)、腱修復(fù)、韌帶修復(fù)、血管修復(fù)、骨骼肌修復(fù)和皮膚修復(fù)。例如，使用該基因活化基質(zhì)技術(shù)，由轉(zhuǎn)染的修復(fù)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子生長因子將通過結(jié)合細(xì)胞表面信號受體、由此刺激并放大與傷口愈合過程自然相關(guān)的生理事件級聯(lián)，影響該傷口中的其它細(xì)胞。最終結(jié)果是增加組織修復(fù)和再生。當(dāng)臨床目的為阻斷疾病過程，由此允許自然組織愈合發(fā)生時(shí)，或當(dāng)該目的為替代遺傳缺陷的蛋白功能時(shí)，本發(fā)明方法也是有用的。傷口可能由創(chuàng)傷性損傷或者由外科手術(shù)誘導(dǎo)或引起的組織損害產(chǎn)生的?？梢圆捎酶鞣N技術(shù)將本發(fā)明的基因活化基質(zhì)轉(zhuǎn)移至患者。例如，醫(yī)師可以用手直接將基質(zhì)或者作為治療植入物或者作為涂布裝置(例如縫線、移植片固定模(stent)、涂布植入物等等)轉(zhuǎn)移到該傷口部位?？梢云つw表面給與基質(zhì)，也可以通過外科將其置于正常組織部位，以便治療一定距離外的患病組織。傷口愈合過程是一個(gè)協(xié)調(diào)的事件順序，它包括出血、形成血塊、溶解該血塊，同時(shí)除去受損的組織，以及沉積作為初始修復(fù)材料的肉芽組織。所述肉芽組織是一種成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的混合物。所述傷口愈合過程涉及各種細(xì)胞群體，包括內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。參與傷口修復(fù)的調(diào)節(jié)因子已知包括系統(tǒng)性激素、細(xì)胞因子、生長因子、胞外基質(zhì)蛋白和調(diào)節(jié)生長和分化的其它蛋白。本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移方法和基質(zhì)組合物在各種各樣的不同組織類型中作為刺激組織修復(fù)和再生的藥物傳遞方法，具有廣泛應(yīng)用。這些包括(但不限于)骨修復(fù)、皮膚修復(fù)、 結(jié)締組織修復(fù)、器官再生或調(diào)節(jié)血管發(fā)生和/或血管生成?；蚧罨|(zhì)的用途也可以用來治療由于例如衰老或糖尿病的作用引起的愈合能力受損的患者。所述基質(zhì)也可以用來治療例如在老年患者中由于自然原因引起的愈合緩慢的傷口、以及對現(xiàn)有的療法不反應(yīng)的傷口，諸如慢性皮膚傷口的那些個(gè)體的傷口。本發(fā)明的一個(gè)重要特征在于，可以通過選擇性地使用基因活化基質(zhì)調(diào)節(jié)該傷口部位的瘢痕組織的形成?？梢酝ㄟ^控制治療蛋白的表達(dá)水平調(diào)節(jié)瘢痕組織的形成。在某些情況下，諸如燒傷或結(jié)締組織損害的治療，尤其希望抑制瘢痕組織的形成。本發(fā)明方法包括將含感興趣DNA的基質(zhì)移植入該宿主中。移植該基質(zhì)的方法可以包括將所述基質(zhì)手術(shù)放置或注射入該宿主中。當(dāng)欲注射所述基質(zhì)時(shí)，將所述基質(zhì)抽入注射器中，注射到患者的傷口部位。在該傷口區(qū)域可以進(jìn)行多次注射。另一方面，可以將所述基質(zhì)手術(shù)置于該傷口部位。達(dá)到本發(fā)明目的-即刺激傷口修復(fù)和再生所需的基質(zhì)量可隨該宿主的大小、年齡和體重而改變。本發(fā)明的一個(gè)基本特征是，無論何時(shí)將基因活化基質(zhì)轉(zhuǎn)移到該宿主中，無論是注射還是手術(shù)，都足以誘導(dǎo)該局部組織損害的傷口愈合過程。這是誘導(dǎo)靶哺乳動物修復(fù)細(xì)胞遷移到該基因活化基質(zhì)部位并進(jìn)行增殖的必要條件。在以下小節(jié)中描述具體實(shí)施方案。5. 3骨再生骨具有在骨折后再生的實(shí)際能力。所述復(fù)雜但有序的修復(fù)順序包括止血、血塊溶解、肉芽組織向內(nèi)生長、形成骨痂和該骨痂重建為優(yōu)化結(jié)構(gòu)(A.W.Ham.，1930，J. Bone Joint Surg. 12,827-844)。參與該過程的細(xì)胞包括血小板、炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、外膜細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成骨祖細(xì)胞(progenitor)。最近，已經(jīng)鑒定幾種肽生長分化因子，它們似乎控制與骨形成和修復(fù)有關(guān)的細(xì)胞事件(Erlebacher, A.等，1995，Cell 80，371-378)。 例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是控制成骨細(xì)胞命運(yùn)的可溶性胞外因子BMP基因通常由培養(yǎng)的胎兒成骨細(xì)胞表達(dá)(Harris, S. Ε.等，1994，J. Bone Min. Res. 9,389-394)以及在小鼠胚胎骨骼形成期間由成骨細(xì)胞表達(dá)(Lyons, K. Μ.等，1989，Genes Dev. 3，1657-1668 ； Lyons, K. Μ.等，1990，Development 190,833-844 Jones, Μ. C.等，1991，Development 111,531-542)，重組BMP蛋白引發(fā)軟骨和骨母細(xì)胞分化(Yamaguchi，A.等，1991，J. Cell Biol. 113,681-687 ；Ahrens, Μ.等，1993，J. Bone Min. Res. 12，871-880 ；Gitelman, S. E 等， 1994，J. Cell Biol. 126,1595-1609 ；Rosen, V.等，1994，J. Cell Biol. 127，1755-1766)，重組BMP的傳遞誘導(dǎo)與軟骨內(nèi)骨形成相似的骨形成順序(Wozney，J. Μ. , 1992, Mo 1. R印rod.Dev. 32，160-167 ；Reddi，A. H.，1994，Curr. Opin. Genet. Dev. 4，737-744)，并且 BMP-4 基因的表達(dá)在骨折修復(fù)過程中早期不受調(diào)節(jié)(Nakase，Τ.等，1994，J. Bone. Min. Res. 9, 651-659)。與BMP相關(guān)分子家族一成員成骨蛋白-KOzkaynak，Ε.等，1990，EMBO J. 9， 2085-2093)能夠在體外和體內(nèi)起相似的作用(Sampath，T長.等，1992，J. Biol. Chem. 267， 20352-20362 ；Cook, S. D.等，(1994) J. Bone Joint Surg. 76-A，827-838)。TGF-β 也表現(xiàn)出刺激體內(nèi)軟骨和骨形成(Centrella, M.等，1994，Endocrine Rev. 15,27-38 ；Sumner D. R.等，1995，J. Bone Joint Surg. 77A，11；35_1147)。最后，甲狀旁腺激素(PTH)為一 84 個(gè)氨基酸的激素，它提高血漿和胞外液的Ca+2濃度。在骨骼組織中，間斷地給與具有生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)需要的PTH片段(aa 1-34)產(chǎn)生真正的合成作用許多體內(nèi)和體外研究提供的強(qiáng)有力的證據(jù)表明，在動物(包括大鼠)中給與PTH1-34由于聯(lián)合的對破骨細(xì)胞的抑制作用和對成骨細(xì)胞的刺激作用導(dǎo)致解偶聯(lián)的高質(zhì)量的骨形成(Dempster，D. W.等，1993,Endocrine Rev. 14,690-709)。已知PTH1-34肽與BMP-4協(xié)同相互作用，在體外正調(diào)節(jié)分化中的破骨細(xì)胞功能性細(xì)胞表面 PTH 受體的表達(dá)(Ahrens, M.等，1993，J. Bone Min. Res. 12，871-880)。作為重組蛋白，諸如BMP和TGF-βΙ的肽生長分化因子代表有希望的骨折修復(fù)治療替代方法(Wozney，J. M.，1992，Mol. Reprod. Dev. 32，160-167 ；Reddi，A. H.，1994，Curr. Opin. Genet. Dev. 4,737-744 ；Centrella, Μ.等，1994, Endocrine Rev. 15，27-38 ；Sumner, D. R.等，1995，J Bone Joint Surg. 77-A，1135-1147)。