專利名稱：一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料及其制備方法，屬于組織修復(fù)材料的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨缺損是一種常見的疾病，但臨床上一直都沒有非常有效的治療手段，并且軟骨組織細(xì)胞含量低、不能遷移，還缺乏血管、淋巴和神經(jīng)等，自我修復(fù)能力非常有限。應(yīng)用組織工程的手段構(gòu)建軟骨組織工程支架來對軟骨缺損進(jìn)行修復(fù)，將是一種非常有潛力的臨床治療方式。膠原是動物體細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，具有良好的生物相容性、生物降解性和弱抗原性，已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的材料之一。透明質(zhì)酸作為天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的一種成分，可以特異地與CD44受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞與材料之間的相互作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，對軟骨細(xì)胞表型的保持、細(xì)胞增殖、以及細(xì)胞外基質(zhì)多糖的分泌等有著重要的作用， 但是透明質(zhì)酸作為一種多糖，是水溶性的，容易從支架材料中溶出。添加或利用生物活性物質(zhì)制備支架材料越來越多的應(yīng)用于組織修復(fù)中，以達(dá)到更好的組織修復(fù)效果。水凝膠作為一種可注射的支架，可用于填充任何形狀和尺寸的缺損，并且?guī)淼膭?chuàng)傷較小，含有大量的水分，可使溶于其中的物質(zhì)以及低相對分子質(zhì)量的物質(zhì)從其間滲透擴(kuò)散，以支持營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的交換，此外，其特殊的結(jié)構(gòu)特征使得種子細(xì)胞能夠均勻地分布在三維支架材料內(nèi)部，為種子細(xì)胞提供仿生的生長環(huán)境，它是一種很有優(yōu)勢的組織修復(fù)材料。目前已有一些軟骨組織工程材料的專利，中國專利03137617. 7公開了一種新型軟骨組織工程用可注射性水凝膠支架。是將引發(fā)劑、助引發(fā)劑、去離子水、生物相容性聚合物的單體按比例相混合配制成均勻溶液，在恒溫水浴中反應(yīng)，得到可用于軟骨組織工程的可注射性水凝膠。但該專利公開的水凝膠支架中選用了引發(fā)劑、助引發(fā)劑等化學(xué)試劑。 中國專利02113378. 6公開了能移植到體內(nèi)的骨骼材料，其用分子量為8_20萬的L-乳酸聚合物和平均長度5-15mm的聚磷酸鈣纖維，采用熔鑄顆粒浙取法復(fù)合而成。中國專利 200810150135. 0公開了一種含有10% 15%的羥丙基甲基纖維素和濃度為5X IO6軟骨種子細(xì)胞的注射用軟骨組織工程支架材料。若選用自體軟骨細(xì)胞作為軟骨組織工程支架的種子細(xì)胞，由于不能立即得到軟骨細(xì)胞且一次性提取量不大，需傳代培養(yǎng)幾次才能得到足量的種子細(xì)胞，所以這種種子細(xì)胞在臨床中應(yīng)用很不方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料及其制備方法，其特點(diǎn)是該修復(fù)材料選用生物相容性良好的原材料，組分中不包含有化學(xué)凝膠中所添加的引發(fā)劑等，生物相容性和生物降解性良好，具有生物活性，水凝膠前驅(qū)物的流體性能好，易于注射，可以自我塑形，選用的種子細(xì)胞易于提取，便于臨床應(yīng)用。
本發(fā)明的目的有以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說明外，均為重量份數(shù)?？勺⑸涞年P(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料的起始原料由以下組分組成I型膠原100份，透明質(zhì)酸10 50份，優(yōu)選為12 45份，再優(yōu)選為20 40份，再優(yōu)選為30 40 份；其中，透明質(zhì)酸的氧化度為20% 60% ；所述修復(fù)材料內(nèi)包埋有生物體內(nèi)骨髓液中的單核細(xì)胞層，復(fù)合材料的厚度為1 5mm。可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料的制備方法包括以下步驟(1)在冰水浴中，將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中，緩慢攪拌，配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液，置于溫度4°C冰箱中靜置；(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中，攪拌使之充分溶解，配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液；(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中，攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液；(4)在步驟( 的透明質(zhì)酸溶液中加入步驟C3)的高碘酸鈉溶液，在室溫下避光攪拌，反應(yīng)5 10h，反應(yīng)液用去離子水透析60 96h，冷凍干燥，得到氧化度為20% 60% 的氧化透明質(zhì)酸；(5)將步驟(4)得到的氧化度為20% 60%的氧化透明質(zhì)酸，用超純水溶解，攪拌配成濃度為3. 15 15. 75mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液，該溶液用0. 22um過濾器過濾滅菌后(6)在冰水浴下，步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液，緩慢攪拌均勻，得到的膠原混合溶液調(diào)節(jié)PH至中性，其中，5XPBS溶液濃度為0. 05M，緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM，NaHCO3 的濃度為 ^OmM，Hepes 的濃度為 200mM， 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下，步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入步驟(4)的氧化透明質(zhì)酸溶液，攪拌均勻，放入溫度4°C冰箱中靜置6 20h ；(8)用密度梯度離心法分離提取生物體骨髓液中整個單核細(xì)胞層的細(xì)胞，制成密度為IX IO8個/ml的細(xì)胞懸液，從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻；(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺上無菌操作；(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置10 25min，得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到生物體關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處，利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠，具有良好的自我塑形能力?？勺⑸涞年P(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料用于關(guān)節(jié)軟骨組織的缺損，組織工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。性能測試
