專利名稱：一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非病毒陽(yáng)離子載體的基因治療組合物，更具體的說(shuō)，涉及一種磁小體與陽(yáng)離子載體SiRNA載體復(fù)合的基因治療復(fù)合物，屬于納米材料生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference，RNAi)利用具有同源性的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)降解與其序列互補(bǔ)配對(duì)的mRNA，沉默相應(yīng)靶位基因的表達(dá)。隨著人們對(duì)RNAi 分子機(jī)制理解的進(jìn)一步深入，小干擾RNA (Small interfering RNA, siRNA)作為一種新型基因治療藥物，為癌癥等絕癥的治療帶來(lái)了希望。有效輸運(yùn)是開(kāi)發(fā)RNAi作為廣泛的治療平臺(tái)最具挑戰(zhàn)性的障礙。如何選擇合適的載體提高目標(biāo)基因攜帶進(jìn)入相關(guān)目標(biāo)組織細(xì)胞的效率，并使其不被降解，是實(shí)現(xiàn)siRNA治療的難題。目前，非病毒陽(yáng)離子載體成為替代病毒載體作為基因載體的研究熱點(diǎn)。由于陽(yáng)離子載體表面帶正電荷，細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，兩者很容易結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用形成內(nèi)涵體被攝入到細(xì)胞內(nèi)，陽(yáng)離子載體的氨基可以結(jié)合質(zhì)子，起PH值緩沖作用，保護(hù)進(jìn)入內(nèi)涵體的基因不被溶酶體酶降解，質(zhì)子海綿效應(yīng)使載體因進(jìn)一步大量結(jié)合質(zhì)子而膨脹，并伴隨高滲透壓引入的大量水分，導(dǎo)致內(nèi)涵體破裂解體，將基因釋放出來(lái)。趨磁細(xì)菌磁小體(Bacterial magnetic nMioparticles，BMPs)為趨磁細(xì)菌 (Magnetotactic bacteria)體內(nèi)合成的含有單磁疇的氧化鐵或硫化鐵(Fe3O4或！^ )晶體，大小均勻?yàn)榧{米級(jí)(20-100納米)，在外加磁場(chǎng)的作用下有趨磁性，磁小體外有生物膜包被，因此有不團(tuán)聚、無(wú)毒性、免疫原性低等特點(diǎn)，是作為藥物、基因等的理想載體。因此，如何將非病毒陽(yáng)離子載體與磁小體復(fù)合，作為合適的載體，實(shí)現(xiàn)siRNA治療成為急需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種提高目標(biāo)基因攜帶進(jìn)入相關(guān)目標(biāo)組織細(xì)胞的效率，并使其不被降解的用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物。同時(shí)，本發(fā)明目的還旨在提供一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物的制備方法。為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物，其特征在于，所述siRNA載體復(fù)合物為由磁小體、非病毒載體和目的siRNA組成的復(fù)合體系，其中所述目的siRNA為與疾病或癌癥相關(guān)的siRNA。本發(fā)明進(jìn)一步限定的技術(shù)方案是所述磁小體為制取自趨磁細(xì)菌或現(xiàn)購(gòu)的磁螺菌屬模式菌株AMB-1、格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌MSR-I之一的鏈狀顆粒，其中所述趨磁細(xì)菌為從太湖水體淤泥中經(jīng)富集和篩選得到。進(jìn)一步的所述磁小體的粒徑大小為30 60納米。進(jìn)一步的所述目的siRNA的長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸。進(jìn)一步的所述非病毒載體為聚乙烯亞胺、樹(shù)狀大分子、殼聚糖及其衍生物、和陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的一種或一種以上，帶正電的非病毒載體與目的siRNA的磷酸骨架及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面相結(jié)合。一種制備SiRNA載體復(fù)合物的方法，包括步驟I、提純制備磁小體，并對(duì)純凈的磁小體進(jìn)行、射線照射滅菌，測(cè)定OD66tl，定量制成備用物；
II、設(shè)計(jì)并合成與疾病相關(guān)的目的siRNA，在緩沖液中稀釋保存，定量備用；