然而，需要相對大劑量(微克量)來刺激動物顯著的新骨形成，引起人們對未來人類治療可能是昂貴并且毒性風(fēng)險(xiǎn)可能增加的關(guān)注。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將基因活化基質(zhì)通過外科手術(shù)植入大鼠5mm切骨術(shù)部位，這是人類的復(fù)合型不愈合骨折的模型。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以容易地達(dá)到將基因轉(zhuǎn)移到該切骨術(shù)裂縫中的修復(fù)細(xì)胞。所述骨修復(fù)和再生過程中的缺陷與臨床整形外科實(shí)踐中重要的并發(fā)癥有關(guān)，例如骨折后纖維性骨不連合、植入物界面失敗和大同種異體移植失敗。許多復(fù)合型骨折目前采用自身組織移植治療，但該技術(shù)不是有效的，并且伴隨發(fā)生并發(fā)癥。自然，設(shè)計(jì)以刺激骨修復(fù)的任何新技術(shù)在治療骨折中都可能是一種有價(jià)值的工具。相當(dāng)大一部分骨折仍通過鑄模治療，允許天然機(jī)制來實(shí)現(xiàn)傷口愈合。盡管近幾年來在骨折治療方面取得一些進(jìn)展，包括改進(jìn)的設(shè)備、開發(fā)新的刺激方法或補(bǔ)償，但所述傷口愈合機(jī)制仍可能代表該領(lǐng)域的重要進(jìn)展?？梢圆捎帽景l(fā)明轉(zhuǎn)移骨生長基因，以促進(jìn)骨折修復(fù)。該技術(shù)的其它重要方面包括采用基因轉(zhuǎn)移治療例如象骨質(zhì)疏松一樣的疾病的“弱質(zhì)骨(weak bone)”患者；改善可能由未知原因產(chǎn)生的愈合不良，例如纖維性骨不連合；促進(jìn)植入物整合和人造關(guān)節(jié)的功能；刺激諸如跟腱之類的其它骨骼組織的愈合；和作為修復(fù)大缺損的輔藥。已知骨組織具有修復(fù)和再生的能力，對這些過程的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)有一些了解。 新骨形成的引發(fā)包括修復(fù)細(xì)胞的定型、克隆擴(kuò)充和分化。骨形成一旦引發(fā)，則由各種各樣的多肽生長因子來促進(jìn)。然后新形成的骨由一系列的局部和系統(tǒng)性生長分化因子保持?，F(xiàn)在已經(jīng)克隆了幾種骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因(Wozney等，1988 ;R0Sen等，1989， Connect. Tissue Res. ,20 :313-319 ；Alper的綜述，1994)，該研究工作在DNA序列的同源性的基礎(chǔ)上，已經(jīng)將BMP確立為轉(zhuǎn)化生長因子- β (TGF-β)超家族的成員。不同BMP基因的克隆已經(jīng)導(dǎo)致將各個(gè)BMP基因和蛋白命名為BMP-I至至少BMP-8。BMP 2_8—般認(rèn)為是成骨性的，而BMP-I可能是更為普遍性的形態(tài)發(fā)生素；Shimell等，1991，Cell,67 :469-481)。 BMP-3 也稱為成骨素(Luyten 等，1989，J. Biol. Chem.，264 :13377-13380)，而 BMP-7 也稱為 OP-I (Ozkaynak 等，1990，EMBO J.，9 :2085-2093)。每種 TGF 和 BMP 通過與細(xì)胞表面受體家族的復(fù)雜的組織特異性相互作用作用于細(xì)胞(Roberts和Sporn，1989，Μ. B. Sporn和 Α. B. Roberts 編輯.，Springer-Verlag，Heidelberg, 95 (第 1 部分)；Aralkar 等，1991)。也已經(jīng)表明轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)通過影響細(xì)胞增殖、基因表達(dá)和基質(zhì)蛋白合成在調(diào)節(jié)組織愈合方面起重要作用(Roberts和Sporn，1989，Μ. B. Sporn和Α. B. Roberts編輯.， Springer-Verlag,Heidelberg,95 ( % 1 部分))。例如，TGF-β 1 和 TGF-β 2 既可以引發(fā)軟骨生成，也可以引發(fā)骨生成(Joyce 等，1990，J. Cell Biol.，110 :195-2007 ；Izumi 等，1992， J. Bone Min. Res. ,7 :115—11 Jingushi 等，1992, J. Orthop. Res. ,8 :364-371)。除TGF和BMP外的其它生長因子/激素可以用于本發(fā)明的實(shí)踐，以影響骨折后的新骨形成。例如，以多次高劑量(1. 0mg/50ml)注射到大鼠骨折部位的成纖維細(xì)胞生長因子 (Jingushi等，1990)導(dǎo)致該骨折裂縫中軟骨組織的顯著增加，而較低劑量沒有作用。例如甲狀旁腺激素(PTH)的鈣調(diào)節(jié)激素也可以用于本發(fā)明的一個(gè)方面。PTH是一種84個(gè)氨基酸的鈣調(diào)節(jié)激素，其主要作用是提高血漿和胞外液中的Ca+2濃度。也表明完整的PTH刺激超過30年前的器官培養(yǎng)物中的骨重吸收，且已知該激素增加破骨細(xì)胞的數(shù)目和活性。用該天然激素和合成肽進(jìn)行的研究已經(jīng)證明，該分子的氨基末端(aa-1-34)含有生物學(xué)活性所需的結(jié)構(gòu)(Tregear 等，1973 ;Hermann-Erlee 等，1976，Endocrine Research Communications, 3 :21-35 ；Riond,1993, Clin.Sci. ,85 :223-228)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將所述基因活化基質(zhì)通過外科手術(shù)植入骨折部位。 這類外科手術(shù)可以包括將GAM制劑直接注射到該骨折部位、復(fù)合型骨折的外科手術(shù)修復(fù)或關(guān)節(jié)鏡外科手術(shù)。在使用所述基因活化基質(zhì)修復(fù)骨折的骨時(shí)，所述哺乳動物修復(fù)細(xì)胞將自然遷移到骨損害部位并在此增殖。本發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，可以容易地完成將基因轉(zhuǎn)移到切骨術(shù)裂縫再生組織的修復(fù)細(xì)胞中。目前，達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)選方法一般涉及采用在被置于人們希望促進(jìn)骨生長的部位前不久浸泡在DNA溶液中的纖維性膠原植入材料，或采用包囊于合成基質(zhì)中的質(zhì)粒 DNA制劑，所述合成基質(zhì)例如為PLGA的嵌段共聚物。正如本文提出的研究所表明的，該植入材料促進(jìn)切骨術(shù)裂縫中的明顯參與骨再生/修復(fù)的細(xì)胞定向攝取外源質(zhì)粒構(gòu)建物。正如功能性標(biāo)記基因產(chǎn)物的體內(nèi)表達(dá)所證明的，所述轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞攝取后指導(dǎo)重組多肽的表達(dá)。本文提出的進(jìn)一步的研究證明，骨營養(yǎng)(osteotropic)基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)重組骨營養(yǎng)分子，其表達(dá)直接與新骨形成的刺激相關(guān)。具體地說，單獨(dú)的和組合的編碼BMP-4的基因轉(zhuǎn)移載體和編碼人PTH1-34片段的基因轉(zhuǎn)移載體將刺激新骨形成?？紤]到相對大量的候選基因后，編碼人甲狀旁腺激素hPTHl-34片段的基因轉(zhuǎn)移載體將刺激 Sprague-Dawley大鼠中的新骨形成，表明該人類肽可以有效地結(jié)合大鼠成骨細(xì)胞表面上的 PTH/PTHrP 受體。5. 4軟組織本發(fā)明也可以用來刺激諸如韌帶、腱、軟骨和皮膚的軟組織的生長或再生。由于創(chuàng)傷性損傷引起的骨骼結(jié)締組織損害可以采用含編碼各種各樣生長因子的基因的基質(zhì)治療。結(jié)締組織通常由組織成特征性組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞和胞外基質(zhì)組成。組織損傷可以破壞這種結(jié)構(gòu)，并刺激傷口愈合反應(yīng)。本發(fā)明方法特別適合于刺激結(jié)締組織的生長和再生，因?yàn)橹匾氖鞘軅M織再生而不形成疤痕組織，因?yàn)轳：劢M織可以干擾結(jié)締組織的正常機(jī)械功能?？