專利名稱：含有人生長(zhǎng)激素的藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有分子量大約為20,000的人生長(zhǎng)激素(下文稱作20k hGH)的藥物制劑，尤其涉及含有20k hGH的溶液凍干制劑，所述制劑具有極好的貯存穩(wěn)定性并且當(dāng)再配制時(shí)不產(chǎn)生任何外來物或不溶物，本發(fā)明還涉及所述制劑的生產(chǎn)方法。
有兩種已知類型的人生長(zhǎng)激素一種分子量大約為22,000(22khGH)，另一種分子量大約為20,000(20k hGH)。22khGH可通過重組DNA技術(shù)的方法來生產(chǎn)并可用于治療兒科垂體性侏儒。20k hGH尚未在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)并且它尚未用于醫(yī)學(xué)治療中。
20k hGH是單鏈多肽，其分子量大約為20,000并且其等電點(diǎn)大約為5.5。因此，它在中性PH的水溶液中是穩(wěn)定的，但在酸性和堿性PH范圍是不穩(wěn)定的。在弱酸至弱堿PH范圍的水溶液中，20k hGH的溶解度小于大約1mg/ml并且當(dāng)它從冷凍溶液中解凍時(shí)產(chǎn)生不溶性物質(zhì)。因此，可認(rèn)為20k hGH是具有很低溶解度的蛋白質(zhì)。此外，在弱酸至弱堿PH范圍的水溶液中，20k hGH容易聚合成二聚物。據(jù)報(bào)道，由人類垂體產(chǎn)生的20k hGH通常與22k hGH，即分子量大約為22,000的人生長(zhǎng)激素共聚或聚合成二聚物(chapman等，J.Biol.chem.，Vol.256，2395-2401，1981)。這些事實(shí)表明20k hGH的溶解度低是由蛋白質(zhì)分子的疏水性相互作用引起的。
為了改善高度疏水蛋白質(zhì)的溶解性，通常使用十二烷基硫酸鈉(它是一種極強(qiáng)的表面活性劑)或變性劑(如尿素和鹽酸胍)等。然而，這些試劑破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并且將失去或減弱蛋白質(zhì)的主要功能。所以，如果蛋白質(zhì)用在藥物制劑中時(shí)，使用這些常規(guī)試劑根本就是不合適的。
另一方面，使用溶解度促進(jìn)劑來改善蛋白質(zhì)溶解度的一個(gè)已知的例子是，加入等摩爾量的組氨酸和肌酸酐(具有正電荷)和檸檬酸(具有負(fù)電荷)來改善修飾形式的組織纖維蛋白溶媒原激活劑(下文稱作tPA)(USP4980165)的溶解度。tPA和修飾的tPA是在中性PH范圍時(shí)極難溶解而在酸性PH范圍時(shí)易于溶解的蛋白質(zhì)。換句話說，tPA和修飾的tPA的低溶解度是由該蛋白質(zhì)的等電沉淀引起的，通過加入組氨酸和肌酸酐(具有正電荷和檸檬酸(具有負(fù)電荷)來抑制。
含有分子量約為22000的人生長(zhǎng)激素的藥物制劑的配方(現(xiàn)在可以購得的)顯示在表1中。這些制劑通常通過皮下或肌內(nèi)給藥。
而且，這些22k hGH制劑主要含有甘氨酸或甘露糖醇并可在5℃的儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定1年。
表1可購得凍干22k hGH的配方產(chǎn)品名稱添加劑 重新配制的溶液Genotropin(Kabi Pharmacia4IU 甘氨酸24mg注射用水1mlSumitomo)Norditropin(Nordisk) 4IU 甘氨酸24mg注射用水1mlD-甘露糖醇2.4mgHumatrope(Lilly) 4IU 甘氨酸1.48mg 鹽水2mlD-甘露糖醇7.4mgSaizen(Serono) 4IU D-甘露糖醇20mg鹽水1mlGroject(Bio-Tech 4IU D-甘露糖醇40mg鹽水1mlGeneral)本發(fā)明人的研究表明，當(dāng)如上制備凍干20k hGH制劑時(shí)不能得到穩(wěn)定的制劑。
如果不能獲得用于制備如上所給予制劑的足夠濃度的20k hGH穩(wěn)定水溶液，那么，劑量不得不增加。這對(duì)于注射20k hGH制劑來說可能是極為不便的。
一些穩(wěn)定溶液中22k人生長(zhǎng)激素的配合方法是已知的。報(bào)告的實(shí)例包括加入作為22k hGH水溶液穩(wěn)定劑的精氨酸和EDTA(EP公開號(hào)639984)，加入多元醇或氨基酸以便控制不溶物質(zhì)的產(chǎn)生并維持22k hGH溶液中可溶物質(zhì)的活性(EP303746)以及加入作為穩(wěn)定劑的組氨酸以便抑制22k hGH水溶液中相關(guān)物質(zhì)的增加(EP公開號(hào)618807)。然而，所有這些方法都用于使溶液中的22k hGH穩(wěn)定，而沒有涉及使凍干的22k hGH產(chǎn)品穩(wěn)定。而且，關(guān)于穩(wěn)定20k hGH的凍干制劑是未知的。
