專利名稱：巨噬細胞介導(dǎo)的疾病的治療和診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療和監(jiān)測由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況的方法。更具體地 說，將與活化的巨噬細胞結(jié)合的配體和成像劑，或免疫原，細胞毒素，或改變巨噬細胞功能 的試劑形成復(fù)合物，施用于患病的宿主，用以診斷和/或治療巨噬細胞介導(dǎo)的疾病。
背景技術(shù)：
哺乳動物的免疫系統(tǒng)提供了一種識別和排除外來的病原體的途徑。雖然免疫系統(tǒng) 通常提供了抵抗外來病原體的防線，但仍存在很多免疫應(yīng)答本身參與疾病進展的例子。因 宿主的自身免疫應(yīng)答而引起或惡化的疾病的例子是自身免疫疾病，例如，多發(fā)性硬化、紅斑 狼瘡、牛皮癬、肺纖維化、和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及免疫應(yīng)答有助于發(fā)病機制的疾病，例如動 脈粥樣硬化、炎性疾病、骨髓炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克隆氏病，和常常引起器官移植排斥的移植 物抗宿主疾病。一般，巨噬細胞是首先遇到外來病原體的細胞，因此，它們在免疫應(yīng)答中起重要的 作用。然而，在某些情況下，活化的巨噬細胞可以有助于疾病的病理生理學(xué)?；罨木奘杉?胞通過水解和氧化，侵襲外來病原體，造成其降解，從而非特異地將在巨噬細胞內(nèi)的該外來 病原體吞噬并殺滅。降解蛋白的肽展示在巨噬細胞的表面，并在該表面被T細胞所識別，同 時可以與在B細胞表面的抗體直接相互作用，引起T和B細胞的活化并進一步刺激免疫應(yīng) 答。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種全身性的疾病，其特征是慢性炎性的滑膜炎，通常涉 及外周關(guān)節(jié)?；さ难装Y引起軟骨變質(zhì)和對骨骼的侵蝕，隨之破壞了關(guān)節(jié)的完整。在2/3 以上的RA患者中，發(fā)現(xiàn)了與IgG的Fc區(qū)反應(yīng)的自身抗體類風(fēng)濕因子，表明RA含有自身免 疫成分。在全世界，高達2 %的人口患有RA，其中80 %的RA患者在35_50歲的年齡發(fā)病。RA 的臨床癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、和觸痛，造成運動受限制、虛弱、疲乏，以及體重減輕。RA是 一種全身性的疾病，因此，患者還有關(guān)節(jié)外癥狀，尤其是類風(fēng)濕因子滴度高的患者。這些癥 狀包括含有壞死物質(zhì)的內(nèi)區(qū)，巨噬細胞的中間區(qū)和顆粒組織外區(qū)的類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、肌肉萎縮、 骨質(zhì)疏松、肺纖維化、和類風(fēng)濕脈管炎，它可以引起皮膚潰瘍、手指壞疽、或神經(jīng)血管疾病。類風(fēng)濕滑膜炎是RA的特征，它可引起滑膜襯細胞數(shù)的增加、滑膜襯細胞的增生和 肥大、微血管的損傷、水腫、以及，例如T細胞、巨噬細胞和樹突細胞的細胞浸潤。類風(fēng)濕滑 膜炎的特征在于免疫細胞分泌產(chǎn)物的存在，例如由T淋巴細胞所分泌的因子，包括IL-2、 IFN-S、IL-6、IL-10、GM-CSF和TGFa和日，以及由活化的巨噬細胞所分泌的因子，包括 IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、巨噬細胞CSF和TGF3。這些細胞因子的產(chǎn)生看來解釋了 很多RA的病理學(xué)，包括滑膜的炎癥、滑膜細胞增殖、軟骨和骨的變質(zhì)、以及該疾病的全身癥狀。