梢杂酶鞣N生長因子促進(jìn)軟組織的修復(fù)，這些生長因子包括但不限于TGF-β超家族成員(例如TGF-β本身)，它刺激編碼胞外基質(zhì)蛋白和諸如EGF和PDGF的其它細(xì)胞因子的基因表達(dá)?？梢允褂玫钠渌虻睦影?a)細(xì)胞因子，諸如肽生長分化因子、白介素、趨化因子、干擾素、集落刺激因子；(b)血管生成因子，諸如FGF和VEGF ； (c)胞外基質(zhì)蛋白，諸如膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白；(d)細(xì)胞粘附分子家族(例如整聯(lián)蛋白、選擇蛋白、 Ig家族成員，諸如N-CAM和Li，以及鈣粘著蛋白)；(e)細(xì)胞表面細(xì)胞因子信號受體，諸如I 型和II型TGF-β受體和FGF受體；(f)非信號共同受體，諸如β聚糖和多配體聚糖；(g) 信號傳導(dǎo)激酶家族；(h)細(xì)胞骨架蛋白，諸如踝蛋白和粘著斑蛋白；(i)細(xì)胞因子結(jié)合蛋白， 諸如潛伏TGF-β結(jié)合蛋白家族；和(j)核反式作用蛋白，諸如轉(zhuǎn)錄因子。這類基質(zhì)一旦形成，則可以置于宿主哺乳動物的結(jié)締組織傷口區(qū)域。所述基因活化基質(zhì)可以直接注射到結(jié)締組織損傷區(qū)域?；蛘撸梢圆捎藐P(guān)節(jié)鏡外科手術(shù)的外科手術(shù)技術(shù)將所述基質(zhì)傳遞到該結(jié)締組織傷口區(qū)域。5. 5器官再牛本發(fā)明也可以用來刺激器官組織的修復(fù)和再生。由于創(chuàng)傷性損傷或外科手術(shù)引起的器官損害可以采用本發(fā)明方法治療。在肝臟的情況下，所述肝臟可能由于過量的酒精消耗或感染諸如病毒肝炎家族的各種類型的傳染性因子而引起損害。腎臟同樣可能由于腎病引起的損害而不能正常工作。食管、胃或十二指腸的粘膜可能存在由胃液中的酸和胃蛋白酶引起的潰瘍。所述潰瘍也可能是由幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)細(xì)菌在胃粘膜細(xì)胞定居引起的。這些器官和疾病僅僅作為實(shí)例，實(shí)際上本發(fā)明方法可以用來治療機(jī)體任何器官的疾病或刺激任何器官的器官再生。含刺激細(xì)胞增殖和分化和/或調(diào)節(jié)組織形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞因子的編碼DNA的基質(zhì)可以移植到合適的器官部位。這類因子可以包括但不限于蛋白轉(zhuǎn)化生長因子家族、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)。在某些情況下，表達(dá)刺激給定器官特有的細(xì)胞類型增殖的生長因子和/或細(xì)胞因子可能是有用的，所述給定器官特有的細(xì)胞類型即肝細(xì)胞、腎細(xì)胞或心臟細(xì)胞等等。例如可以表達(dá)肝細(xì)胞生長因子以刺激肝臟的傷口愈合過程。對于螺桿菌感染引起的潰瘍治療，所述基因活化基質(zhì)可以含有編碼抗微生物蛋白的DNA。本發(fā)明的基因活化基質(zhì)可以通過外科手術(shù)植入待治療的器官?；蛘撸梢岳酶骨荤R外科手術(shù)將所述基因活化基質(zhì)轉(zhuǎn)移到機(jī)體中。在該治療響應(yīng)組織損傷的情況下，所述自然傷口愈合過程將刺激所述修復(fù)細(xì)胞遷移到移植的基質(zhì)中并進(jìn)行增殖。另一方面，當(dāng)將所述基因活化基質(zhì)轉(zhuǎn)移至尚未損傷的器官時(shí)，例如當(dāng)植入基質(zhì)以表達(dá)不參與傷口愈合的治療蛋白時(shí)，可以通過誘導(dǎo)組織損傷刺激所述傷口愈合過程。5. 6血管生成的調(diào)節(jié)本發(fā)明也可以用來調(diào)節(jié)血管的形成和擴(kuò)展(spreading)，即分別為血管發(fā)生和血管生成。這兩種生理過程在傷口愈合和器官再生中起重要作用。首先，在傷口部位，膠原、基質(zhì)和血管的混合物-肉芽組織沉積，在組織修復(fù)期間
19提供傷口強(qiáng)度。新血管的形成包括血管肉皮細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤，且已知受各種各樣的多肽生長因子調(diào)節(jié)。已經(jīng)鑒定出具有肉皮細(xì)胞生長促進(jìn)活性的幾種多肽，包括酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血管肉皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和胎盤衍生生長因子(PDGF)。為了刺激血管的形成和擴(kuò)展，可以將編碼這類生長因子的DNA加入基質(zhì)中，并可以將這些基質(zhì)植入該宿主中。在某些情況下，可能必須通過組織損傷誘導(dǎo)所述的傷口愈合過程?？赡茏詈檬窃谥T如與依賴于血管形成而生長的實(shí)體瘤生長相關(guān)的血管生成中抑制血管形成的增殖?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)移編碼諸如血小板反應(yīng)蛋白或制管張素之類的血管生成負(fù)抑制劑的DNA，抑制腫瘤血管生成。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，可以將編碼例如血小板反應(yīng)蛋白或制管張素的DNA加入基質(zhì)中，然后將該基質(zhì)植入患者的該腫瘤部位。5. 7皮膚修復(fù)本發(fā)明也可以用來刺激皮膚組織的生長和修復(fù)。在涉及皮膚區(qū)域損傷的傷口中， 特別是在大面積燒傷(massive burn)的情況下，重要的是該皮膚非?？焖俚厣L來防止感染、減少體液損失和減小潛在的瘢痕形成面積。由燒傷、穿刺、切傷和/或擦傷引起的皮膚損傷可以采用本發(fā)明的基因活化基質(zhì)治療。諸如牛皮癬、特應(yīng)性皮炎或由真菌、細(xì)菌和病毒感染或治療諸如黑色素瘤的皮膚癌引起的皮膚損傷可以采用本發(fā)明方法治療。含刺激皮膚細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子的編碼DNA的基質(zhì)可以用來治療皮膚損傷和皮膚疾病，所述皮膚細(xì)胞包括中央基底干細(xì)胞(central basal stem cell)、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、朗格罕氏細(xì)胞和梅克爾細(xì)胞。所述基因活化基質(zhì)起兩個(gè)作用，即保護(hù)該傷口免于感染和脫水以及供應(yīng)DNA以供修復(fù)細(xì)胞攝取。本發(fā)明的基因活化基質(zhì)可以包括皮膚貼劑、尸體皮膚、急救繃帶、紗布墊、諸如美國專利4，505，266或美國專利4，485，097中公開的膠原網(wǎng)格、局部乳膏或凝膠。在將所述基質(zhì)用于所述傷口部位之前，可以除去受損的皮膚或失活的組織。被加入所述基質(zhì)的DNA可以編碼各種各樣的不同生長因子，包括角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)或表皮生長因子(EGF)。已經(jīng)表明IL-I是作為所述愈合過程部分的表皮細(xì)胞遷移和增殖的有效誘導(dǎo)物，編碼IL-I的DNA也可以加入本發(fā)明的基質(zhì)中。6.實(shí)施例用于骨基因轉(zhuǎn)移的植入材料可以使用各種植入材料將基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移到骨修復(fù)和/或再生部位中。將這些材料浸泡在含擬轉(zhuǎn)移到骨再生長部位的DNA或基因的溶液中?；蛘?，作為制備的優(yōu)選方法，可以將DNA加入該基質(zhì)中。合適材料的一個(gè)具體例子是纖維性膠原，它可以在從組織提取和部分純化后凍干，然后除菌。另一特別優(yōu)選的膠原是II型膠原，最特別優(yōu)選的膠原或者是重組II型膠原， 或者是礦化II型膠原。在置于切骨術(shù)部位之前，將植入材料在無菌條件下浸泡于DNA(或病毒)溶液中?？梢越葸m當(dāng)?shù)暮捅憷臅r(shí)間，例如從6分鐘至過夜。該DNA(例如質(zhì)粒) 溶液將為無菌水溶液，諸如無菌水或可接受的緩沖液，濃度一般為大約0. 5-1. Omg/ml。目前優(yōu)選的質(zhì)粒是諸如 PGL2 (Promega)、pSV40 β -gal、pAd. CMVlacZ 和 pcDNA3。7.實(shí)施例轉(zhuǎn)基因表達(dá)后的體內(nèi)蛋白檢測7. 1. 半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因可以通過免疫組織化學(xué)檢測細(xì)菌的β -半乳糖苷酶。將切骨術(shù)組織樣品在Bouins 固定液中固定、脫礦質(zhì)，然后沿縱向平面劈為兩半。