1.用稱重法測試修復(fù)材料的含水量、降解性能；2.用化學(xué)方法測試復(fù)合材料中透明質(zhì)酸的有效含量及膠原與透明質(zhì)酸之間的交聯(lián)度；3.種子細(xì)胞包埋在材料中的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，用激光共聚焦顯微鏡觀察種子細(xì)胞的生長狀態(tài)；4.用熒光分光光度法和紫外分光光度法檢測種子細(xì)胞的增殖情況和基質(zhì)分泌；5.用組織學(xué)染色和免疫組化染色法檢測軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌及特征性軟骨陷窩的形成。結(jié)果表明修復(fù)材料具有很高的含水量，仿似生物體內(nèi)軟骨組織，良好的降解性能，透明質(zhì)酸被有效的固定于修復(fù)材料中；對種子細(xì)胞的相關(guān)測試和觀察表明，該復(fù)合材料中的原料組分對種子細(xì)胞有很好的成軟骨誘導(dǎo)作用，有特征性的軟骨陷窩形成、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、生物活性仿生材料膠原和透明質(zhì)酸能夠在關(guān)節(jié)軟骨處原位誘導(dǎo)單核細(xì)胞層中的干細(xì)胞成軟骨分化，分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，從而構(gòu)建軟骨組織以達(dá)到修復(fù)目的；2、具有可注射性，能在缺損原位注射形成凝膠，對生物體造成的創(chuàng)傷小，避免造成二次創(chuàng)傷；3、成凝膠性能良好，不需有機(jī)溶劑；4、具有良好的生物安全性和生物相容性，無細(xì)胞毒性；5、組織學(xué)染色和免疫組化染色顯示，該水凝膠和種子細(xì)胞在體外復(fù)合培養(yǎng)可形成軟骨樣組織，有軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)分泌；6、便于臨床操作，制備方法操作簡單，對環(huán)境友好。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例1采用I型膠原為100份，氧化透明質(zhì)酸為10份；氧化透明質(zhì)酸的氧化度為20%，復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中，將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中，緩慢攪拌，配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液，置于溫度4°C冰箱中靜置；(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中，攪拌使之充分溶解，配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液；(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中，攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液；(4)在20ml步驟O)的透明質(zhì)酸溶液中加入5ml步驟(3)的高碘酸鈉溶液，在室溫下避光攪拌，反應(yīng)5h，反應(yīng)液用去離子水透析60h，冷凍干燥，得到氧化度為20%的氧化透明質(zhì)酸；
(5)將步驟(4)得到的氧化度為20%的氧化透明質(zhì)酸，用超純水溶解，攪拌配成濃度為3. 15mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液，該溶液用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；(6)在冰水浴下，步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液，緩慢攪拌均勻，得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性，其中，5XPBS溶液濃度為0. 05M，緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM，NaHCO3 的濃度為 ^OmM，Hepes 的濃度為 200mM， 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下，IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟的氧化透明質(zhì)酸溶液，攪拌均勻，放入溫度4°C冰箱中靜置18h ；(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個單核細(xì)胞層的細(xì)胞， 制成密度為IX IO8個/ml的細(xì)胞懸液，從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻；(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、⑶均在超凈工作臺上無菌操作；(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min，得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處，利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例2采用I型膠原為100份，氧化透明質(zhì)酸為20份；氧化透明質(zhì)酸的氧化度為20%，復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中，將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中，緩慢攪拌，配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液，置于溫度4°C冰箱中靜置；(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中，攪拌使之充分溶解，配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液；(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中，攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液；(4)在20ml步驟O)的透明質(zhì)酸溶液中加入5ml步驟(3)的高碘酸鈉溶液，在室溫下避光攪拌，反應(yīng)5h，反應(yīng)液用去離子水透析60h，冷凍干燥，得到氧化度為20%的氧化透明質(zhì)酸；(5)將步驟(4)得到的氧化度為20%的氧化透明質(zhì)酸，用超純水溶解，攪拌配成濃度為6. 3mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液，該溶液用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；(6)在冰水浴下，步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液，緩慢攪拌均勻，得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性，其中，5XPBS溶液濃度為0. 05M，緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM，NaHCO3 的濃度為 ^OmM，Hepes 的濃度為 200mM， 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下，IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟(4)的氧化透明質(zhì)酸溶液，攪拌均勻，放入溫度4°C冰箱中靜置IOh ；(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個單核細(xì)胞層的細(xì)胞， 制成密度為IX IO8個/ml的細(xì)胞懸液，從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻；(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺上無菌操作；(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min，得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處，利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例3采用I型膠原為100份，氧化透明質(zhì)酸為20份；氧化透明質(zhì)酸的氧化度為40%，復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中，將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中，緩慢攪拌，配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液，置于溫度4°C冰箱中靜置；(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中，攪拌使之充分溶解，配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液；(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中，攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液；(4)在20ml步驟⑵的透明質(zhì)酸溶液中加入IOml步驟(3)的高碘酸鈉溶液，在室溫下避光攪拌，反應(yīng)8h，反應(yīng)液用去離子水透析72h，冷凍干燥，得到氧化度為40 %的氧化透明質(zhì)酸；(5)將步驟(4)得到的氧化度為40%的氧化透明質(zhì)酸，用超純水溶解，攪拌配成濃度為6. 3mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液，該溶液用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；(6)在冰水浴下，步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液，緩慢攪拌均勻，得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性，其中，5XPBS溶液濃度為0. 05M，緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM，NaHCO3 的濃度為 ^OmM，Hepes 的濃度為 200mM， 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下，IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟的氧化透明質(zhì)酸溶液，攪拌均勻，放入溫度4°C冰箱中靜置12h ；(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個單核細(xì)胞層的細(xì)胞， 制成密度為IX IO8個/ml的細(xì)胞懸液，從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻；(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺上無菌操作；(10)將步驟(8)得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min，得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處，利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例4采用I型膠原為100份，氧化透明質(zhì)酸為50份；氧化透明質(zhì)酸的氧化度為40%，復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中，將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中，緩慢攪拌，配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液，置于溫度4°C冰箱中靜置；(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中，攪拌使之充分溶解，配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液；(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中，攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液；(4)在20ml步驟⑵的透明質(zhì)酸溶液中加入IOml步驟(3)的高碘酸鈉溶液，在室溫下避光攪拌，反應(yīng)8h，反應(yīng)液用去離子水透析72h，冷凍干燥，得到氧化度為40 %的氧化透明質(zhì)酸；(5)將步驟(4)得到的氧化度為40%的氧化透明質(zhì)酸，用超純水溶解，攪拌配成濃度為15. 75mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液，該溶液用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；(6)在冰水浴下，步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液，緩慢攪拌均勻，得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性，其中，5XPBS溶液濃度為0. 05M，緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM，NaHCO3 的濃度為 ^OmM，Hepes 的濃度為 200mM， 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下，IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟(4)的氧化透明質(zhì)酸溶液，攪拌均勻，放入溫度4°C冰箱中靜置12h ；(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個單核細(xì)胞層的細(xì)胞， 制成密度為IX IO8個/ml的細(xì)胞懸液，從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻；(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、⑶均在超凈工作臺上無菌操作；(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min，得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處，利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例5采用I型膠原為100份，氧化透明質(zhì)酸為10份；氧化透明質(zhì)酸的氧化度為60%，復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中，將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中，緩慢攪拌，配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液，置于溫度4°C冰箱中靜置；(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中，攪拌使之充分溶解，配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液；(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中，攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液；(4)在20ml步驟⑵的透明質(zhì)酸溶液中加入15ml步驟(3)的高碘酸鈉溶液，在室溫下避光攪拌，反應(yīng)10h，反應(yīng)液用去離子水透析96h，冷凍干燥，得到氧化度為60%的氧化透明質(zhì)酸；(5)將步驟(4)得到的氧化度為60%的氧化透明質(zhì)酸，用超純水溶解，攪拌配成濃度為3. 15mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液，該溶液用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；(6)在冰水浴下，步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液，緩慢攪拌均勻，得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性，其中，5XPBS溶液濃度為0. 