RA可以用各種治療方法來進行治療，包括物理治療、休息、和用夾板固定。治療試 劑也可以用來治療RA，包括用阿斯匹林和非甾體類抗炎藥，以控制局部的炎癥。但是，這些 試劑對疾病的療效很小，而且具有毒性副作用。減輕疾病的抗風(fēng)濕藥物，例如a-青霉胺和 柳氮磺胺吡啶也可以用來治療RA，但從這些藥物獲得療效要遲緩數(shù)周或數(shù)月，而且這些藥 物有毒性副作用。免疫抑制和細胞毒性藥物抑制某些患者的癥狀，但是同時產(chǎn)生毒性。也 曾使用過關(guān)節(jié)內(nèi)的糖皮質(zhì)素，但只是短暫緩解。因此，必須建立一種毒性降低的、對RA及其 他由活化的巨噬細胞所引起或惡化的疾病的治療有效的新治療方法。葉酸受體(FR)是38KDa的GPI錨定蛋白，它以高親和性(< InM)與維生素葉酸結(jié) 合。在與受體結(jié)合后，迅速的胞吞作用將維生素送入細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)存在低PH的核 內(nèi)體區(qū)室內(nèi)。重要的是，小分子、蛋白、甚至脂質(zhì)體與葉酸的共價偶聯(lián)并不改變維生素與葉 酸受體結(jié)合的能力，因此，葉酸_藥物偶聯(lián)物很容易通過受體介導(dǎo)的胞吞作用而進入細胞。由于大多數(shù)細胞使用不相關(guān)的還原型葉酸載體(RFC)來獲得必需的葉酸，葉酸受 體的表達僅限于少數(shù)幾種類型的細胞中。除了腎臟和胎盤以外，正常組織的FR表達水平很 低或檢測不到。但是，很多惡性組織，包括卵巢癌、乳房癌、支氣管癌、和腦癌的受體表達水 平明顯增高。實際上，估計有95%的卵巢癌過量表達葉酸受體。最近報道，葉酸受體的非上 皮同工型FRe在活化的(而不是靜息的)滑膜巨噬細胞中表達。因此，申請人曾試圖利用 可能能夠改變活化的巨噬細胞功能的葉酸連接的化合物，來治療巨噬細胞介導(dǎo)的疾病。例 如，申請人已發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)炎的動物中，葉酸連接的免疫原可以用來改變宿主對炎癥部位活 化的巨噬細胞的免疫應(yīng)答，以減少巨噬細胞和減輕關(guān)節(jié)炎。閃爍照像成像劑的靈敏度比核磁共振成像(MRI)造影劑高百萬倍以上，而且，通 過其導(dǎo)向病變特異的細胞標記，可提高其選擇性。實際上，放射性同位素99mTc已用非特異 性IgG、抗⑶4抗體、⑶lib/⑶14-糖脂肽配體、和E選擇蛋白結(jié)合肽遞送到關(guān)節(jié)炎組織中。 用這樣的放射成像劑進行的臨床前研究已明顯地顯示出使關(guān)節(jié)炎組織在體內(nèi)成像的價值， 但是，目前在成像劑的選擇上還不是最佳的，而且目前的化合物中，沒有一種是只導(dǎo)向活化 巨噬細胞的。鑒于巨噬細胞活化期間出現(xiàn)葉酸受體活性，申請人曾對葉酸導(dǎo)向的99mTc成 像劑是否可以用于關(guān)節(jié)炎病變的體內(nèi)成像進行過測定。為了測定這種高親和性FR的表達是否可以用于選擇性地將藥物導(dǎo)向在炎癥部位 活化的巨噬細胞，將葉酸與99mTc螯合劑偶聯(lián)，并評價其在佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的大鼠的正 常組織和病變組織中的分布。確實，發(fā)現(xiàn)稱為EC20的葉酸連接的99mTc螯合復(fù)合物濃集在 患病大鼠的關(guān)節(jié)炎肢端，而在健康大鼠的關(guān)節(jié)中未發(fā)現(xiàn)。在過量的競爭性葉酸存在下，發(fā)現(xiàn) 受影響組織的Y閃爍成像的強度大大地降低。此外，患關(guān)節(jié)炎的動物的肝和脾也顯示出對 EC20攝取的增加和FR水平的提高，證實了巨噬細胞的全身活化與佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎同時 發(fā)生?；缄P(guān)節(jié)炎動物的巨噬細胞的耗竭減少了組織的FR含量，并與此一致，消除了 EC20的 攝取。