每個(gè)樣品的一半包埋在石蠟中用于隨后的細(xì)菌半乳糖苷酶蛋白的免疫組織化學(xué)鑒定。關(guān)于免疫組織化學(xué)，將橫切片(厚2_3mm)轉(zhuǎn)移到包被聚_L_賴氨酸的顯微鏡玻片上，在丙酮中于0°C固定至少20分鐘。切片在PBS中再水化。通過于室溫下將組織切片浸入0. 過氧化氫(在95%甲醇中)10分鐘猝滅內(nèi)源性過氧化物酶活性，將猝滅的切片在PBS中洗滌3次。在某些情況下，將切片的顱蓋(calvariae)通過于4°C浸入4% EDTA、 5%聚乙烯吡咯烷酮和7%蔗糖，pH 7. 4中脫礦質(zhì)M小時(shí)。在應(yīng)用抗體之前，將脫礦質(zhì)切片洗滌3次。第一抗體不用稀釋，以雜交瘤上清液形式使用。將純化的抗體用于組織切片， 濃度為5mg/ml。用生物素化兔抗鼠IgG和過氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Zymed Histostain-SPkit)的檢測第一抗體。在過氧化物酶染色后，切片用蘇木精復(fù)染色。也可以采用市售試劑盒(例如Promega)，按照廠商的說明，通過底物利用測定檢測細(xì)菌半乳糖苷酶。7. 2.熒光素酶轉(zhuǎn)基因采用市售試劑盒(例如!Iomega)，按照廠商的說明，通過底物利用測定測定熒光素酶。7. 3. PTH 轉(zhuǎn)基因例如采用兩種市售放射免疫測定試劑盒，按照廠商的方案(Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano，CA)，在切骨術(shù)裂縫組織均漿中分析重組PTH，諸如 hPTHl-34 肽。一種試劑盒是完整的PTH-甲狀旁腺激素IOOT試劑盒(the Intact PTH-parathyroid Hormone 100T Kit)。這種放射免疫測定利用抗所述完整激素羧基末端的抗體，用它測定裂縫切骨術(shù)組織中激素的內(nèi)源水平。該測定可以用來建立大鼠切骨術(shù)模型中PTH表達(dá)的基線值。第二種試劑盒是用于測定大鼠PTH的雙位點(diǎn)免疫放射試劑盒。該試劑盒采用對所述完整大鼠激素氨基末端(PTH1-34)特異性的親和性純化抗體，由此測定內(nèi)源PTH的產(chǎn)生以及所述重組蛋白。先前的研究已經(jīng)表明，這些抗體與人PTH交叉反應(yīng)，并且這能夠識別體內(nèi)重組分子。從用2號試劑盒(抗所述氨基末端的抗體)獲得的值減去用1號試劑盒(抗所述羧基末端的抗體)獲得的值，獲得精確和敏感的測定值。因此，重組肽的水平與新骨形成程度相關(guān)。7. 4. BMP 轉(zhuǎn)基因采用識另IjHA 表位(Majmudar 等，1991，J. Bone and Min. Res. 6 :869-881)的特異性抗體，例如得自Boehringer-Marmheim的單克隆抗體，通過免疫組織化學(xué)檢測BMP蛋白， 諸如鼠BMP-4轉(zhuǎn)基因肽產(chǎn)物。也可以使用抗BMP蛋白本身的抗體。在美國專利4，857，456 中描述了這類抗體以及各種免疫測定方法，該專利通過引用結(jié)合到本文中。將切骨術(shù)組織樣品在Bouins固定液中固定，脫礦質(zhì)，然后沿縱向平面劈為兩半。 每個(gè)樣品的一半包埋在石蠟中，以用于隨后的重組鼠BMP-4分子的免疫組織化學(xué)鑒定。8. 實(shí)施例轉(zhuǎn)移骨營養(yǎng)基因在體內(nèi)刺激骨再生/修復(fù)設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)以研究基因轉(zhuǎn)移是否可以用來產(chǎn)生體內(nèi)組成型表達(dá)重組hPTHl-34 的轉(zhuǎn)染細(xì)胞、以及該轉(zhuǎn)基因是否可以刺激骨形成。如下分析新骨形成的速率。尸體解剖時(shí)，仔細(xì)解剖所述切骨術(shù)部位，以進(jìn)行組織形態(tài)分析。用卡尺測量所述骨痂組織的A-P和M-L大小。然后將樣品在Bouins固定液中浸漬固定，在乙醇中洗滌，在緩沖的甲酸中脫礦質(zhì)。采用脫鈣材料的塑料包埋，因?yàn)樵跇悠分苽浜颓衅陂g，甲基丙烯酸酯有優(yōu)越的大小穩(wěn)定性。在增加的乙醇濃度中將組織塊脫水并進(jìn)行包埋。采用Reichert Polycot切片機(jī)， 以冠狀平面切下厚5mm的切片。從中間貫穿骨髓腔的寬度制備切片，以防止取樣偏差。用于光學(xué)顯微鏡的切片用改良的Goldner氏三色染色法染色，以鑒別骨組織、骨樣組織、軟骨組織和纖維組織。用Eukitt氏封固劑(Calibrated Instruments，Ardsley，NY)給切片蓋上蓋玻片。采用Nikon Optiphot Research顯微鏡，在亮視野下進(jìn)行組織形態(tài)分析。采用 IOmmXlOmm目鏡方格網(wǎng)(grid reticular)的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)計(jì)數(shù)立體學(xué)技術(shù)。在放大125倍下測量總骨痂面積，作為所述愈合反應(yīng)總強(qiáng)度的指標(biāo)。在放大250 倍下測量骨、軟骨和纖維組織的面積部分，以檢查每種組織對骨痂形成的相對作用。由于所述切骨術(shù)裂縫的大小反映所述基線(時(shí)間為0)，因此用隨后時(shí)間間隔時(shí)的骨面積大小表示骨填充(infill)的速率。采用方差分析評價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，采用Tukey氏學(xué)生氏化極差檢驗(yàn)(studentized range test)進(jìn)行組間的 post-hoc 比較。在上述5mm大鼠切骨術(shù)模型中，發(fā)現(xiàn)PTH轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以刺激活動物的骨再生/ 修復(fù)。這是特別重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)橐阎猦PTHl-34不是連續(xù)給予而是間斷給予時(shí)，它是一個(gè)更有效的合成代謝劑，由于這里所用的基因轉(zhuǎn)移方法，它是連續(xù)類型的傳遞。9.實(shí)施例將基因在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移到正在再生的骨中將含哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒DNA的基因活化基質(zhì)植入成年雄性股骨中產(chǎn)生的大段裂縫中。植入含半乳糖苷酶或熒光素酶質(zhì)粒的基因活化基質(zhì)導(dǎo)致生長于該裂縫中的修復(fù)細(xì)胞攝取DNA并表達(dá)功能酶。另外，植入或者含骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4質(zhì)粒或者含甲狀旁腺激素片段(氨基酸1-34)編碼質(zhì)粒的基因活化基質(zhì)引起新骨填充該裂縫的生物學(xué)反應(yīng)。最后，已經(jīng)表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4和所述甲狀旁腺激素片段在體外協(xié)同作用，植入編碼這兩者的雙質(zhì)?；蚧罨|(zhì)引起新骨的形成比單獨(dú)使用任一因子要快。這些研究證明，首次可以在體內(nèi)遺傳操作骨中的修復(fù)細(xì)胞。本發(fā)明的基因活化基質(zhì)盡管可用作研究修復(fù)成纖維細(xì)胞和傷口愈合反應(yīng)的生物學(xué)，但本發(fā)明的基因活化基質(zhì)也有廣泛的治療應(yīng)用。9. 1.材料和方法9. 1. 1.哺乳動物宿主模型為了產(chǎn)生5mm的切骨術(shù)，將4個(gè)直徑為1. 2mm的釘子在全身麻醉和恒定的刺激下， 旋入正常成年Sprague-Dawley大鼠的股骨骨干中。外科手術(shù)模板(template)引導(dǎo)釘子平行放置，這通過熒光X線射線照相證實(shí)(釘子設(shè)置在距固定板(fixator place)邊緣3. 5mm 處，間隔為2. 5mm)。然后將一個(gè)外部固定板(30X 10X5mm)用所述釘子固定。外部固定板在CNC磨(mill)上用鋁合金制造，以確保耐受性高。預(yù)制的具有相連鎖緊墊圈和螺釘?shù)墓潭ㄆ饔刹讳P鋼制造。在外科手術(shù)之前，所有固定器零件都用環(huán)氧乙烷氣體滅菌。用Hall Micro 100往復(fù)式鋸(Zimmer Inc. ,Warsaw，IN)，在中軸產(chǎn)生5mm的節(jié)段缺損。放置膠原海綿，并將其保持在切骨術(shù)裂縫中，直至被凝固的血液包圍；初步研究表明，這種操縱將所述海綿固定在切骨術(shù)部位。所述皮膚切口用釘皮釘(staple)閉合。該固定器提供必需的穩(wěn)定性，使得所述哺乳動物宿主的行走在幾周內(nèi)不受限制。9. 1. 2.免疫組織化學(xué)
