專利名稱：N-(3,4-二羥基苯甲酰)-3,4-二羥基苯甲酰胺及其制備方法和用途的制作方法
專利說(shuō)明N-(3，4_ 二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺為白色細(xì)小晶體，其分子式為 C14H11NO6，分子量為289克/摩爾。熔點(diǎn)為298-3100C ο我們首次從普洱荼中分離得到的此新化合物，N- (3,4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二輕 基苯甲酰胺，并經(jīng)過藥理實(shí)驗(yàn)證明，此化合物具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制腫瘤細(xì)胞生 長(zhǎng)與存活的作用，因此其具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景，基于上述研究成果，本發(fā)明
N-(3, 4-二羥基苯甲酰)-3, 4-二羥基苯甲酰胺及其制備方
法和用途技術(shù)領(lǐng)域。C本發(fā)明涉及一種具有神經(jīng)保護(hù)活性和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與存活的化合物的制備 方法和用途，具體涉及N- (3,4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺的制備方法與用途。
背景技術(shù)：
神經(jīng)元損傷會(huì)導(dǎo)致多種疾病，目前尚無(wú)任何有效的神經(jīng)保護(hù)藥物能夠治療這些疾 病，僅有一些藥物可以通過提高剩余神經(jīng)元的功能來(lái)緩解這些疾病，而有些藥物還會(huì)產(chǎn)生 不良的副作用。因此，開發(fā)具有神經(jīng)元保護(hù)作用的新型藥物具有十分重大的意義。另外，抑制腫瘤細(xì)胞的過度增值與存活是抗腫瘤治療的主要手段之一。近來(lái)研 究證明，細(xì)胞的部分蛋白激酶(kinase)的活性對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖與存活具有至關(guān)重要 的影響作用。一些選擇性的蛋白激酶抑制劑(selective kinase inhibitors)，例如，癌
(BCR, breakpoint cluster region-ABLl fusion protein) (inhibitor of tyrosine kinase)可顯著抑制慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukaemia, CML)的發(fā)生與發(fā)展。因此，開發(fā)具有選擇性的與腫瘤有關(guān)的蛋白激酶抑制劑， 對(duì)于研發(fā)抗腫瘤的新型藥物具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種適用于由于神經(jīng)損傷導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病(如 Alzheimer' s病)與癌癥的治療作用的化合物，可以用于有效地預(yù)防和/或治療神經(jīng)元損 傷及其相關(guān)的疾病。也可用于癌癥的有效預(yù)防和/或治療。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下式I所示化合物結(jié)構(gòu)式如下還提供了式I所示化合物在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)元損傷及其相關(guān)疾病以及癌癥的藥物 中的用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種簡(jiǎn)便且適合于大量合成式I所示化合物(N-(3， 4-二羥基苯甲酰)-3，4_二羥基苯甲酰胺)的方法。并且提供了一種簡(jiǎn)便易行的合成途徑。
N- (3,4- 二羥基苯甲酰)_3，4- 二羥基苯甲酰胺的制備和合成方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種N- (3,4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺的制備和合成方法，從普洱茶 中分離此化合物的主要制備途徑如下所示1.該分離純化方法包括以下步驟(1)普洱茶(生茶和熟茶)用90°C水提??；(2)水提取液濃縮成1.3g/cm3，通過大孔吸附樹脂，按照順序用水，20%，40%， 95%乙醇洗脫。(3)收集20%部分洗脫液，減壓蒸干，通過ODS (反相)柱色譜，用10%，20%，30% 甲醇分別洗脫，每個(gè)比例5倍柱體積。(4)收集20%部分的洗脫液，并且通過S印hadex LH-20柱色譜，獲得含N-(3，4_二 羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺的部分。2.另外，我們還研究了使用3，4- 二羥基苯甲酸作為原料合成N- (3，4- 二羥基苯甲 酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺的途徑。本發(fā)明的合成路線如下所示
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稀鹽酸其中，合成包括以下步驟(a)將反應(yīng)產(chǎn)物置于冰水中，通過SOCl2和氨氣。(b)將a反應(yīng)產(chǎn)物，在鋅汞齊催化下進(jìn)行還原反應(yīng)。(c)將b反應(yīng)產(chǎn)物與3，4- 二羥基苯甲酸加熱反應(yīng)，反應(yīng)后，通入甲醛，保護(hù)鄰二酚羥基。(d)將c反應(yīng)產(chǎn)物通入氯氣，并且加入碳酸氫鈉水解，反應(yīng)產(chǎn)物通過Oppenauer氧 化。(e)將d反應(yīng)產(chǎn)物，通過稀鹽酸水解脫保護(hù)基，生成最終產(chǎn)物N-(3，4- 二羥基苯甲 酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺。本發(fā)明以3，4_ 二羥基苯甲酸為原料，采用相對(duì)簡(jiǎn)便的合成路線實(shí)現(xiàn)了 N_(3， 4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)率較高，為N-(3，4- 二羥基苯甲 酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺的藥物制劑生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供了有力的保障。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中