05M，緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM，NaHCO3 的濃度為 ^OmM，Hepes 的濃度為 200mM，緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下，IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟(4)的氧化透明質(zhì)酸溶液，攪拌均勻，放入溫度4°C冰箱中靜置他；(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個單核細(xì)胞層的細(xì)胞， 制成密度為IX IO8個/ml的細(xì)胞懸液，從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻；(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺上無菌操作；(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min，得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處，利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例6采用I型膠原為100份，氧化透明質(zhì)酸為50份；氧化透明質(zhì)酸的氧化度為60%，復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中，將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中，緩慢攪拌，配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液，置于溫度4°C冰箱中靜置；(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中，攪拌使之充分溶解，配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液；(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中，攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液；(4)在20ml步驟⑵的透明質(zhì)酸溶液中加入15ml步驟(3)的高碘酸鈉溶液，在室溫下避光攪拌，反應(yīng)10h，反應(yīng)液用去離子水透析96h，冷凍干燥，得到氧化度為60%的氧化透明質(zhì)酸；(5)將步驟(4)得到的氧化度為60%的氧化透明質(zhì)酸，用超純水溶解，攪拌配成濃度為15. 75mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液，該溶液用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；(6)在冰水浴下，步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液，緩慢攪拌均勻，得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性，其中，5XPBS溶液濃度為0. 05M，緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM，NaHCO3 的濃度為 ^OmM，Hepes 的濃度為 200mM， 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下，IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟的氧化透明質(zhì)酸溶液，攪拌均勻，放入溫度4°C冰箱中靜置他；(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個單核細(xì)胞層的細(xì)胞， 制成密度為IX IO8個/ml的細(xì)胞懸液，從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻；(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺上無菌操作；(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min，得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處，利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。
權(quán)利要求
1.一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料，其特征在于該修復(fù)材料的起始原料由以下組分組成，按重量計(jì)為I型膠原100份，透明質(zhì)酸10 50份；其中，透明質(zhì)酸的氧化度為20% 60% ；所述修復(fù)材料內(nèi)包埋有生物體內(nèi)骨髓液中的單核細(xì)胞層，復(fù)合材料的厚度為1 5mm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)在冰水浴中，將膠原溶于濃度為0.003M的鹽酸溶液中，緩慢攪拌，配制成濃度為 9mg/ml的膠原溶液，置于溫度4°C冰箱中靜置；(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中，攪拌使之充分溶解，配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液；(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中，攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液；(4)在步驟O)的透明質(zhì)酸溶液中加入步驟(3)的高碘酸鈉溶液，在室溫下避光攪拌， 反應(yīng)5 10h，反應(yīng)液用去離子水透析60 96h，冷凍干燥，得到氧化度為20% 60%的氧化透明質(zhì)酸；(5)將步驟(4)得到的氧化度為20% 60%的氧化透明質(zhì)酸，用超純水溶解，攪拌配成濃度為3. 15 15. 75mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液，該溶液用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；(6)在冰水浴下，步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液，緩慢攪拌均勻，得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性，其中，5XPBS溶液濃度為0. 05M，緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM，NaHCO3 的濃度為 ^OmM，Hepes 的濃度為 200mM， 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過濾器過濾滅菌后備用；膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下，步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入步驟的氧化透明質(zhì)酸溶液，攪拌均勻，放入溫度4°C冰箱中靜置6 20h ；(8)用密度梯度離心法分離提取生物體骨髓液中整個單核細(xì)胞層的細(xì)胞，制成密度為 IX IO8個/ml的細(xì)胞懸液，從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻；(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺上無菌操作；(10)將步驟(8)得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置10 25min，得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到生物體關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處，利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠，具有良好的自我塑形能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料的用途，其特征在于該關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料用于關(guān)節(jié)軟骨組織的缺損，組織工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料，其特點(diǎn)是該復(fù)合材料的起始原料由以下組分組成I型膠原100重量份，透明質(zhì)酸10～50重量份，其中，透明質(zhì)酸的氧化度為20％～60％；所述修復(fù)材料內(nèi)包埋有生物體內(nèi)骨髓液中的單核細(xì)胞層，復(fù)合材料的厚度為1～5mm。用高碘酸鈉將透明質(zhì)酸氧化為氧化透明質(zhì)酸；將膠原溶液、5×PBS和緩沖液按7∶2∶1的體積比混合調(diào)節(jié)pH至中性；將氧化透明質(zhì)酸用超純水溶解后加入已調(diào)至中性的膠原溶液中，攪拌均勻，4℃冰箱中靜置；將用密度梯度離心法分離提取的生物體骨髓液中的單核細(xì)胞層與前述膠原-氧化透明質(zhì)酸溶液混合均勻；將混合液放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置或注射到生物體關(guān)節(jié)軟骨缺損處，形成復(fù)合材料。
文檔編號A61L27/38GK102488925SQ20111045168
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者巖曉麗, 張興棟, 樊渝江, 蔣波, 郭立坤 申請人:成都普川生物醫(yī)用材料股份有限公司