制備用于光學(xué)顯微鏡的組織，按已描述的方法(Wong等，1992，J Biol. Chem. 267 5592-5598)進(jìn)行免疫組織化學(xué)。組織切片與市售抗β-gal抗體(稀釋度為1 200， 5Prime - 3Prime)以及與市售抗ΗΑ· 11多克隆抗體(稀釋度為1 500，MAbC0) —起溫育。9. 1.3.熒光素酶和β-gal酶測定采用熒光素酶測定系統(tǒng)(!Iomega)和β -半乳糖苷酶酶測定系統(tǒng)(Promega)，按照廠商提供的方案測定熒光素酶和β-gal活性。9.1.4. pGAMl 表汰質(zhì)粒為了裝配pGAMl，用試劑盒試劑和方案(Poly AT Tract mRNA分離系統(tǒng)I， Promega)由第13. 5天飯后(p. c)⑶_1小鼠胚胎制備mRNA。采用市售試劑(逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)，Promega)、用一等份mRNA來產(chǎn)生cDNA。采用以下條件通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PRC)產(chǎn)生全長小鼠BMP-4cDNA編碼序列，所述條件為94°C 4分鐘，1個(gè)周期；94°C 1分鐘，65°C 1 分鐘，72°C 1分鐘，30個(gè)周期；72°C 8分鐘，1個(gè)周期。所述PCR引物的序列基于已知的小鼠 BMP-4 序列(GenBank)上游引物-5，CCATGATTCCTGGTAACCGAATGCTG 3，；下游引物-5，CTCAGCGGCATCCGCACCCCTC 3，。通過瓊脂糖凝膠電泳純化預(yù)期大小(1. 31Λ)的單一 PCR產(chǎn)物，將其克隆到TA克隆載體(Invitrogen)中。通過加入編碼HA表位的27個(gè)核苷酸的序列，進(jìn)一步修飾(PCR)所述BMP-4插入片段的5’端，將所述BMP-4插入片段克隆到 pcDNA3表達(dá)載體(Invitrogen)中。制備質(zhì)粒DNA并進(jìn)行測序(兩條鏈)，以確保所述BMP-4 插入片段的方向和完整。采用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯試劑盒(TNF T7偶聯(lián)網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液系統(tǒng)，Promega)，按照廠商提供的方案表達(dá)PGAMl質(zhì)粒。蛋白的放射性標(biāo)記、免疫沉淀、樣品制備和SDS-PAGE、 放射自顯影、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和Western分析按已描述的方法(Yin等，1995，J. Biol. Chem. 270 10147-10160)進(jìn)行。9.1.5. PGAM2 表達(dá)質(zhì)粒通過PCR產(chǎn)生編碼氨基酸前原1-34的人甲狀旁腺激素cDNA片段。所述PCR引物基于已知的人 PTH 序列(GenBank)上游引物 _5，GCGGATCCGCGATGATACCTGCAAAAGACATG 3，；下游引物-5，GCGGATCCGCGTCAAAAATTGTGCACATCC 3，。該引物對在所述PCR片段的兩個(gè)末端產(chǎn)生BamHI位點(diǎn)。所述片段用BamHI消化，并連接到PLJ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Wilson等， 1992，Endocrinol. 130 =2947-2954)中的一個(gè)BamHI克隆位點(diǎn)中。最后分離具有編碼方向插入片段的克隆(PGAM2)，并通過DNA序列分析進(jìn)行特征鑒定。為了產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒貯液，采用磷酸鈣法，用10 μ g重組載體DNA轉(zhuǎn)染Ψ CRIP包裝細(xì)胞系(Wilson，J.M.等，1992，Endocrinology 130 =2947-2954) 過夜培養(yǎng)后，收獲含有逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的補(bǔ)充10%胎牛血清、青霉素(100單位/ml)和鏈霉素(100mg/ml) (所有試劑都得自Gibco-BRL Life Technologies, Inc.)的培養(yǎng)基(Dulbecco氏的改進(jìn) Eagle氏培養(yǎng)基)，將其用于培養(yǎng)的Rat-I細(xì)胞。通過標(biāo)準(zhǔn)感染和選擇步驟，獲得成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的Rat-I細(xì)胞的獨(dú)立的克隆。簡而言之，讓培養(yǎng)的Rat-I細(xì)胞生長至匯合，以1 10分開， 并在 G418(lmg/ml，Gibco-BRL Life Technologies, Inc.)中選擇。在某些情況下，將抗生素抗性菌落合并為單個(gè)培養(yǎng)物。在其它情況下，保持抗性細(xì)胞的單個(gè)菌落。用相似的方法產(chǎn)生用編碼細(xì)菌b-gal酶的BAGT逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的Rat-I細(xì)胞的克隆。用市售放射免疫測定試劑盒(INS-PTH，Nichols)，按照廠商的方案估計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)基中 hPTHl-34 的濃度。按已描述的方法(McCauley 等，1994，Mol. Cell. Endocrinol. 101 331-336)評價(jià)pGAM2編碼肽的生物學(xué)活性。9. 1.6.基因活化膠原海綿的制備關(guān)于每個(gè)切骨術(shù)裂縫，將凍干的牛氣管膠原(10mg，Sigma)在植入前在0. 5_lmg質(zhì)粒DNA的無菌溶液中充分潤濕，讓其于4°C溫育1-16小時(shí)。9. 1. 7.射線照相術(shù)在哺乳動物宿主清醒時(shí)，用便攜式X-射線裝置(GE，100型)獲得每周的平片射線照片(前后視圖)。于57KV和15ma下曝光1/10秒。9.2.結(jié)果9. 2. 1.切骨術(shù)樽型我們的模型系統(tǒng)采用成年大鼠股骨中的5mm中軸切骨術(shù)。切骨術(shù)裂縫用四釘?shù)耐獠抗潭ㄆ鞣€(wěn)定。修復(fù)方式取決于該裂縫的大小2mm裂縫通過骨連合愈合，但5mm的裂縫通過纖維性骨不連合愈合(Rouleau，J. P.等，Trans. Ortho. Res. Soc. 20 )，而大鼠的切骨術(shù)修復(fù)在手術(shù)后9周時(shí)完成。對照哺乳動物宿主保持至手術(shù)后13周，證實(shí)5mm的裂縫通常通過纖維性骨不連合愈合的觀察。每周的平片射線照相術(shù)和組織學(xué)(圖1A-D)證明，在或者僅接受5mm切骨術(shù)(n = 3)、或者接受5mm切骨術(shù)加上膠原海綿(n = 10)、或者接受5mm切骨術(shù)加上含標(biāo)記基因裸露質(zhì)粒DNA的膠原海綿(n = 23)的哺乳動物宿主中不形成骨。所有36個(gè)對照裂縫都通過沉積纖維組織愈合。對照股骨表現(xiàn)出病灶性骨膜性新骨形成(釘放置并發(fā)癥)。手術(shù)后也觀察到裂縫組織中的病灶性一過性炎癥反應(yīng)(淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。9. 2. 2.標(biāo)記基因研究在初步的可行性研究中，在體內(nèi)成功地轉(zhuǎn)移IacZ和β -gal表達(dá)質(zhì)粒DNA。該目標(biāo)是使所述基因活化基質(zhì)制備方案和術(shù)后時(shí)間進(jìn)程標(biāo)準(zhǔn)化。將編碼熒光素酶的GAM置于1只大鼠的切骨術(shù)裂縫中，將一個(gè)編碼β-gal的基因活化基質(zhì)置于第二只動物的裂縫中。3周后，在小心地解剖周圍骨、軟骨和骨骼肌后，制備裂縫勻漿(包含肉芽組織)。通過底物利用測定評價(jià)每種勻漿的等分樣品的酶表達(dá)。在每種勻漿樣品中都檢測到預(yù)期的酶活性。在條件改變(例如DNA劑量、分析蛋白表達(dá)的時(shí)間)的其它實(shí)驗(yàn)中獲得陽性結(jié)果。9. 2. 3. BMP-4 的基因轉(zhuǎn)移在證實(shí)裂縫細(xì)胞從基質(zhì)攝取質(zhì)粒DNA后表達(dá)功能酶之后，我們問基因轉(zhuǎn)移是否可以用來調(diào)節(jié)骨再生。我們選擇過量表達(dá)骨折修復(fù)期間祖細(xì)胞正常表達(dá)的一種骨誘導(dǎo)因子-BMP-4。通過PCR產(chǎn)生全長的小鼠BMP-4CDNA，并將其亞克隆到pcDNA3 (Invitrogen)真核表達(dá)載體中(圖幻。為了特異性地檢測重組蛋白，加入血凝素(HA)表位修飾所述BMP-4 編碼序列的3’端。采用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯方案，由該構(gòu)建物(pGAMI)表達(dá)重組BMP-4。免疫沉淀研究證實(shí)抗-HA多克隆抗體識別HA表位的能力。用PGAMI質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的 293T細(xì)胞后，評價(jià)重組BMP-4的生物合成。通過免疫沉淀證明，BMP-4分子如所預(yù)期的裝配為同二聚體，分泌并加工。綜合這些結(jié)果，確立所述HA表位被抗HA多克隆抗體識別。將含pGAMI DNA的膠原海綿置于9只成年大鼠的所述裂縫中，保持4-M周。在術(shù)后4周處死的一只哺乳動物宿主中，采用抗HA抗體的免疫組織化學(xué)研究證明，該裂縫中的修復(fù)成纖維細(xì)胞表達(dá)PGAMI。這是有意義的，因?yàn)橐阎覀冊趤碜?3只對照哺乳動物宿