III、選取一種或一種以上非病毒載體制成溶液，按非病毒載體中氨基N與目的siRNA中磷酸基P的適當(dāng)比例混合，在一定溫度和PH值條件下靜置或振蕩，使目的siRNA和非病毒載體通過(guò)靜電或共價(jià)結(jié)合制成初級(jí)復(fù)合物；
IV、將步驟I的備用物與步驟III制得的初級(jí)復(fù)合物混合，在一定溫度和pH值條件下， 通過(guò)靜電或共價(jià)結(jié)合，制得siRNA載體復(fù)合物。以上制備方法進(jìn)一步限定的技術(shù)方案是步驟I中所述的提純制備磁小體的方法為采用超聲波破碎法或細(xì)胞壓榨機(jī)法破碎菌體并離心沉淀，用磁鐵吸附磁小體后再用磷酸緩沖液沖洗干凈。進(jìn)一步的步驟I中所述的測(cè)定OD66tl的方法為吸光度法。進(jìn)一步的步驟IV中備用物與初級(jí)復(fù)合物按其中磁小體與目的SiRNA質(zhì)量比為 1:5 1:1混合。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所述的用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物由與腫瘤疾病的相關(guān)siRNA、非病毒基因載體、磁小體三部分組成，制備方法簡(jiǎn)便，基因傳遞效率高；非病毒基因載體帶正電荷，可以有效中和siRNA的電負(fù)性，提高載體復(fù)合體系進(jìn)入細(xì)胞的效率，并給予siRNA有效的保護(hù)，避免RNA酶的降解作用；在磁場(chǎng)的作用下，可以有效提高基因傳遞效率；可以完成siRNA的傳遞，并借助磁小體的趨磁作用，使siRNA轉(zhuǎn)染率提高，靶向到達(dá)目的組織細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明旨在提出一種提高目標(biāo)基因攜帶進(jìn)入相關(guān)目標(biāo)組織細(xì)胞的效率，并使其不被降解的用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物及其制備方法。該siRNA載體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征為由磁小體、非病毒載體和目的siRNA組成的復(fù)合體系，其中目的siRNA為與疾病或癌癥相關(guān)的siRNA，長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸。其中，該磁小體的粒徑大小為30 60納米，其載體可以是從太湖水體淤泥中經(jīng)過(guò)富集和篩選得到的趨磁細(xì)菌，也可以是從市面直接購(gòu)得的磁螺菌屬模式菌株AMB-I和/或格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌MSR-I。為便于說(shuō)明本發(fā)明siRNA載體復(fù)合物的制備方法，以下便以從太湖水體淤泥中經(jīng)富集和篩選的趨磁細(xì)菌和購(gòu)得的磁螺菌屬模式菌株AMB-I為例，詳細(xì)說(shuō)明制法的工藝情況。實(shí)施例1
一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物，其特征在于，所述siRNA載體復(fù)合物為由趨磁細(xì)菌磁小體、非病毒載體和目的siRNA組成的復(fù)合體系，其中所述目的siRNA為與疾病或癌癥相關(guān)的siRNA，長(zhǎng)度為20-23個(gè)核苷酸。其中，所述趨磁細(xì)菌磁小體為從太湖水體淤泥中經(jīng)過(guò)富集和篩選得到的趨磁細(xì)菌進(jìn)一步制得，其粒徑大小為30 60納米；所述非病毒載體為聚乙烯亞胺、樹(shù)狀大分子、殼聚糖及其衍生物、和陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的一種或一種以
4上，帶正電的非病毒載體與目的SiRNA的磷酸骨架及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面相結(jié)合。所述用于基因靶向傳遞的SiRNA載體復(fù)合物的制備方法為I、采用超聲波破碎法或細(xì)胞壓榨機(jī)法破碎菌體并離心沉淀，用磁鐵吸附磁小體后再用磷酸緩沖液沖洗干凈， 對(duì)純凈的趨磁細(xì)菌細(xì)小體進(jìn)行Y射線照射滅菌，測(cè)定OD66tl，定量制成備用物，具體為取從太湖水域中富集培養(yǎng)的趨磁細(xì)菌8000g-10000g，超聲震蕩破碎趨磁細(xì)菌并離心沉淀菌體， 用磁鐵吸附磁小體，用磷酸緩沖液(PBS，pH7. 4)反復(fù)清洗，配合以輕微超聲震蕩，并重新懸浮與PBS中。取清洗干凈的磁小體，進(jìn)行Y-射線(15kGy)照射滅菌，用無(wú)菌PBS緩沖液懸浮，采用吸光值法測(cè)定0D_，定量磁小體備用。II、設(shè)計(jì)并合成與疾病相關(guān)的目的siRNA，在緩沖液中稀釋保存，定量備用， 具體為選取經(jīng)典的GFP基因沉默來(lái)評(píng)價(jià)BMP s -殼聚糖-s i RNA復(fù)合傳遞體系，根據(jù)公知的EGFP合成目的siRNA序列包括5 ‘-GCAAGCUGACCCUGAA⑶UCdTdT-3，及 3 ‘-dTdTC⑶UCGACUGGGACUUCAA-5’ 的雙鏈 RNA。