本發(fā)明人研究了20k hGH的溶解性和穩(wěn)定性。如表2所示，該結(jié)果顯示除了分子量比22k hGH低之外，20k hGH在理化特性(如生理活性、穩(wěn)定性和溶解性)上與22k hGH是十分不同的。特別是，原始20k hGH本體溶液即使在凍干之后也是不穩(wěn)定的。當(dāng)其凍干制劑在5℃溫度下貯存時(shí)，相關(guān)物質(zhì)的量隨時(shí)間而增加，如脫酰氨基變種(其中20khGH中的Asp134脫酰氨基成Asp134)和亞砜變種(其中Met14轉(zhuǎn)化為ox-Met14)和高分子量聚合物產(chǎn)物。相關(guān)的物質(zhì)如單脫酰氨基變種(其中20k hGH中的Asn134脫酰氨基為Asp134)、二脫氨基變種(其中除Asn134之外，Asn137也被脫去酰氨基)和亞砜變種(其中Met14轉(zhuǎn)化為ox-Met14)。而且，在操作(如吸移)溶有20k hGH的溶液時(shí)，蛋白質(zhì)易于凝集而產(chǎn)生不溶性物質(zhì)。換句話說，水溶液的穩(wěn)定性是低的。如下文所述，即使將堿性氨基酸加到20k hGH中，也不能抑制不溶性物質(zhì)或相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生。如上文所述，20k hGH是高度疏水的，這可以解釋為什么它比22k hGH更易于產(chǎn)生不溶性物質(zhì)。
表220k hGH與22k hGH在理化性質(zhì)上的區(qū)別理化性質(zhì) 20k hGH 22k hGH等電點(diǎn) PH5.51PH5.11二聚物的形成 易于形成2難以形成2疏水性 高3低3水溶性 低3高3凍干hGH的穩(wěn)定性 低3高3溶解的hGH的穩(wěn)定性低3高31Endocrine Reviews，第12卷，314-324，1991。2J.Biol.Chem.第256卷，2395-2401，1981。3由本發(fā)明人獲得的數(shù)據(jù)。
如上文所述，簡(jiǎn)單地通過應(yīng)用常規(guī)的22k hGH配合制劑來獲得以溶解和穩(wěn)定形式維持20k hGH生理活性的溶液是非常困難的。因此，十分需要開發(fā)新的配合配方，它是穩(wěn)定的20k hGH藥物制劑，并保持合適的注射濃度。
而且，因?yàn)閮H凍干20k hGH不能防止相關(guān)物質(zhì)和高分子量聚合產(chǎn)物的產(chǎn)生，需要開發(fā)含有20k hGH的穩(wěn)定的凍干藥物制劑，它很少產(chǎn)生相關(guān)物質(zhì)或高分子量聚合物。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含有20k hGH的且溶于水時(shí)很少產(chǎn)生由20k hGH衍生的不溶性物質(zhì)的藥物制劑。本發(fā)明的另一目的是提供含有20k hGH的凍干制劑，它抑制重組之后相關(guān)物質(zhì)和高分子量聚合產(chǎn)物的產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一目的是提供一種方法，該方法可防止含有20k hGH的藥物制劑中20k hGH的不溶解化，以便改善其穩(wěn)定性，而且也提供一種抑制含有20k hGH的凍干制劑中隨時(shí)間而產(chǎn)生相關(guān)物質(zhì)和高分子量聚合產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛的研究來完成上文所述的目的，也就是說，改善了20k hGH的溶解性和穩(wěn)定性并提供了凍干時(shí)穩(wěn)定的20k hGH制劑的配合配方。其結(jié)果是，本發(fā)明人成功地制備了含有20k hGH的藥物制劑，它具有極好的溶解性和穩(wěn)定性。
而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將堿性氨基酸和非離子表面活性劑加到含有20khGH的凍干制劑中時(shí)，可抑制凍干制劑中相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生改善了穩(wěn)定性，這樣，當(dāng)在水中進(jìn)行重新配制時(shí)，所述凍干制劑不產(chǎn)生任何不溶性物質(zhì)，因此完成了本發(fā)明。
