專利名稱：一種脫細胞羊膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脫細胞羊膜的制備方法，尤其是一種醫(yī)療器械敷料脫細胞羊膜的制備方法。
背景技術(shù)：
羊膜為胎盤胎膜的一部分，表面光滑透明，無血管、淋巴和神經(jīng)系統(tǒng)，羊膜可細分為上皮細胞層、基底膜、透明層和膠原纖維層。羊膜基底膜較厚、韌性強，不但具有支架作用，而且含有層黏連素、纖維黏連素、IV型膠原及大量硫酸乙酰肝素蛋白多糖，以及其它一些蛋白多糖大分子和神經(jīng)營養(yǎng)因子。羊膜組織相容性好、易于取材，能抗粘連、抗感染并保護創(chuàng)面，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于眼科、燒傷、腹腔和盆腔手術(shù)中。目前國內(nèi)臨床應(yīng)用的羊膜類材料主要有新鮮羊膜、-80°C深冷保存羊膜、凍干羊膜。新鮮羊膜保留了羊膜上皮細胞，由于抗原成分復(fù)雜，因此免疫原性高于脫細胞羊膜，新鮮羊膜中的各種活性成份是否會對接觸局部組織有影響還有待于進一步研究，而且新鮮羊膜保存期短、運輸不便無法滿足臨床需求。目前脫細胞羊膜的制備方法主要有酶消化法、細胞刮除法、超生處理法、低滲裂解法、化學(xué)去垢劑法等。細胞刮除法和超生法等機械脫細胞方法存在的問題是容易破壞羊膜結(jié)構(gòu)的完整性或有細胞殘留。酶消化法脫細胞條件強烈，必須嚴格控制控制脫細胞條件和時間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種簡便有效的脫細胞羊膜制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種脫細胞羊膜的制備方法， 將廢棄的胎盤以4°C預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗干凈，以鈍性分離將羊膜從胎盤上剝離下來， 剪成規(guī)則形狀，保持上皮面朝上平鋪于硝酸纖維素膜上，將羊膜片浸泡處理于低滲TBS浸泡液，4 V -8 V ；20-22小時后，將羊膜片轉(zhuǎn)移至TBS-SDS溶液中，15°C -22°C旋轉(zhuǎn)；24小時后，羊膜片經(jīng)PH 7.6TBS溶液洗滌3次，轉(zhuǎn)移至核酸降解溶液中，25-37°C核酸降解處理3-10 小時，pH 7. 6TBS溶液洗滌3次，脫細胞-核酸降解處理后的羊膜片經(jīng)過冷凍干燥、包裝和輻照滅菌后常溫保存。所述低滲TBS浸泡液含IOmM Tris, pH8. 0,0. 1% w/v EDTA和蛋白酶抑制劑 Aprotinin 10KIU/mL。所述TBS-SDS 溶液含 IOmM Tris,pH7. 6,0. 03% w/v SDS,0. 1% w/v EDTA，蛋白酶抑制劑 aprotinin 10KIU/mL。所述核酸降解溶液含50U/mL DNAase, lU/mL RNAase,50mM Tris-HCl，IOmM 氯化鎂，50mg/mL BSA, ρΗ7· 5。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的脫細胞羊膜制備方法，脫細胞條件溫和，去除細胞徹底無核酸殘留，保留了羊膜的結(jié)構(gòu)的完整與蛋白成分，使其成為不會引起人體免疫應(yīng)答的天然組織材料。處理后的羊膜潔白、透明、有張力、堅韌可縫合，經(jīng)過冷凍干燥、包裝和輻照滅菌后，脫細胞羊膜的保存期延長，可大規(guī)模批量生產(chǎn)以滿足臨床應(yīng)用。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明加以詳細說明一種脫細胞羊膜的制備方法，將廢棄的胎盤以4°C預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗干凈，以鈍性分離將羊膜從胎盤上剝離下來，剪成規(guī)則形狀，保持上皮面朝上平鋪于硝酸纖維素膜上，將羊膜片浸泡處理于低滲TBS浸泡液，4°C -8°C ；20-22小時后，將羊膜片轉(zhuǎn)移至 TBS-SDS溶液中，15°C _22°C旋轉(zhuǎn)小時后，羊膜片經(jīng)pH 7. 6TBS溶液洗滌3次，轉(zhuǎn)移至核酸降解溶液中，25-37°C核酸降解處理3-10小時，pH 7. 6TBS溶液洗滌3次，脫細胞-核酸降解處理后的羊膜片經(jīng)過冷凍干燥、包裝和輻照滅菌后常溫保存。所述低滲TBS浸泡液含IOmM Tris, pH8. 0,0. 1 % w/v EDTA和蛋白酶抑制劑 Aprotinin 10KIU/mL。所述TBS-SDS 溶液含 IOmM Tris,pH7. 6,0. 03% w/v SDS,0. 1% w/v EDTA，蛋白酶抑制劑 aprotinin 10KIU/mL。