此外，由佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的大鼠中分離的枯氏細胞表現(xiàn)出的結(jié)合葉酸偶聯(lián)物的能力 明顯高于健康大鼠的枯氏細胞。由此，申請人發(fā)現(xiàn)，EC20對于測定活化的巨噬細胞參與炎 癥，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理學(xué)是有用的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種治療和監(jiān)測由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，通過重新定向宿主對活化的巨噬細胞的免疫應(yīng)答，或通過改變活化的 巨噬細胞的功能，或直接殺滅活化的巨噬細胞來治療由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況。 在本發(fā)明的一個方面，為了促進殺滅活化的巨噬細胞，將與活化的巨噬細胞特異結(jié)合的配 體與免疫原偶聯(lián)，以重新定向宿主對活化的巨噬細胞群的免疫應(yīng)答，或者將它們與直接殺 滅巨噬細胞的細胞毒素偶聯(lián)?？梢杂糜诒景l(fā)明的偶聯(lián)物中的配體包括與在活化的巨噬細胞 上特異表達的受體結(jié)合的配體，例如與葉酸受體結(jié)合的配體；或以下所述的配體，例如，定 位于在活化的巨噬細胞上特異表達的細胞表面標記的單克隆抗體。本發(fā)明的另一個方面， 將與活化的巨噬細胞特異結(jié)合的配體與成像劑偶聯(lián)，然后將偶聯(lián)物施用于患者，以診斷和 監(jiān)測由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病的進展。在一個實施方案中，提供了一種治療或監(jiān)測/診斷由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病 狀況的方法。此方法包括對患有巨噬細胞介導(dǎo)的疾病的患者施用有效量的組合物的步驟， 該組合物包含通式為Ab-X的偶聯(lián)物或復(fù)合物，其中的基團Ab包含能結(jié)合活化的巨噬細胞的 配體，當(dāng)偶聯(lián)物用來治療疾病狀況時，基團X包含免疫原、細胞毒素、或能夠改變巨噬細胞 功能的化合物；當(dāng)偶聯(lián)物用來監(jiān)測/診斷疾病狀況時，基團X包含成像劑。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明，提供了治療或監(jiān)測/診斷由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況的方 法。已知由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病的例子包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克隆氏 病、牛皮癬、骨髓炎、多發(fā)性硬化、動脈粥樣硬化、肺纖維化、結(jié)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化、器官移植 排斥(GVHD)和慢性炎癥。這種疾病狀況可以通過如下方式監(jiān)測，首先對患有該疾病狀況的 患者施用有效量的組合物，該組合物包含通式為Ab-X的偶聯(lián)物，其中的基團Ab包含能結(jié)合 活化的巨噬細胞的配體，基團X包括成像劑，然后用能夠檢測成像劑的儀器對患者進行掃 描。巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況可以根據(jù)本發(fā)明，通過施用有效量的上述通式的組合物來治 療，通式中Ab包含能結(jié)合活化的巨噬細胞的配體，基團X包含免疫原、細胞毒素、或能夠改 變巨噬細胞功能的化合物。