也就是，本發(fā)明包括含有具有大約20000分子量的人生長(zhǎng)激素或其衍生物和水溶性雜環(huán)化合物的藥物制劑；通過加入水溶性雜環(huán)化合物來防止分子量約為20000的人生長(zhǎng)激素或其衍生物的不溶解化的方法，從而改善了含有所述人生長(zhǎng)激素或其衍生物的藥物制劑的穩(wěn)定性；以及通過加入一種或兩種堿性氨基酸或其鹽和非離子表面活性劑來抑制含有分子量約為20000的人生長(zhǎng)激素或其衍生物的凍干制劑中相關(guān)物質(zhì)隨時(shí)間的產(chǎn)生的方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過將水溶性雜環(huán)化合物(如肌酸酐)以一定濃度加到20k hGH制劑中可改善20k hGH的溶解度，所述制劑中所用的常用于生理物質(zhì)的緩沖溶液不會(huì)提供足夠濃度的用作藥物制劑的20k hGH。
而且，通過控制水性20k hGH的PH值，防止極少量不溶性物質(zhì)的產(chǎn)生是可能的。也發(fā)現(xiàn)，通過加入非離子表面活性劑(如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80*)可改善解凍時(shí)溶液的穩(wěn)定性，而且，通過加入堿性氨基酸和甘露糖醇(一種糖醇)可改善凍干制劑和在重新配制時(shí)的穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)能夠容易地來大量生產(chǎn)含有凍干20k hGH的藥物制劑，該制劑可被重新配制來制成適于注射的水溶液。
本發(fā)明的生長(zhǎng)激素是具有大約20000分子量的人生長(zhǎng)激素(20khGH)并且所述人生長(zhǎng)激素可以是一種天然激素或一種通過重組DNA技術(shù)的方式獲得的激素。
*聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80(Polysorbate 80)在技術(shù)字典中譯為縮聚山梨醇油酸酯80。以下均同。
本發(fā)明20k hGH的實(shí)例包括那些具有下文所示氨基酸序列的(即，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)；然而，在SEQID NO1和SEQ ID NO2的整個(gè)氨基酸序列中有一個(gè)或幾個(gè)不同的氨基酸的那些20k hGH也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要所得20khGH保留其生理特性。SEQ ID NO1Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr35 40 45Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu50 55 60Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val65 70 75Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala80 85 90Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly95 100 105Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr110 115 120Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser125 130 135His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys140 145 150Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val155 160 165Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe170 175SEQ ID NO2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr35 40 45Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu50 55 60Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val65 70 75Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala80 85 90Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly95 100 105Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr110 115 120Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser125 130 135His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Ash Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys140 145 150Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val155 160 165Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe170 175