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圖1 :N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺對(duì)谷氨酸(Glutamate)誘 導(dǎo)的大鼠原代培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元死亡的抑制作用；其中，Control 對(duì)照組；Glu_50 μ M 谷氨酸，終濃度為50 μ M ；ZMT-OO1-1 μ M =N-(3,4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺， 終濃度為1 μ M ；ZMT-OO1-5 μ M =N-(3,4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺，終濃度為 5 μ M ；ZMT-OO1-10 μ M :Ν-(3，4- 二羥基苯甲酰)_3，4- 二羥基苯甲酰胺，終濃度為10 μ Μ。圖2 :Ν-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺對(duì)6羥基多巴胺(6-0HDA) 誘導(dǎo)的大鼠原代培養(yǎng)中腦多巴胺神經(jīng)元死亡的抑制作用；Control 空白對(duì)照組；6-0HDA 6-羥基多巴胺，終濃度為50 μ M ；ZMT-OO1-1 μ M =N-(3,4- 二羥基苯甲酰)-3,4- 二羥基苯 甲酰胺，終濃度為1 μ M ；ΖΜΤ-001-5μΜ =N-(3,4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺，終 濃度為5 μ M ；ZMT-OO1-10 μ M =N-(3,4- 二羥基苯甲酰)-3,4- 二羥基苯甲酰胺，終濃度為 10 μ Μ。圖3 :Ν-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺誘導(dǎo)離體培養(yǎng)人肝癌 細(xì)胞死亡的作用；其中，DMS0:為離體培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)中加入等量的二甲基亞 楓。ΖΜΤ-001-1 μ M :Ν-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺，終濃度為ΙμΜ; ZMT-OO1-5 μ M :Ν-(3,4- 二羥基苯甲酰)_3，4- 二羥基苯甲酰胺，終濃度為5 μ M ； ΖΜΤ-001-10 μ M :Ν-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺，終濃度為10μΜο其IC50 約為 3. 37 μ M0圖4 :Ν-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_二羥基苯甲酰胺對(duì)人體微動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 增殖的抑制作用；其中，DMSO 為離體培養(yǎng)人微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中加入等量的二甲基亞 楓。Β9-0. 1 :Ν-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_二羥基苯甲酰胺，終濃度為0. 1μΜ;Β9-1 =N-(3, 4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺，終濃度為1. 0μ M ；Β9-10 =N-(3,4- 二羥基苯甲 酰)_3，4- 二羥基苯甲酰胺，終濃度為10 μ Μ。其IC5tl約為5. 98 μ Μ。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺的制備將反應(yīng)底物3，4_ 二羥基苯甲酸溶于吡啶溶液，并且置于反應(yīng)瓶中，緩慢加入 SOCl2，隨后緩慢地通入氨氣，置于冰浴上，控制反應(yīng)溫度。得到的反應(yīng)產(chǎn)物為3，4_ 二羥基 苯甲酰胺?；厥辗磻?yīng)產(chǎn)物3，4-二羥基苯甲酰胺，通過鋅汞齊還原催化劑(5g鋅粉(或鋅粒)、 5g氯化汞、5ml濃鹽酸和100ml水混合攪拌5min，靜置。傾去水液，用50ml水和250ml濃鹽 酸混合液浸泡處理，并應(yīng)立即使用)進(jìn)行酮基的還原，生產(chǎn)了 3，4_ 二羥基苯甲胺。將3，4_ 二羥基苯甲胺與3，4_ 二羥基苯甲酸以(1 1)的摩爾比例進(jìn)行混合，并 且緩慢加熱，進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，得到了初步的酰胺反應(yīng)物。將反應(yīng)產(chǎn)物繼續(xù)溶于丙酮，加入 甲醛進(jìn)行縮合反應(yīng)，保護(hù)3，4_鄰二酚羥基。將縮合后的產(chǎn)物溶于稀碳酸氫鈉中，并且通入 氯氣，加熱得到了仲醇反應(yīng)產(chǎn)物，從而進(jìn)一步進(jìn)行Oppenauer氧化，也即是將反應(yīng)物溶于丙 酮，并且加入異丙醇鋁作為催化劑，得到仲醇成為酮基的反應(yīng)產(chǎn)物，通入稀鹽酸后既得到最終產(chǎn)物N- (3，4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺。結(jié)構(gòu)表征熔點(diǎn)298-310°C表IN-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺的核磁數(shù)據(jù) MS (ESI+) :[M+H]+m/z 290IR(KBr)vmax(cm-l) :3413，1676，1606，1517，1444，1277，1106，971，765實(shí)施例2N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺對(duì)谷氨酸(Glutamate)誘導(dǎo)的大鼠 原代培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元死亡的抑制作用方法與步驟首先進(jìn)行小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neurons, CGN)的原代培養(yǎng)。培 養(yǎng)7天后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基 苯甲酰胺(終濃度分別為1、5與10 μ M)，然后，再在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入神經(jīng)毒素谷氨酸 (Glutamate,終濃度為50 μ Μ),將細(xì)胞置于CO2 (37°C, 5 % CO2)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)， 最后用FDA/PI double staine法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示(見圖1)，50 μ M的谷氨酸 (Glutamate)可誘發(fā)CGN神經(jīng)細(xì)胞顯著的死亡，而N-(3，4_ 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯 甲酰胺(終濃度為5與10 μ Μ)可以顯著抑制神經(jīng)元的死亡，顯著保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。實(shí)施例3