當(dāng)這種導(dǎo)向巨噬細胞的偶聯(lián)物施用于患有活化的巨噬細胞介導(dǎo) 的疾病狀況的患者時，可使偶聯(lián)的細胞毒素、免疫原或細胞因子濃集，并與活化的巨噬細胞 群結(jié)合，以殺滅活化的巨噬細胞，或改變巨噬細胞的功能?；罨木奘杉毎旱南蚴?活，使得所治療的由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況的病理特征終止或減少。上述偶聯(lián)物 通常是以組合物形式通過胃腸外施用，該組合物包含偶聯(lián)物及其可藥用的載體。偶聯(lián)物的 施用通常是連續(xù)的，直至疾病狀況的癥狀減輕或消失。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過施用偶聯(lián)物Ab_X，在患者體內(nèi)監(jiān)測或診斷活化 的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況，其中Ab包含能結(jié)合活化的巨噬細胞的配體，X包含成像劑，然 后，用能夠檢測成像劑的局部濃集的儀器對患者進行掃描。與以上概括的治療偶聯(lián)物類似， 成像或診斷偶聯(lián)物通常以診斷組合物的方式對患者施用，該組合物包含偶聯(lián)物和可藥用載 體。該組合物通常配制成用于腸胃外施用的劑型施用于患者，施用量是使局部的活化巨噬 細胞群能成像的有效量。偶聯(lián)物的成像劑組分的性質(zhì)根據(jù)成像方法學(xué)而決定。因此，舉例 來說，成像劑可以包含螯合劑部分和金屬陽離子，例如放射性核素或核磁共振成像造影劑， 如釓153。通常是將導(dǎo)向活化巨噬細胞的成像劑施用于患者，經(jīng)過一段時間，使成像劑遞送 和濃集到活化的巨噬細胞群中，患者經(jīng)過成像步驟即能夠用導(dǎo)向成像劑成像。
本發(fā)明的方法可以用于人的臨床醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)的應(yīng)用。因此，患有由活化的巨噬細 胞介導(dǎo)的疾病狀況的宿主動物可以是人；或者，在獸醫(yī)應(yīng)用的場合，宿主動物可以是實驗 室、農(nóng)業(yè)、家養(yǎng)或野生動物。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選將用于施用的偶聯(lián)物通過腸胃外施用 于患有該疾病狀況的動物或患者，例如，通過皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、或靜脈內(nèi)施用。或者 可將該偶聯(lián)物通過其它醫(yī)學(xué)上可用的方法施用于動物或患者，同時，可按照標準的方式或 緩釋劑型，例如使用緩速泵，施用有效的劑量。本發(fā)明的治療方法可以單獨使用，或與其他 已知的治療巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況的治療方法聯(lián)合。本發(fā)明的通式為Ab-X的配體偶聯(lián)物中，基團Ab是能夠與活化的巨噬細胞結(jié)合的配 體，很多結(jié)合巨噬細胞的部分中的任何一種都可使用?？刹捎玫呐潴w特別包括葉酸受體結(jié) 合配體，以及能夠與在活化的巨噬細胞中或巨噬細胞上獨特或優(yōu)先表達或呈遞的表面部分 結(jié)合的抗體、或抗體片段。在一個實施方案中，活化的巨噬細胞結(jié)合配體是葉酸、葉酸類似 物或其他葉酸受體結(jié)合分子?；罨木奘杉毎磉_38LD的GPI錨定的葉酸受體，該受體以 亞nmol以下的親和力(即< InM)與葉酸和葉酸衍生的化合物結(jié)合。在另一個實施方案中， 活化的巨噬細胞結(jié)合配體是特異的單克隆抗體或多克隆抗體，或能與活化的巨噬細胞特異 結(jié)合的抗體的Fab或scFv(即單鏈可變區(qū))片段。