本發(fā)明含20k hGH藥物制劑中，在凍干之前，所含20k hGH的濃度為0.5到10.0mg/ml，優(yōu)選1.0到3.0mg/ml，更優(yōu)選1.5到2.5mg/ml。而且，在凍干制劑的重新配制溶液中20khGH的有效濃度低于10mg/ml。
本發(fā)明含20k hGH的藥物制劑含有水溶性雜環(huán)化合物，以便改善所制備的溶液中和重新配制的凍干溶液中20k hGH的溶解性。本發(fā)明所使用的水溶性雜環(huán)化合物為一種或多種選自肌酸酐、乙酰色氨酸的鹽(如乙酰色氨酸鈉)和煙酰胺的化合物；然而，肌酸酐是優(yōu)選的。制備的溶液或重新配制凍干制劑的溶液中所述水溶性雜環(huán)化合物的濃度為0.1％到10％，優(yōu)選0.3％到5％。
本發(fā)明含20k hGH的藥物制劑的PH值為5到8，優(yōu)選6.0到7.8，更優(yōu)選6.5到7.6。
當(dāng)需要調(diào)節(jié)PH時(shí)，可使用簡(jiǎn)單的PH調(diào)節(jié)劑，如鹽酸、磷酸和硫酸，或使用緩沖溶液如三(羥甲基)氨基甲烷，磷酸，馬來酸，琥珀酸，檸檬酸，乙酸，組氨酸或其鹽。磷酸或其鹽是優(yōu)選的。所述緩沖劑的濃度為0.1mM到100mM，優(yōu)選5mM到50mM。
可用于本發(fā)明含20k hGH凍干制劑的堿性氨基酸如賴氨酸、組氨酸、精氨酸或其鹽。所加入的堿性氨基酸的量為1-20重量份(與1重量份的20k hGH相比)，優(yōu)選為2-15重量份。
而且，本發(fā)明含20k hGH的東干制劑可含有非離子表面活性劑來改善所述凍干制劑重新配制后20k hGH的穩(wěn)定性。本發(fā)明所使用的非離子表面活性劑為聚氧乙烯聚氧丙烯二醇和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯20*或聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80。聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯20或/和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80是優(yōu)選的。聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80是更優(yōu)選的。重新配制凍干制劑的溶液中非離子表面活性劑的濃度為0.02％-1％，優(yōu)選0.02％-0.2％。
此外，本發(fā)明含20k hGH的凍干制劑可與賦形劑配合來改善凍干后塊狀物的外觀。賦形劑的例子是糖醇，如甘露糖醇。在重新配制的凍干制劑的溶液中，所述賦形劑的濃度為0.1％-5％，優(yōu)選為0.5％-2％。
*聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯20(Polysorbate 20)在技術(shù)字典中譯為吐溫20。以下均同。
在將稀釋的20k hGH溶液加到用上述水溶性雜環(huán)化合物補(bǔ)充的水溶液中之后，可調(diào)節(jié)本發(fā)明藥物制劑的PH值。
而且，優(yōu)選將本發(fā)明藥物制劑轉(zhuǎn)化為凍干產(chǎn)物。對(duì)產(chǎn)生凍干制劑的方法和條件沒有限制。例如，通過將稀釋的20k hGH溶液加到用上述水溶性雜環(huán)化合物補(bǔ)充的水溶液中，并且可以加入或不加入特定量的堿性氨基酸、非離子表面活性劑和賦形劑，如果需要，調(diào)節(jié)PH，在-30℃到-80℃下冷凍所得混合物，然后通過常規(guī)方法減壓干燥來進(jìn)行凍干。
此外，本發(fā)明的藥物制劑用于注射時(shí)，可用合適的注射用水或含有滲透壓調(diào)節(jié)劑(如氯化鈉或葡萄糖或糖醇)的溶液來重新配制凍干溶液。