24主的裂縫組織的檢查中沒有觀察到假陽性染色。在4周的樣本中也觀察到源自兩側(cè)手術(shù)邊緣的新骨顯微病灶(focus)。與通過自身誘導(dǎo)形成骨的典型描述⑴rist，1965，Science 150 :893-899) 一致，這些病灶由表面覆蓋大立方形成骨細(xì)胞的骨板組成，并由多型紡錘形成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管構(gòu)成的細(xì)胞結(jié)締組織支持。在術(shù)后5-12周處死的7只哺乳動物宿主中，放射照相的新骨的量穩(wěn)定的增加(圖3A)，即使通過免疫組織化學(xué)沒能檢測到所述轉(zhuǎn)基因編碼的BMP-4。到9周時(shí)觀察到定義為新骨、從手術(shù)邊緣延伸橫跨所述切骨術(shù)裂縫的橋連。第9只哺乳動物宿主術(shù)后存活M周，沒有并發(fā)癥。至18周時(shí)，形成足夠的新骨，允許除去所述外部固定器，所述哺乳動物宿主在另外6周行走良好(圖3A)。處死時(shí)，除該裂縫遠(yuǎn)側(cè)邊緣附近的一條薄的射線可透過的(radiolucent)的組織外，所述裂縫充滿了進(jìn)行活躍重建的新骨。已知所述哺乳動物宿主已經(jīng)不用固定而成功地行走，因此假定該條為部分礦質(zhì)化。與該假設(shè)一致，生物機(jī)械測試(Frankenburg等，1994，Trans. Ortho. Res. Sco. 19 513)證明，所述愈合裂縫的機(jī)械強(qiáng)度基本上與同一哺乳動物宿主的未手術(shù)股骨相同(差異為6.3%，最大扭矩試驗(yàn))。在所有9個(gè)病例中，對側(cè)(未手術(shù))股骨的放射照相外觀未改變，暗示基因轉(zhuǎn)移和BMP-4過量表達(dá)的作用限于所述切骨術(shù)裂縫。
9. 2. 4.質(zhì)?；旌蟿?BMP-4+PTH1-34)的轉(zhuǎn)移和表汰骨再生通常由按一受調(diào)節(jié)序列起作用的多種因子控制，因此我們想知道，表達(dá)幾種合成代謝因子是否能夠比僅單個(gè)因子更有效地刺激骨形成。為了評價(jià)這種假設(shè)，我們選擇傳遞編碼BMP-4加上甲狀旁腺激素(PTH)片段的雙質(zhì)粒GAM。PTH是一種84個(gè)氨基酸的激素，它提高血漿和胞外液的Ca+2濃度。在骨骼組織中，間斷地給與具有生物學(xué)活性所需結(jié)構(gòu)的PTH片段(aa 1-34)產(chǎn)生真正的合成代謝作用大量的體內(nèi)和體外研究提供的有力證據(jù)表明，在哺乳動物宿主(包括大鼠)中給與PTH1-34由于聯(lián)合的對破骨細(xì)胞的抑制作用和對成骨細(xì)胞的刺激作用導(dǎo)致解偶聯(lián)的高質(zhì)量的骨形成(Dempster等，1993，Endocrine Rev. 14,690-709)。已知PTH1-34肽與BMP-4協(xié)同相互作用，正調(diào)節(jié)分化中的成骨細(xì)胞中功能性細(xì)胞表面 PTH 受體的表達(dá)(Ahrens 等，1993，J. Bone Min. Res. 12 :871-880)。通過PCR產(chǎn)生編碼人PTH1-34的cDNA片段。為了確立其生物學(xué)活性，將該片段亞克隆到 PLJ 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Wilson 等，1992，Endocrin, 130 :2947-2954)中，產(chǎn)生 pGAM2 表達(dá)載體(圖4A)。制備復(fù)制缺陷型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒貯液，將其用于培養(yǎng)中的Rat-I細(xì)胞。 獲得轉(zhuǎn)導(dǎo)的Rat-I細(xì)胞的獨(dú)立的克隆，通過Southern和Northern分析證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA 穩(wěn)定地整合并表達(dá)。用放射免疫測定確定各個(gè)克隆的條件培養(yǎng)基中人PTH1-34的濃度。ROS 17/2. 8細(xì)胞具有PTH細(xì)胞表面受體，它屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族(Dempster等，1993， Endocrin. Rev. 14 :690-709)。ROS 17/2. 8細(xì)胞與等份的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基 (通過放射免疫測定，分泌> 2pg/ml)溫育，導(dǎo)致與所述對照相比CAMP反應(yīng)提高2. 7倍，該結(jié)果確立所述分泌的PTH1-34具有生物學(xué)活性。僅含有pGAM2質(zhì)粒DNA的GAM刺激骨，然后將含有BMP-4和PTH1-34表達(dá)質(zhì)粒DNA 的GAM植入另外3只哺乳動物宿主的切骨術(shù)裂縫中。至4周時(shí)，在所有3只哺乳動物宿主中均觀察到橋連(1只哺乳動物宿主在此時(shí)處死用于組織學(xué)分析)，植入后12周時(shí)，在其余的哺乳動物宿主中形成足夠的新骨，允許除去所述外部固定器(圖幻。在植入后15周和 26周公開時(shí)，兩只哺乳動物宿主都行走自如?；谄狡渚€照相術(shù)，基因轉(zhuǎn)移和過量表達(dá)的作用又似乎限于所述切骨術(shù)裂縫。
用膠原海綿研究后，也已經(jīng)表明質(zhì)粒DNA在包囊于聚乳酸-聚乙醇酸嵌段共聚物顆粒制劑中后，可以以緩釋方式傳遞到細(xì)胞。所述結(jié)果證明，培養(yǎng)的細(xì)胞可以被聚乳酸-聚乙醇酸顆粒中釋放的質(zhì)粒DNA所轉(zhuǎn)染。結(jié)果也表明修復(fù)成纖維細(xì)胞(大鼠切骨術(shù)模型)體內(nèi)吸收并表達(dá)從聚乳酸-聚乙醇酸嵌段共聚物顆粒釋放的質(zhì)粒DNA。圖7證明，修復(fù)成纖維細(xì)胞(大鼠切骨術(shù)模型)體內(nèi)吸收從聚乳酸-聚乙醇酸顆粒釋放后的PGAM質(zhì)粒DNA并表達(dá)該DNA。正如圖7所示，質(zhì)粒編碼的PTH1-34的表達(dá)與所述切骨術(shù)裂縫中顯著的新骨形成有關(guān)?？偠灾?，這些研究表明，所述基因活化基質(zhì)技術(shù)的成功不依賴于膠原基質(zhì)。因此，該技術(shù)的應(yīng)用范圍足夠?qū)?，它可以與生物學(xué)基質(zhì)和合成基質(zhì)聯(lián)用。10. _仿丨丨輛ΦΦ白麵瞎砠在跟腱和韌帶(肩膀和膝蓋)修復(fù)期間，臨床上需要刺激瘢痕形成，以增強(qiáng)受傷組織的機(jī)械反應(yīng)能力。已經(jīng)開發(fā)了一個(gè)模型系統(tǒng)，其中在跟腱中產(chǎn)生節(jié)段缺損，并用新型生物材料小腸粘膜下層或SIS作為腱植入物/分子傳遞劑。在本實(shí)施例中，證明用所述SIS移植物將標(biāo)記基因構(gòu)建物傳遞到再生中的腱組織并表達(dá)的能力。10. 1.材料和方法已經(jīng)產(chǎn)生跟腱的節(jié)段缺損，并將SIS制劑用作腱植入物/分子傳遞系統(tǒng)。按照標(biāo)準(zhǔn)方案(Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)制備質(zhì)粒(pSVogal， Promega)貯液。由成年豬的一段空腸制備SIS移植物(Badylak等，1989，J. Surg. Res. 47 74-80)。