這樣就形成了本發(fā)明的用于診斷和監(jiān)測由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況的導(dǎo) 向活化巨噬細胞的偶聯(lián)物，并用于導(dǎo)向，從而將成像劑濃集在患者的活化的巨噬細胞群的 部位。在通式為Ab-X的偶聯(lián)物中，Ab是能與活化的巨噬細胞結(jié)合的配體，X包含成像劑。 在一個實施方案中，該成像劑包含螯合劑和金屬陽離子，通常是放射性核素或核磁共振成 像增強劑或造影劑，例如釓。這種其中的基團Ab是葉酸、葉酸的類似物、或其他葉酸受體 結(jié)合的配體的偶聯(lián)物在美國專No. 5，688，488中有詳細描述，該專利的說明書作為參考文 獻在此引入。上述的專利，以及在此引入作為參考文獻的相關(guān)美國專利No. 5，416，016和 No. 5，108，921，描述了制備本發(fā)明可用的螯合偶聯(lián)物的方法和實施例。本發(fā)明中導(dǎo)向巨噬 細胞的成像劑可以按照更早的專利中所述的一般方案制備和使用。本發(fā)明的診斷方法部分 基于下述的發(fā)現(xiàn)，即葉酸導(dǎo)向的偶聯(lián)物可以用于將偶聯(lián)的成像實體濃集在活化的巨噬細胞 群，從而能夠監(jiān)測和診斷以活化的巨噬細胞濃集在疾病部位為特征的疾病狀況。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了一種通過對患有由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾 病狀況的患者施用有效量的包含通式為Ab-X的偶聯(lián)物的組合物，其中Ab的定義如以上所 述，基團X包含細胞毒素、免疫原、或能夠改變巨噬細胞功能的化合物而治療由活化的巨噬 細胞介導(dǎo)的疾病狀況的方法?？捎脕硇纬捎糜诒景l(fā)明的方法的偶聯(lián)物的細胞毒性部分的例 子包括氯甲雙磷酸、炭疽、假單胞菌外毒素，通常這些細胞毒性組成成分要經(jīng)過修飾，使其 不與正常的細胞結(jié)合，還包括其他毒素或細胞毒性試劑，包括本領(lǐng)域公知的化學(xué)治療劑，如 腎上腺皮質(zhì)激素、烷化劑、抗雄激素藥物、抗雌激素藥物、雄激素、雌激素、抗代謝藥，例如阿 糖胞苷、嘌呤類似物、嘧啶類似物，以及氨甲蝶呤、白消安、卡鉬、苯丁酸氮芥、順鉬和其他鉬 化合物、他莫昔芬、紫杉酚、環(huán)磷酰胺、植物性生物堿、強的松、羥基脲、替尼泊苷、以及博萊 霉素、氮芥、亞硝基脲、長春新堿、長春堿、炎性和促炎劑等。這種毒素或細胞毒性成分可以 直接與活化巨噬細胞結(jié)合部分偶聯(lián)，例如與葉酸、或其他葉酸受體結(jié)合配體偶聯(lián)，或者，通 常可以通過與磷脂的共價連接而配制在脂質(zhì)體內(nèi)，該脂質(zhì)體本身可以作為巨噬細胞結(jié)合實 體的偶聯(lián)物而被用來導(dǎo)向。同樣，當(dāng)基團X包含能夠改變巨噬細胞功能的化合物，例如包含細胞因子IL-10或IL-Il時，該細胞因子可以與導(dǎo)向部分Ab直接地共價連接，其中的Ab舉 例來說是葉酸受體結(jié)合配體、或者是葉酸受體的抗體或抗體的片段；或者，可以將改變巨噬 細胞功能的細胞因子包入脂質(zhì)體內(nèi)，該脂質(zhì)體本身通過懸垂的巨噬細胞的導(dǎo)向?qū)嶓wAb，導(dǎo) 向活化的巨噬細胞，其中的Ab與一個或多個作為脂質(zhì)體成分的磷脂共價連接。在另一個實施方案中，配體_免疫原偶聯(lián)物可以與細胞毒性化合物聯(lián)合施用。列 于前面括號內(nèi)的化合物屬于適用于該目的的化合物。在本發(fā)明的另一個治療方法實施方案中，導(dǎo)向活化的巨噬細胞的偶聯(lián)物Ab-X中的 X基團包含免疫原，該配體-免疫原偶聯(lián)物能夠有效“標記”疾病患者體內(nèi)的與該疾病的發(fā) 病機制有關(guān)的活化巨噬細胞群，以便通過內(nèi)源免疫應(yīng)答或通過共同施用的抗體而特異地消 除巨噬細胞。在本發(fā)明的治療方法中，配體-免疫原偶聯(lián)物的使用促進了活化巨噬細胞群 的免疫應(yīng)答介導(dǎo)的消除。