通過下列實(shí)施例將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，然而，本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1加入肌酸酐對(duì)20k hGH溶解性的影響通過重組DNA技術(shù)制備實(shí)施例1-9中使用的20k hGH。更具體來說，按照美國(guó)專利5496713所述方法，使用轉(zhuǎn)化細(xì)胞菌株MT-10765(根據(jù)布達(dá)佩斯條約以登記號(hào)FERM BP-5020保藏在theNational Institute of Bioscienceand Human-Technology of the Agencyof Industrial Science & Technologyof the Ministry of InternationalTrade and Industry；保藏日期為1995年2月28日)制備。也就是，將載有編碼20k hGH的基因的表達(dá)和分泌質(zhì)粒引入大腸桿菌中，并在含有polypeptone、酵母提取物，甘油等的培養(yǎng)基培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞MT-10765。培養(yǎng)完成后，離心收集細(xì)菌細(xì)胞并通過滲透震蕩(osmotic shock)法使細(xì)胞外膜破裂來回收胞質(zhì)部分。按照已知的方法或其改進(jìn)的方法從胞質(zhì)中分離和純化20k hGH。
將尿素加到含有0.2mg/ml-0.4mg/ml的如上獲得的20k hGH水溶液中，并將混合物濃縮到約8mg/ml。將所得濃縮溶液分部分分別加到過濾柱上，所述各柱分別是用含有0％，0.3％(27.8mM)，0.6％(55.5mM)，1.25％(11.1mM)，2.5％(221mM)和5％(442mM)濃度肌酸酐的20mM磷酸鈉緩沖液(PH6.5)平衡的。通過凝膠過濾除去尿素并通過用含有上文所述各濃度的肌酸酐的20mM磷酸鈉緩沖液置換來洗脫純化部分。測(cè)量各純化部分的蛋白質(zhì)的濃度并肉眼評(píng)價(jià)各部分溶液外觀的改變。加入肌酸酐的效果顯示在表3中。由表3結(jié)果可證明，溶液中的肌酸酐改善了20k hGH的溶解性。而且經(jīng)凝膠過濾獲得的純化部分中20k hGH濃度隨肌酸酐濃度的增加而增加。對(duì)本發(fā)明所使用的其它雜環(huán)化合物(即乙酰色氨酸鈉和煙酰胺)的評(píng)價(jià)表明它們具有與肌酸酐相似的效果。
此外，當(dāng)使用由轉(zhuǎn)化細(xì)胞MT-10712(根據(jù)布達(dá)佩斯條約以登記號(hào)FERM BP-4361保藏在the National Insti-tute of Bioscience and Human-Techno-logy of thd Agency of IndustrialScience & Technology of the Ministryof International Trade and Indus-try；保藏日期為1993年7月14)獲得的20k hGH按與上文相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)獲得了類似的效果。
這些結(jié)果顯示未加入等摩爾量的負(fù)電荷化合物時(shí)，加入肌酸酐是有效的。這表明加入肌酸酐而影響20k hGH的溶解性不是通過防止等電沉淀引起的。
表3加入肌酸酐對(duì)20k hGH溶解性的影響溶液中肌酸酐 由凝膠過濾純化的部分的濃度(％)溶液外觀 濃度(mg/ml)0 + 未測(cè)量0.3- 2.90.6- 3.11.25 - 4.12.5- 4.55.0- 4.8注+產(chǎn)生沉淀；-澄清。實(shí)施例2加入聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80對(duì)冷凍/解凍之后20k hGH水溶液的溶液外觀的影響將聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80(商品名稱吐溫80)分別以0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1和0.2％的濃度加到上文表3所示的含有1.25％(111mM)肌酸酐的20k hGH溶液中。在由透明玻璃制造的四面容器中于6000勒克斯熒光燈下肉眼觀察各個(gè)20k hGH溶液在冷凍前和解凍后的改變。所使用的20k hGH的濃度約為2mg/ml。加入聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80的效果顯示在表4中。結(jié)果揭示，以大于0.02％的濃度加入聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80可防止因冷凍和解凍所引起的20k hGH產(chǎn)生少量不溶性物質(zhì)，從而證明了該溶液可保持穩(wěn)定。