收獲時(shí)，除去腸系膜組織，將該節(jié)段外翻，通過機(jī)械摩擦技術(shù)除去粘膜和淺表粘膜下層。在翻回該腸段至原來的方位后，沖洗漿膜層和肌肉層，用稀過氧乙酸滅菌，然后于4°C 貯存直至使用。將Mongrel狗(所有研究)麻醉，插管，將其右側(cè)側(cè)臥于加熱墊上，并用吸入麻醉維持。采用從肌腱接合點(diǎn)至足底筋膜(plantar fasia)的側(cè)切口暴露跟腱。用雙倍厚度的 SIS片層包裹所述腱中心部分周圍，將兩端縫上，通過所述移植材料中的側(cè)開孔除去所述腱的1.5cm節(jié)段，封閉所述移植物和手術(shù)部位。將該腿固定6周，然后自由使用6周。在以下所示時(shí)間點(diǎn)時(shí)收取移植組織，在Bouins固定液中固定，并包埋于石蠟中。切下組織切片 (Sum)用于免疫組織化學(xué)。10. 2.結(jié)果在初步研究中，在Mongrel狗中產(chǎn)生節(jié)段缺損后，移植單獨(dú)的SIS材料(僅SIS的移植物)，促進(jìn)跟腱再生長達(dá)術(shù)后6個(gè)月。重建過程包括肉芽組織的快速形成和該移植物的最終降解。不形成瘢痕組織，沒有觀察到免疫介導(dǎo)的排斥的證據(jù)。在第二個(gè)研究中，將SIS浸泡在質(zhì)粒DNA溶液(SIS+質(zhì)粒移植物)中，隨后在正常 Mongrel狗中作為跟腱移植物(n = 2只狗)或交叉韌帶移植物(n = 2只狗)植入。采用特異性抗體，在4/4哺乳動物宿主中通過免疫組織化學(xué)檢測到pSVi3 gal質(zhì)粒，pSVi3 gal采用猿猴病毒40調(diào)節(jié)序列驅(qū)動半乳糖苷酶(β-gal)活性。作為陰性對照，在這些哺乳動物宿主的未手術(shù)的跟腱和交叉韌帶中沒有檢測到β-gal活性。因此，似乎是SIS促進(jìn)腱和韌帶中的新腱細(xì)胞攝取并隨后表達(dá)質(zhì)粒DNA。設(shè)計(jì)第三個(gè)研究評價(jià)β -gal轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。將SIS+質(zhì)粒移植物植入3、 6、9和12周(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)η = 2只狗)，通過免疫組織化學(xué)分析轉(zhuǎn)基因表達(dá)。切下Bouins固定、石蠟包埋組織的橫向切片(811111)，并固定在1^01^011 Plus玻片(Fisher)上。按照 Histostain-SP試劑盒(Zymed)提供的方案進(jìn)行免疫組織化學(xué)。簡而言之，將玻片與很好表征的抗β -半乳糖苷酶抗體(稀釋度為12 00，5Prime — 3Prime)溫育，在PBS中洗滌， 與生物素化第二抗體溫育，洗滌，用酶綴合物加上底物-色素原混合物染色，然后用蘇木精和曙紅復(fù)染色。在接受SIS+質(zhì)粒移植物的腱(8/8哺乳動物宿主)中檢測到細(xì)菌β-gal活性。盡管沒有精確地定量，但轉(zhuǎn)基因表達(dá)似乎在9-12周時(shí)達(dá)到峰值。在接受僅SIS的移植物的35 只哺乳動物宿主中沒有檢測到細(xì)菌β "gal基因表達(dá)。11.實(shí)施例將腺病毒基因內(nèi)轉(zhuǎn)移再生中的骨中達(dá)到將基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移到再生中的組織中的另一選擇方法是利用腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移事件。已經(jīng)達(dá)到將標(biāo)記基因構(gòu)建物的腺病毒基因成功地轉(zhuǎn)移到大鼠切骨術(shù)模型的骨修復(fù)細(xì)胞中。11. 1.材料和方法腺病毒載體pAd. CMVlacZ為可以在允許細(xì)胞中復(fù)制的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的一個(gè)例子(Straford-Perricaudet 等，1992，J. Clin. Invest. 90 :626-630)。在該具體載體中，使用巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期增強(qiáng)子/啟動子來驅(qū)動LacZ的轉(zhuǎn)錄，其中所述LacZ具有在所述報(bào)道基因下游克隆的SV40多腺苷酸化序列(Davidson等，1993，Nature Genetics 3 :219-223)。pAd. RSV4的骨架與pAdCMVlacZ的基本相同，然而所述CMV啟動子和單一的BglII 克隆位點(diǎn)已經(jīng)以盒樣方式用由RSV啟動子、一個(gè)多克隆位點(diǎn)和聚腺苷酸位點(diǎn)構(gòu)成的BglII 片段取代。設(shè)想該載體更大的靈活性可用于亞克隆諸如hPTHl-34cDNA片段的骨營養(yǎng)基因， 以供進(jìn)一步研究。在Ultra Fiber 植入物在AdCMV IacZ病毒溶液(IOici-IO11空斑形成單位或PFU/ ml)中浸泡6分鐘，然后植入所述切骨術(shù)部位。讓該缺損愈合3周，在此期間通過每周的射線照相檢查監(jiān)測所述傷口愈合反應(yīng)的進(jìn)程。到3周時(shí)，估計(jì)有40%的缺損填有骨痂組織。 處死該哺乳動物宿主，將組織固定在Bouins固定液中，然后用標(biāo)準(zhǔn)甲酸溶液脫礦質(zhì)7天。11. 2.結(jié)果獲得的結(jié)果確實(shí)證明所述標(biāo)記基因產(chǎn)物在所述切骨術(shù)裂縫的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞中表達(dá)(圖6)。在前成骨細(xì)胞中也已經(jīng)觀察到所述核靶向信號。12.實(shí)施例將基因轉(zhuǎn)移至骨骼肌在跟腱和韌帶(肩膀和膝蓋)以外的軟組織修復(fù)期間，臨床上需要刺激瘢痕形成， 以增強(qiáng)受傷組織的機(jī)械反應(yīng)能力。已經(jīng)開發(fā)了一種模型系統(tǒng)，其中在成年大鼠的骨骼肌中制造切口，將涂有緩釋PLGA顆粒和質(zhì)粒DNA的制劑的縫線用作骨骼肌/基因傳遞裝置。為了證明本發(fā)明涂布組合物和方法的可行性，用標(biāo)記DNA (編碼人胎盤堿性磷酸酶)涂布外科手術(shù)縫線，將其用來縫合大鼠肌肉組織。該實(shí)驗(yàn)證明，將DNA成功地轉(zhuǎn)移到用所述涂布縫線修復(fù)的組織中并在其中表達(dá)。12. 1.材料和方法12. 1. 1. DNA-PLGA涂布組合物的制備向1. 5ml PLGA/氯仿溶液(3% (w/v) 50/50聚乳酸聚乙醇酸PLGA共聚物，平均分子量為90，000，特性粘度為1. 07)加入0. 2ml含編碼人胎盤堿性磷酸酶的標(biāo)記DNA的溶液 (lmg DNA,0. 5mM Tris_EDTA、0. 5mM EDTA，pH 7. 3)。該溶液通過渦旋混合2分鐘，然后用輸出功率為55瓦的微尖端探頭型超聲波儀，于大約0°C超聲處理30秒進(jìn)行乳化。該方法產(chǎn)生的乳液非常象乳狀。12. 1. 2涂布外科手術(shù)縫線用22 號針在涂布 Teflon 的薄金屬片(Norton Performance Plastic Corp., Akron, OH)上刺一個(gè)孔。在此孔上置一滴(大約60 μ 1)所述DNA-PLGA乳液。將70cm長的 3-0鉻制縫線^thicon)穿過此孔以涂布該縫線。當(dāng)所述縫線通過此孔時(shí)，被涂布薄(大約30 μ m厚)而均勻的涂布組合物的涂層。將所述縫線風(fēng)干大約3分鐘，并重復(fù)所述涂布過程15次，讓每一涂層風(fēng)干。用電子顯微鏡(150倍)檢查所述涂布縫線，發(fā)現(xiàn)所述縫線上覆蓋了均勻一致的DNA-PLGA涂層。而且，甚至在所述縫線通過組織多次后，該涂布層仍保持完整。12. 1. 3.用涂布縫線修復(fù)骨骼肌將以上制備的所述縫線縫入2只正常成年大鼠的骨骼肌組織中，獲得滿意的外科手術(shù)結(jié)果。所述縫線呈現(xiàn)良好的栓系特性。一周后，解剖肌肉加縫線，速凍于液氮中并研磨成粉。將所述粉末溫育于200μ1裂解緩沖液中，凍融三次且使其澄清。于65°C溫育后，用標(biāo)準(zhǔn)方法分析該澄明液體的堿性磷酸酶活性。12. 2 結(jié)果所述結(jié)果表明，1周后用涂布縫線縫上并恢復(fù)的大鼠骨骼肌表現(xiàn)出堿性磷酸酶活性，表明所述標(biāo)記堿性磷酸酶基因在該肌肉組織中表達(dá)。對照恢復(fù)沒有顯示出明顯的堿性磷酸酶活性。這些數(shù)據(jù)證明，可以使用乳液有效地涂布縫線，并將基因體內(nèi)傳遞到正在增殖的修復(fù)細(xì)胞中。13.實(shí)施例將基因轉(zhuǎn)移至血管因?yàn)槔缭谘艹尚涡g(shù)后的血管修復(fù)期間可能發(fā)生再狹窄，臨床上需要防止過度的纖維化(再狹窄)。