N-(3,4- 二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺對(duì)6羥基多巴胺 (6-hydroxydopamine,6-0H-DA)誘導(dǎo)的大鼠原代培養(yǎng)中腦多巴胺神經(jīng)元死亡的抑制作用首先進(jìn)行中腦多巴胺神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加 入N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺(終濃度分別為1、5與ΙΟμΜ)，然后， 再在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺(6-0H-DA，終濃度為50 μ Μ)，將細(xì)胞置于 CO2(375% CO2)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，最后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示(見 圖2)，50 μ M的6-羥基多巴胺可誘發(fā)中腦多巴胺神經(jīng)元顯著的死亡，而N- (3,4- 二羥基苯 甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺(終濃度為ΙΟμΜ時(shí))可以顯著抑制神經(jīng)元的死亡，顯著保護(hù) 神經(jīng)細(xì)胞。實(shí)施例4N-(3,4- 二羥基苯甲酰)_3，4- 二羥基苯甲酰胺對(duì)離體培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系增殖存 活的抑制作用首先進(jìn)行人類肝癌細(xì)胞系的離體培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期后，在細(xì)胞培養(yǎng)液 中分別加入N- (3,4- 二羥基苯甲酰)_3，4- 二羥基苯甲酰胺(終濃度分別為1、5與10 μ Μ)， 然后，將細(xì)胞置于C02(37°C，5% CO2)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，最后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活 率。結(jié)果顯示(見圖3)，N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺(終濃度為1、5與 10 μ M時(shí))均可以顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的死亡，抑制肝癌細(xì)胞的增殖。實(shí)施例5N-(3,4- 二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺對(duì)離體培養(yǎng)人微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系 增殖存活的抑制作用。首先進(jìn)行人類微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系的離體培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期后，在細(xì)胞 培養(yǎng)液中分別加入Ν-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺(終濃度分別為0. 1、1 與ΙΟμΜ)，然后，將細(xì)胞置于C02(37°C，5% CO2)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，最后用MTT法檢 測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示(見圖4)，N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4_ 二羥基苯甲酰胺(終濃 度為0. 1、1與10 μ M時(shí))均可以顯著抑制微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
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權(quán)利要求
一種N (3，4 二羥基苯甲酰) 3，4 二羥基苯甲酰胺的制備方法，該制備方法包括式I所示化合物存在下，通過合成形成的N (3，4 二羥基苯甲酰) 3，4 二羥基苯甲酰胺II。FSA00000221704300011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離和合成方法，其特征在于，所述合成步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離純化和合成方法，其特征在于，1所要求的分離純化 途徑以及2所要求的合成步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的分離和合成方法，其特征在于，所述分離和合成 方法包括以下步驟(1)依次將式I所示化合物通過多步氧化還原反應(yīng)。(2)11分離過程中使用的20%大孔吸附樹脂洗脫液，20%甲醇洗脫液的分離方法。(3)分離反應(yīng)產(chǎn)物，得到N-(3，4- 二羥基苯甲酰)-3，4- 二羥基苯甲酰胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的式II所示化合物在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)元損傷及其相 關(guān)疾病的藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)元損傷或其相關(guān)疾病選自神經(jīng) 退行性疾病，例如老年性癡呆；帕金森病；肌萎縮性側(cè)索硬化；腦中風(fēng)，血管性癡呆以及糖 尿病的腦血管并發(fā)癥中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的式II所示化合物在制備預(yù)防和/或治療癌癥的藥物中的用途。
全文摘要
一種N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺的制備方法，該制備方法包括式I所示化合物存在下，通過合成形成的N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺II。本發(fā)明以咖3，4-二羥基苯甲酸為原料，采用相對(duì)簡(jiǎn)便的合成路線實(shí)現(xiàn)了N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)率較高，為N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺的藥物制劑生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供了有力的保障。本發(fā)明同時(shí)提供了式II所示化合物N-(3，4-二羥基苯甲酰)-3，4-二羥基苯甲酰胺在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)元損傷及其相關(guān)疾病，癌癥等惡性腫瘤疾病中的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P9/00GK101906054SQ201010248349
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者屠鵬飛, 張梁, 馬治中 申請(qǐng)人:張梁;馬治中;屠鵬飛