表4加入聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80對(duì)冷凍/解凍之后20k hGH溶解性的影響溶液中聚氧乙烯山梨 20k hGH水溶液冷凍前和解凍醇脂肪酸酯80的濃度 后溶液外觀的變化冷凍前 解凍后0 - ++0.005 - +0.01 - +0.02 - -0.05 - -0.1 - -0.2 - -注-透明；+略有不溶性物質(zhì)；++有明顯的不溶性物質(zhì)。實(shí)施例3加入甘露糖醇對(duì)20k hGH凍干塊和重新配制后的溶液的外觀的影響將甘露糖醇作為賦形劑以0、1.0和5.0％的濃度加到20k hGH的水溶液中，該溶液分別含有如表4所示的0.05％和0.2％濃度的聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80和1.25％(111mM)濃度的肌酸酐。將混合物分裝到各個(gè)小瓶中，將其從5℃冷卻到-40℃，并在-40℃下冷凍5小時(shí)。然后在減壓下，將溫度從-40℃升高到-25℃，此后，在-25℃下再將小瓶減壓干燥60小時(shí)。接著，減壓下將溫度升至15℃，在此溫度下，將小瓶干燥6小時(shí)。觀察所得凍干塊的外觀之后，將1ml注射用蒸餾水加到各個(gè)塊中，在6000勒克斯的熒光燈下觀察重新配制溶液的外觀。加入甘露糖醇的效果顯示在表5中。表5結(jié)果顯示，通過加入甘露糖醇改善了凍干塊的外觀和易成型性。而且，證明重新配制的溶液是極好的，沒有不溶性物質(zhì)。
表5加入甘露糖醇對(duì)20k hGH凍干制劑和重新配制后的溶液的外觀的影響溶劑組成物 凍干塊的外觀重新配制后的濃度(％) 溶液的外觀肌酸酐吐溫80甘露糖醇1.250 0△ ++1.250.05 0○ -1.250.05 1.0 ◎ -1.250.05 5.0 ◎ -1.250.20○ -1.250.21.0 ◎ -1.250.25.0 ◎ -注-透明；+有少量的不溶物；++有明顯可見的不溶物；△稍差；○好；◎極好。實(shí)施例4加入堿性氨基酸和/或甘露糖醇對(duì)20k hGH凍干制劑重新配制后產(chǎn)生不溶性物質(zhì)的影響制備含有2mg/ml 20k hGH、特定量堿性氨基酸或其鹽酸鹽、1.25％(111mM)肌酸酐、2.5％甘露糖醇和0.05％聚氧乙烯山梨醇酯肪酸酯80的水溶液并用磷酸二氫鈉和氫氧化鈉將PH調(diào)節(jié)到7.6。然后，按每份1ml，將溶液分裝到小瓶中，并從5℃冷卻到-40℃，在-40℃下冷凍5小時(shí)。然后在減壓下，將溫度從-40℃升高到-25℃，此后再將小瓶在-25℃下減壓干燥60小時(shí)。接著，減壓下，將溫度升高到15℃，并在此溫度下將小瓶干燥6小時(shí)。用1ml注射用蒸餾水重新配制所得凍干的制劑并在5℃下貯存7天。在6000勒克斯的熒光燈下觀察第0天和7天時(shí)溶液的狀態(tài)。結(jié)果顯示在表6中。
表6堿性氨基酸對(duì)溶液中不溶性物質(zhì)產(chǎn)生的影響堿性氨基酸/甘溶液的狀態(tài)露糖醇加入的量(mg) pH0天7天氨基酸- 0 6.5 - +- 0 7.6 - -鹽酸精氨酸 4.2 7.6 - +鹽酸精氨酸 6.0 7.6 - +鹽酸精氨酸+甘露糖醇4.2 7.6 - -鹽酸精氨酸+甘露糖醇6.0 7.6 - -組氨酸 6.0 7.6 - +鹽酸賴氨酸 6.0 7.6 - +注-透明；±很少有不溶性物質(zhì)；+略有不溶性物質(zhì)；++明顯有不溶性物質(zhì)。
如表6顯示，堿性氨基酸不抑制20k hGH溶液中不溶性物質(zhì)的產(chǎn)生，相反具有有害的作用。這些結(jié)果證明，通過加入甘露糖醇和控制PH可抑制產(chǎn)生不溶性物質(zhì)。實(shí)施例5加入堿性氨基酸對(duì)20k hGH凍干制劑重新配制后的溶液中相關(guān)物質(zhì)增加的影響除了將含有20k hGH的水溶液的PH調(diào)節(jié)到7.6外，按實(shí)施例4所述的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過液相色譜定性測(cè)量第0天和7天的相關(guān)物質(zhì)(脫酰氨基變種和亞砜變種)。結(jié)果顯示在表7中。