這可能例如通過傳遞編碼賴氨酰氧化酶抑制劑的基因或通過轉(zhuǎn)移編碼某些TGF-β的基因來完成。另外，例如在血管機(jī)能不全疾病中，臨床上是需要調(diào)節(jié)血管生成，在此該目標(biāo)可能是刺激新血管形成，以便防止組織缺氧和細(xì)胞死亡。已經(jīng)開發(fā)了一個(gè)模型系統(tǒng)，其中用緩釋PLGA顆粒和質(zhì)粒DNA的制劑轉(zhuǎn)染兔的大血管中的修復(fù)細(xì)胞。修復(fù)細(xì)胞是存在的，因?yàn)檫@些兔血管帶有泡沫性細(xì)胞損傷(foam cell lesion)，模擬人類的臨床動脈粥樣硬化。本實(shí)驗(yàn)證明將標(biāo)記基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到大血管修復(fù)細(xì)胞中并在其中表達(dá)的能力。13. 1.材料和方法重3. 1-3. 5kg的任一性別的新西蘭白兔用于該研究。用肌內(nèi)給與氯胺酮(35/mg/ Kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉兔子，用通過邊緣靜脈靜脈內(nèi)給與氯胺酮(8mg/ml)維持麻醉。分離下行的主動脈杈和腹股溝韌帶之間的大約2cm的雙側(cè)髂動脈節(jié)段，近端系起來，并將該動脈節(jié)段的所有小分枝結(jié)扎。通過耳緣靜脈給與肝素(IOOmg)防止局部血栓形成。通過髂動脈切開術(shù)，將氣囊血管成形術(shù)導(dǎo)管O. Omm氣囊)導(dǎo)入髂動脈節(jié)段中，將氣囊于Satm 壓力下膨脹1分鐘。氣囊膨脹后，除去血管成形術(shù)導(dǎo)管，動脈內(nèi)注射20mg肝素，以防止遠(yuǎn)端血栓形成。用10. 0號絲線將髂動脈的兩端扎緊，在3分鐘內(nèi)，于0. 5atm下在每一髂動脈中灌注5mg/ml DNA納米顆粒懸浮液。將該傷口縫合。氣囊血管成形術(shù)和納米顆粒傳遞后2周時(shí)處死兔子。 通過一個(gè)垂直的下腹部切口，分離雙側(cè)髂動脈。切下兩側(cè)的2cm的髂動脈節(jié)段。取兔子的頸動脈作為對照樣品。將該組織保存于液氮中，以用于堿性磷酸酶分析。13. 2.結(jié)果磷酸酶表達(dá)分析的結(jié)果表明，納米顆粒加上DNA制劑能夠?qū)⒑怂醾鬟f到用氣囊導(dǎo)管損傷的成年兔子髂動脈中的修復(fù)細(xì)胞。髂右動脈和髂左動脈暴露于納米顆粒加上DNA制劑后，其磷酸酶活性為陽性。在對照主動脈中沒有檢測到磷酸酶活性。這些陽性結(jié)果表明， 暴露于基因活化基質(zhì)時(shí)，大血管中的修復(fù)細(xì)胞可以吸收并表達(dá)核酸分子。本發(fā)明不限于例舉的實(shí)施方案的范圍內(nèi)，這些實(shí)施方案是為了說明本發(fā)明的單個(gè)方面，任何功能相同的克隆、DNA或氨基酸序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除本領(lǐng)域技術(shù)人員從以上描述和附圖所見的之外可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改。這類修改將在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。也應(yīng)該理解，給出有關(guān)核苷酸的所有堿基對大小是大致的，用于說明目的。
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權(quán)利要求
1.一種將DNA分子轉(zhuǎn)移到哺乳動物修復(fù)細(xì)胞中的方法，其中所述DNA分子含有操作性連接基因產(chǎn)物編碼序列的啟動子，所述方法包括將含所述DNA分子的生物相容性基質(zhì)用于該機(jī)體的傷口處，使得遷移到所述傷口部位的修復(fù)細(xì)胞浸潤所述基質(zhì)，獲得所述DNA分子并在體內(nèi)表達(dá)所述DNA編碼的基因產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物相容性基質(zhì)為膠原材料、金屬、羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、純化蛋白或胞外基質(zhì)組合物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物相容性基質(zhì)為膠原。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述膠原為II型膠原。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)移的DNA編碼治療蛋白。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)移的DNA編碼生長因子。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)移的DNA多于一種DNA分子。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述生長因子為轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)或骨形態(tài)發(fā)生因子 (BMP)。
9.權(quán)利要求5的方法，其中所述治療蛋白為激素。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述激素為生長激素(GH)。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述激素為人甲狀旁腺激素(PTH)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述傷口部位為骨骨折部位。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述傷口部位為結(jié)締組織損傷部位。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述傷口部位為器官損害部位。
15.一種基因活化基質(zhì)，所述基因活化基質(zhì)包括含DNA分子的生物相容性基質(zhì)，所述 DNA分子具有操作性連接治療蛋白編碼序列的啟動子。
16.一種基因活化基質(zhì)，所述基因活化基質(zhì)包括含DNA分子的生物相容性基質(zhì)，所述 DNA分子具有操作性連接反義RNA編碼序列的啟動子。
17.—種基因活化基質(zhì)，所述基因活化基質(zhì)包括含DNA分子的生物相容性基質(zhì)，所述 DNA分子具有操作性連接生長因子編碼序列的啟動子。
18.權(quán)利要求17的基因活化基質(zhì)，其中所述生長因子為TGFi3、FGF、PDGF、IGF或BMP。
19.權(quán)利要求15的基因活化基質(zhì)，其中所述基質(zhì)含有一種以上的DNA分子。
20.權(quán)利要求16的基因活化基質(zhì)，其中所述基質(zhì)為膠原材料、金屬、羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、金屬材料、純化蛋白或胞外基質(zhì)組合物。
21.權(quán)利要求15的基因活化基質(zhì)，其中所述生物相容性基質(zhì)為膠原。
22.權(quán)利要求21的基因活化基質(zhì)，其中所述膠原為II型膠原。
23.—種試劑盒，所述試劑盒在合適的容器中包含基因活化基質(zhì)制劑。
24.一種試劑盒，所述試劑盒在合適的容器中包含一種生物相容性基質(zhì)制劑和一種編碼治療蛋白的DNA制劑。
25.一種制備DNA-基質(zhì)組合物的方法，所述方法包括將DNA分子與生物相容性基質(zhì)接觸，使得所述DNA非共價(jià)連接到所述基質(zhì)上。
全文摘要
本發(fā)明涉及在體內(nèi)DNA特異性地尋靶并轉(zhuǎn)移到哺乳動物修復(fù)細(xì)胞中的方法。所述轉(zhuǎn)移的DNA可以包括編碼感興趣治療蛋白的任何DNA。本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)哺乳動物修復(fù)細(xì)胞增殖并遷移到傷口部位，在此它們主動地吸收并表達(dá)DNA。本發(fā)明還涉及可以用于實(shí)施本發(fā)明以轉(zhuǎn)移感興趣DNA的藥用組合物。這類組合物包括與感興趣DNA聯(lián)用的任何合適的基質(zhì)。
文檔編號A61K38/27GK102274522SQ20111020337
公開日2011年12月14日 申請日期1997年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月12日
發(fā)明者J·邦納迪奧, S·A·戈?duì)柎奶?申請人:密執(zhí)安大學(xué)評議會