III、選取一種或一種以上非病毒載體制成溶液，按非病毒載體中氨基N與目的 siRNA中磷酸基P的適當(dāng)比例混合，在一定溫度和pH值條件下靜置或振蕩，使目的siRNA和非病毒載體通過(guò)靜電或共價(jià)結(jié)合制成初級(jí)復(fù)合物，具體為取殼聚糖(IlOkd)溶液與siRNA 溶液按N/P (殼聚糖中的氨基N與siRNA中磷酸基P的比例)比為2-5進(jìn)行連接，在0. 9%的 NaCl溶液中振蕩混合20-40秒，溫度為50_60°C。IV、將步驟I的備用物與步驟III制得的初級(jí)復(fù)合物混合，在一定溫度和pH值條件下，通過(guò)靜電或共價(jià)結(jié)合，制得siRNA載體復(fù)合物，具體為按照趨磁細(xì)菌磁小體 BMPs siRNA質(zhì)量比為0. 2-1混合，在0. 9%的NaCl溶液中靜置20-40分鐘，即制得BMPs-殼聚糖-siRNA復(fù)合物。在本發(fā)明中，制得的BMPs-殼聚糖-siRNA復(fù)合物大小為80-150納米。所述復(fù)合物采用磁小體siRNA復(fù)合載體體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染時(shí)，需在細(xì)胞的培養(yǎng)皿下放置磁鐵(磁場(chǎng)強(qiáng)度為300mT—600mT)5-10分鐘，方能保證一定的轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白 (GFP)的細(xì)胞株，熒光顯微鏡觀測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)收到抑制的水平。實(shí)施例2
實(shí)施例2中制備的復(fù)合物結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1中相同，所述用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物的制備方法為I、采用超聲波破碎法或細(xì)胞壓榨機(jī)法破碎菌體并離心沉淀，用磁鐵吸附磁小體后再用磷酸緩沖液沖洗干凈，對(duì)純凈的趨磁細(xì)菌細(xì)小體進(jìn)行Y射線照射滅菌，測(cè)定0D·，定量制成備用物，具體為取純凈的磁螺菌屬模式菌株AMB-1，進(jìn)行γ-射線 (15kGy)照射滅菌，將其中的磁小體用磁鐵吸附起來(lái)，用無(wú)菌PBS緩沖液(pH7. 4)反復(fù)清洗磁小體，并用PBS緩沖液懸浮磁小體，采用吸光度法測(cè)定0D_，進(jìn)行磁小體定量備用。II、設(shè)計(jì)并合成與疾病相關(guān)的目的SiRNA，在緩沖液中稀釋保存，定量備用，具體為以目標(biāo)基因XIAP為例，XIAP基因能阻止細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，該基因在大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞中均過(guò)度表達(dá)，因此可以作為腫瘤診治的靶點(diǎn)，參考相關(guān)文獻(xiàn)中針對(duì)XIAP基因靶位點(diǎn)的siRNA序列進(jìn)行合成目的siRNA序列包括正義鏈 5 ‘-⑶GGUAGUCCU⑶U CAGCdTdT-3，和反義鏈 3 ‘-dTdTCACCAUCAGGACAAA⑶CG-5，的雙鏈 RNA。III、選取一種或一種以上非病毒載體制成溶液，按非病毒載體中氨基N與目的siRNA中磷酸基P的適當(dāng)比例混合，在一定溫度和pH值條件下靜置或振蕩，使目的siRNA和非病毒載體通過(guò)靜電或共價(jià)結(jié)合制成初級(jí)復(fù)合物，具體為將聚乙烯亞胺PEI (25KDa)稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋csiRNA按照Ν/Ρ (PEI中的氨基N與siRNA中磷酸基P的比例)比為5_15 進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為0. 9%的NaCl溶液，于室溫靜置30分鐘，得到ΡΕΙ-siRNA復(fù)合物。IV、將步驟I的備用物與步驟III制得的初級(jí)復(fù)合物混合，在一定溫度和pH值條件下，通過(guò)靜電或共價(jià)結(jié)合，制得siRNA載體復(fù)合物，具體為按照磁小體siRNA質(zhì)量比為 0. 2-1混合，在0. 9%的NaCl溶液中靜置20-40分鐘，即制得BMPs-PEI_siRNA復(fù)合物。在本發(fā)明中，制得的BMPs-PEI-siRNA復(fù)合物大小為80-150納米。