表7堿性氨基酸對(duì)相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生的影響加入的堿性氨基酸 相似物質(zhì)(％)氨基酸加入的量pH 0天7天增加(mg)-07.65.15.40.3鹽酸精氨酸 4.2 7.65.15.50.4鹽酸精氨酸 6.0 7.65.15.50.4組氨酸 6.0 7.65.25.50.3鹽酸賴氨酸 6.0 7.65.25.60.4如表7所示，加入堿性氨基酸沒有作用，其既不增加也不減少溶液中相關(guān)物質(zhì)的量。實(shí)施例6加入精氨酸和鹽酸精氨酸對(duì)增加20k hGH凍干制劑中相關(guān)物質(zhì)的影響制備各個(gè)含有2mg/ml 20k hGH、特定量精氨酸或鹽酸精氨酸、1.25％(111mM)肌酸酐、0.05％聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80的水溶液并用磷酸氫二鈉和氫氧化鈉將PH調(diào)節(jié)到7.6。然后，按每份1ml，將溶液分裝到小瓶中，并從5℃冷卻到-40℃，在-40℃下冷凍5小時(shí)。然后在減壓下，將溫度從-40℃升高到-25℃，此后再將小瓶在-25℃下減壓干燥60小時(shí)。接著，減壓下，將溫度升高到15℃，并在此溫度下將小瓶干燥6小時(shí)。將所得凍干制劑在40℃下貯存2周。通過液相色譜測(cè)量第0天和2周時(shí)相關(guān)物質(zhì)的濃度。結(jié)果顯示在表8中。
如表8所示，加入精氨酸或鹽酸精氨酸可抑制相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生。
表8加入精氨酸或鹽酸精氨酸對(duì)凍干制劑中相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生的影響堿性氨基酸類似物(％)氨基酸 加入量(mg) 0天2周后增加- 03.910.7 6.8鹽酸精氨酸1.05 3.77.0 3.3鹽酸精氨酸4.20 3.85.6 2.2鹽酸精氨酸6.00 3.75.5 1.8鹽酸精氨酸26.7 7.68.2 0.6精氨酸4.96 3.97.0 3.1實(shí)施例7加入鹽酸賴氨酸和組氨酸對(duì)20k hGH凍干制劑中相關(guān)物質(zhì)增加的影響制備各個(gè)含有2mg/ml 20k hGH、特定量鹽酸賴氨酸或組氨酸、1.25％肌酸酐、0.05％聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80的水溶液并用磷酸氫二鈉和氫氧化鈉將PH調(diào)節(jié)到7.6。然后，按每份1ml，將溶液分裝到小瓶中，并從5℃冷卻到-40℃，在-40℃下冷凍5小時(shí)。然后在減壓下，將溫度從-40℃升高到-25℃，此后再將小瓶在-25℃下減壓干燥60小時(shí)。接著，減壓下，將溫度升高到15℃，并在此溫度下將小瓶干燥6小時(shí)。將所得凍干制劑在40℃下貯存2周。通過液相色譜測(cè)量第0天和2周時(shí)相關(guān)物質(zhì)的濃度。結(jié)果顯示在表9中。
如表9所示，加入堿性氨基酸及其鹽(即組氨酸和鹽酸賴氨酸)傾向于以上述精氨酸和鹽酸精氨酸的相同方式抑制相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生。
表9加入堿性氨基酸對(duì)凍干制劑中相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生的影響堿性氨基酸 相關(guān)物質(zhì)(％)氨基酸 加入量(％)0天2周后增加- 0 3.910.7 6.8組氨酸 4.43.85.8 2.0鹽酸精氨酸 5.23.95.6 1.8實(shí)施例8加入堿性氨基酸對(duì)20k hGH凍干制劑中高分子量聚合物產(chǎn)生增加的影響制備各個(gè)含有2mg/ml 20k hGH、特定量堿性氨基酸、1.25％肌酸酐、0.05％聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80的水溶液并用磷酸氫二鈉和氫氧化鈉將PH調(diào)節(jié)到7.6。然后，按每份1ml，將溶液分裝到小瓶中，并從5℃冷卻到-40℃，在-40℃下冷凍5小時(shí)。然后在減壓下，將溫度從-40℃升高到-25℃，此后再將小瓶在-25℃下減壓干燥60小時(shí)。接著，減壓下，將溫度升高到15℃，并在此溫度下將小瓶干燥6小時(shí)。將所得凍干制劑在40℃下貯存2周。通過電泳(SDS-PAGE)測(cè)量0天和2周后高分子量聚合物的濃度。也就是，用注射用水溶解小瓶中的凍干制劑并在沸水浴上，在有或沒有還原劑(巰基乙醇)下加熱3分鐘。將各個(gè)樣品溶液加到(每孔10μl)電泳用聚丙烯酰胺梯度凝膠中，以恒電流進(jìn)行后續(xù)銀染色。結(jié)果顯示在表10中。
如表10所示，加入堿性氨基酸可抑制高分子量聚合物產(chǎn)物的產(chǎn)生。