所述核酸降解溶液含50U/mL DNAase, lU/mL RNAase,50mM Tris-HCl，IOmM 氯化鎂，50mg/mL BSA, ρΗ7· 5。下面對本發(fā)明進行詳細說明產(chǎn)婦產(chǎn)前經(jīng)血清學(xué)篩查，以排除乙肝、丙肝、梅毒、HIV病原體感染。無菌采集健康刨宮產(chǎn)產(chǎn)婦，發(fā)育良好的胎盤組織，以4°C預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(含1000U/ml盤尼西林， 20mg/ml鏈霉素，2. 5mg/ml兩性霉素)將胎盤組織清洗干凈，以無菌手術(shù)器械鈍性分離將羊膜從胎盤上剝離下來，剝下來的羊膜剪成5x5CM大小，保持上皮面朝上平鋪于硝酸纖維膜上，制備成“羊膜片”，注意排空氣泡、使羊膜保持平整和完整。將羊膜片浸泡處理于低滲TBS 浸泡液(含 IOmM Tris ；pH8. 0,0. 1% w/v EDTA 和蛋白酶抑制劑 AprotininlOKIU/mL)，4°C ； 16 小時，將羊膜片轉(zhuǎn)移至 TBS-SDS 溶液中(含 IOmM Tris ；pH7. 6,0. 03% w/v SDS,0. 1% w/ ν EDTA，蛋白酶抑制劑aprotinin lOKIU/mL)，25°C旋轉(zhuǎn)；24小時，羊膜片經(jīng)pH 7.6TBS溶液洗滌 3 次，轉(zhuǎn)移至核酸降解溶液(含 50U/mL DNAase, lU/mL RNAase,50mM Tris-HCl, IOmM 氯化鎂，50mg/mLBSA，pH7. 5)中37°C核酸降解處理3小時，pH 7. 6TBS溶液洗滌3次。脫細胞-核酸降解處理后的羊膜片經(jīng)過冷凍干燥、包裝和輻照滅菌后可常溫長期保存。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種脫細胞羊膜的制備方法，其特征在于，將廢棄的胎盤以4°c預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗干凈，以鈍性分離將羊膜從胎盤上剝離下來，剪成規(guī)則形狀，保持上皮面朝上平鋪于硝酸纖維素膜上，將羊膜片浸泡處理于低滲TBS浸泡液，4°C-8°C ；20-22小時后，將羊膜片轉(zhuǎn)移至TBS-SDS溶液中，15°C _22°C旋轉(zhuǎn)小時后，羊膜片經(jīng)pH 7. 6TBS溶液洗滌3次， 轉(zhuǎn)移至核酸降解溶液中，25-37°C核酸降解處理3-10小時，pH 7. 6TBS溶液洗滌3次，脫細胞-核酸降解處理后的羊膜片經(jīng)過冷凍干燥、包裝和輻照滅菌后常溫保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細胞羊膜的制備方法，其特征在于，所述低滲TBS浸泡液含 IOmM Tris, pH8. 0,0. 1% w/v EDTA 和蛋白酶抑制劑 AprotininlOKIU/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細胞羊膜的制備方法，其特征在于，所述TBS-SDS溶液含 IOmM Tris, pH7. 6,0. 03% w/v SDS,0. 1% w/v EDTA，蛋白酶抑制劑 aprotinin 10KIU/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細胞羊膜的制備方法，其特征在于，所述核酸降解溶液含 50U/mL DNAase, lU/mL RNAase,50mM Tris-HCl，IOmM 氯化鎂，50mg/mL BSA，ρΗ7· 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫細胞羊膜的制備方法，將胎盤以4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗干凈，以鈍性分離將羊膜從胎盤上剝離下來，保持上皮面朝上平鋪于硝酸纖維素膜上，將羊膜片浸泡處理于低滲TBS浸泡液，4℃；16小時，將羊膜片轉(zhuǎn)移至TBS-SDS溶液中，25℃旋轉(zhuǎn)；24小時，pH 7.6TBS溶液洗滌3次，將羊膜片轉(zhuǎn)移至核酸降解溶液中，37℃核酸降解處理3小時，pH 7.6TBS溶液洗滌3次。脫細胞-核酸降解處理后的羊膜片經(jīng)過冷凍干燥、包裝和輻照滅菌后可常溫長期保存。
文檔編號A61L15/40GK102327640SQ20111030017
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者張建平, 王嵩, 石釧, 胡艷華, 韓俊領(lǐng) 申請人:協(xié)和干細胞基因工程有限公司