所述復(fù)合物能夠穩(wěn)定表達(dá)XIAP基因的細(xì)胞，例如乳腺癌癌細(xì)胞系MCF-7，采用癌細(xì)胞MCF-7裸鼠模型進(jìn)行siRNA抗腫瘤效果的檢測(cè)，對(duì)裸鼠進(jìn)行瘤內(nèi)注射BMPs-PEI-siRNA復(fù)合物。進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染時(shí)，在注射部位保持磁場(chǎng)(300-600mT) 20-40分鐘。除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物，其特征在于，所述siRNA載體復(fù)合物為由磁小體、非病毒載體和目的siRNA組成的復(fù)合體系，其中所述目的siRNA為與疾病或癌癥相關(guān)的、人工合成的siRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物，其特征在于， 所述磁小體為制取自趨磁細(xì)菌或現(xiàn)購(gòu)的磁螺菌屬模式菌株AMB-1、格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌 MSR-I之一的鏈狀顆粒，其中所述趨磁細(xì)菌為從太湖水體淤泥中經(jīng)富集和篩選得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物，其特征在于，所述磁小體的粒徑大小為30 60納米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物，其特征在于，所述目的siRNA的長(zhǎng)度為20-23個(gè)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物，其特征在于，所述非病毒載體為聚乙烯亞胺、樹(shù)狀大分子、殼聚糖及其衍生物、和陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的一種或一種以上，帶正電的非病毒載體與目的siRNA的磷酸骨架及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面相結(jié)合。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的siRNA載體復(fù)合物的方法，其特征在于包括步驟I、提純制備磁小體，并對(duì)純凈的磁小體進(jìn)行Y射線照射滅菌，測(cè)定OD66tl，定量制成備用物；II、設(shè)計(jì)并合成與疾病相關(guān)的目的SiRNA，在緩沖液中稀釋保存，定量備用；III、選取一種或一種以上非病毒載體制成溶液，按非病毒載體中氨基N與目的siRNA中磷酸基P的適當(dāng)比例混合，在一定溫度和PH值條件下靜置或振蕩，使目的siRNA和非病毒載體通過(guò)靜電或共價(jià)結(jié)合制成初級(jí)復(fù)合物；IV、將步驟I的備用物與步驟III制得的初級(jí)復(fù)合物混合，在一定溫度和pH值條件下， 通過(guò)靜電或共價(jià)結(jié)合，制得siRNA載體復(fù)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的提純制備磁小體的方法為采用超聲波破碎法或細(xì)胞壓榨機(jī)法破碎菌體并離心沉淀，用磁鐵吸附磁小體后再用磷酸緩沖液沖洗干凈。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的測(cè)定OD66tl的方法為吸光度法。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物的制備方法，其特征在于，步驟IV中備用物與初級(jí)復(fù)合物按其中磁小體與目的siRNA質(zhì)量比為1 5 1 1 混合ο
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物，所述siRNA載體復(fù)合物為由磁小體、非病毒載體和目的siRNA組成復(fù)合體系，其中目的siRNA為與疾病或癌癥相關(guān)的siRNA。同時(shí)，本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物的制備方法，通過(guò)靜電或共價(jià)結(jié)合制成磁小體-非病毒載體-siRNA的復(fù)合物。本發(fā)明公開(kāi)的用于基因靶向傳遞的siRNA載體復(fù)合物中，帶正電荷的非病毒基因載體能有效中和siRNA的電負(fù)性，給予siRNA有效的保護(hù)，避免RNA酶的降解作用。在磁場(chǎng)的作用下，磁小體可以有效提高目標(biāo)基因的傳遞效率。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102552936SQ20111039214
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月1日
發(fā)明者于昊, 宋琴, 張蓓蓓, 程國(guó)勝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所