表10加入堿性氨基酸對(duì)凍干制劑中高分子量聚合物產(chǎn)生的影響堿性氨基酸 高分子量聚合產(chǎn)物(2周后)氨基酸 加入量(mg) 未還原 還原無 0+++ ++鹽酸精氨酸 2.1 ++ +鹽酸精氨酸 4.20 +±鹽酸精氨酸 6.00 ± -鹽酸精氨酸 26.7 --精氨酸 6.0 +±鹽酸賴氨酸 5.2 +±組氨酸 4.4 +±在SDS-PAGE上高分子量聚合產(chǎn)物的色帶+++濃色；++清晰的顏色；+有色；±略有顏色；-無色。實(shí)施例920k hGH凍干制劑將含有20k hGH(2mg/ml)、肌酸酐(1.25％，111mM)和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80(0.05％)的溶液(560ml)(保持冷凍)在流動(dòng)水中解凍并濾過0.22μm濾器。將15g D-甘露糖醇和5.52g鹽酸精氨酸加到510ml的該濾液中，并用攪棒在冰上溶解。等大約14ml的0.5N的氫氧化鈉溶液加到在冰上的溶液中來調(diào)節(jié)PH到7.6，此后加入純水使總量精確到600ml。使用注射小瓶分裝器，按每份1ml，將該溶液分裝到2ml玻璃小瓶中，然后凍干。為此，將瓶架溫度迅速從5℃降到-40℃，并在-40℃下初步冷凍5小時(shí)，此后，將小瓶在-25℃的瓶架溫度下減壓干燥50小時(shí)。接著，減壓下將瓶架溫度保持在15℃，然后將小瓶干燥6小時(shí)來獲得凍干制劑。所得凍干制劑的塊狀物具有好的特性，并且用注射用蒸餾水重新配制時(shí)獲得透明溶液。將凍干制劑在40℃溫度下貯存2個(gè)月。貯存期間，評(píng)價(jià)塊狀物和重新配制后溶液在外觀上的變化，并測(cè)量相關(guān)物質(zhì)的量。結(jié)果顯示在表11中。
結(jié)果證明，該凍干制劑具有好的外觀，不產(chǎn)生不溶性物質(zhì)，可抑制相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生并含有穩(wěn)定的20k hGH，甚至在長(zhǎng)期貯存之后。
表11凍干制劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)外觀 重新配制溶液的外觀和相關(guān)物質(zhì)(％)0天 好透明3.94周后好透明5.68周后好透明6.權(quán)利要求
1.一種藥物制劑，含有分子量約為20000的人生長(zhǎng)激素或其衍生物和水溶性雜環(huán)化合物。
2.權(quán)利要求1的藥物制劑，其中水溶性雜環(huán)化合物為至少一種選自肌酸酐、乙酰色氨酸的鹽和煙酰胺的化合物。
3.權(quán)利要求1或2的藥物制劑，其中制劑水溶液的PH值為5到8。
4.權(quán)利要求3的藥物制劑，其中通過PH調(diào)節(jié)劑或緩沖劑來控制水溶液的PH值。
5.權(quán)利要求3的藥物制劑，其中制劑為含有1或2種堿性氨基酸或其鹽和非離子表面活性劑的凍干制劑。
6.權(quán)利要求5的藥物制劑，其中該制劑每重量份的分子量約為20000的人生長(zhǎng)激素含有1到20重量份的堿性氨基酸或其鹽。
7.權(quán)利要求6的藥物制劑，其中非離子表面活性劑為聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯20和/或聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80。
8.權(quán)利要求5的藥物制劑，其中該制劑含有賦形劑。
9.權(quán)利要求8的藥物制劑，其中賦形劑為糖醇。
10.一種通過將水溶性雜環(huán)化合物加到含有所述人生長(zhǎng)激素或其衍生物制劑中來防止分子量約為20000的人生長(zhǎng)激素或其衍生物不溶解化并改善穩(wěn)定性的方法。
11.權(quán)利要求10的方法，其中水溶性雜環(huán)化合物為至少一種選自肌酸酐、乙酰色氨酸的鹽和煙酰胺的化合物。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中制劑水溶液的PH值為5-8。
13.一種通過加入1或2種堿性氨基酸或其鹽和非離子表面活性劑來抑制含有分子量約為20000的人生長(zhǎng)激素或其衍生物凍干制劑隨時(shí)間產(chǎn)生相關(guān)物質(zhì)的方法。
14.權(quán)利要求13的方法，其中制劑含有賦形劑。
全文摘要
通過加入水溶性雜環(huán)化合物(如肌酸酐、乙酰色氨酸的鹽和煙酰胺)來防止水溶液中的人生長(zhǎng)激素或其衍生物不溶解化可配制含有分子量約為20000的人生長(zhǎng)激素或其衍生物的穩(wěn)定的藥物制劑。
文檔編號(hào)A61K47/18GK1165034SQ9710496
公開日1997年11月19日 申請(qǐng)日期1997年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月2日
發(fā)明者小林英樹, 青木美穗子, 內(nèi)田博司, 楠原信海, 深山裕喜雄, 伊藤照夫, 福原彰, 佐藤勉 申請(qǐng)人:三井東壓化學(xué)株式會(huì)社