這種免疫應(yīng)答介導(dǎo)的消除可通過內(nèi)源免疫應(yīng)答，或通過由共同施 用的抗體而實施的被動免疫應(yīng)答來實現(xiàn)。上述的內(nèi)源免疫應(yīng)答可包括體液的應(yīng)答、細胞介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答、以及任何其他宿主動物的內(nèi)源免疫應(yīng)答，包括補體介導(dǎo)的細胞裂解、抗體依 賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、導(dǎo)致吞噬的抗體調(diào)理作用、引起細胞凋亡信號傳遞的基 于抗體結(jié)合的受體簇集、抗增殖、或分化、以及遞送的抗原/半抗原的直接免疫細胞識別。 預(yù)期內(nèi)源免疫應(yīng)答會利用調(diào)節(jié)免疫細胞的增殖和遷移等過程的細胞因子的分泌。內(nèi)源免疫 應(yīng)答可包括例如B細胞、T細胞的免疫細胞的參與，這些細胞包括輔助性和細胞毒性的T細 胞、巨噬細胞、天然殺傷細胞、中性粒細胞、LAK細胞等。在另一個實施方案中，可以使配體-免疫原偶聯(lián)物內(nèi)化，并可將免疫原降解并呈 遞在巨噬細胞的表面，以便被免疫細胞所識別，從而引發(fā)直接對呈遞降解的免疫原的巨噬 細胞的免疫應(yīng)答。體液應(yīng)答可以是由以下過程誘導(dǎo)的應(yīng)答例如正常計劃的接種、用天然的抗原，或 非天然的抗原或半抗原，例如異硫氰酸熒光素(FITC)的主動免疫、用非天然的抗原誘導(dǎo)新 的免疫性。主動免疫包括正常的接種方案之外的多次非天然抗原或半抗原的注射，以誘導(dǎo) 新的免疫性。體液應(yīng)答也可以由先天的免疫性所產(chǎn)生，在這種情況下，宿主動物具有天然 的預(yù)先存在的免疫性，例如對α-半乳糖基的免疫性?；蛘?，可以通過對宿主動物施用抗 體，例如由血清收集的天然抗體，或者由基因工程方法或不是基因工程方法制備的單克隆 抗體，包括人源化的抗體，來建立被動免疫。在患者的預(yù)先存在的抗體滴度對其他可能存在 的抗原無治療效果的情況下，利用特定量的抗體試劑來建立被動免疫；以及使用配體_免 疫原偶聯(lián)物，其中被動施用的抗體是抗該免疫原的抗體，將提供一套標準試劑供使用的好 處。被動施用的抗體可以與配體-免疫原偶聯(lián)物“共同施用”，共同施用定義為將抗體在配 體-免疫原偶聯(lián)物的施用之前、同時、或之后的時間施用。預(yù)期預(yù)先存在的抗體、誘導(dǎo)的抗 體、或被動施用的抗體會通過配體-免疫原偶聯(lián)物與活化的巨噬細胞群的優(yōu)先結(jié)合而轉(zhuǎn)向 活化的巨噬細胞，然后通過補體介導(dǎo)的裂解、ADCC、抗體依賴性吞噬、或受體的抗體簇集而 將這種致病細胞殺滅。細胞毒性的處理也可以包括其他類型的免疫應(yīng)答，例如細胞介導(dǎo)的 免疫、以及第二應(yīng)答，該第二應(yīng)答在吸引的抗原呈遞細胞吞噬活化的巨噬細胞時出現(xiàn)，并將 該細胞的抗原呈遞到免疫系統(tǒng)，以消除呈遞這類抗原的其他的活化巨噬細胞。用于制備本發(fā)明的治療方法中所用的偶聯(lián)物的可接受的免疫原是能夠引起宿主 動物產(chǎn)生抗體的免疫原；或者以前已經(jīng)在宿主動物中引起抗體的產(chǎn)生、形成預(yù)先存在的免疫性的免疫原；或是構(gòu)成部分先天免疫系統(tǒng)的免疫原?；蛘?，可將抗該免疫原的抗體施用于 宿主動物，以建立被動免疫。用于本發(fā)明的合適的免疫原包括抗原或抗原肽，對該抗原或抗 原肽已經(jīng)通過正常計劃的接種，或以前自然與脊髓灰質(zhì)炎病毒、破傷風(fēng)、傷寒、風(fēng)疹、麻疹、 腮腺炎、百日咳、結(jié)核和流感抗原，以及α-半乳糖基的接觸而建立了預(yù)先存在的免疫。在 這種情況下，配體-免疫原偶聯(lián)物可用來將先前獲得的體液或細胞免疫重新定向到宿主動 物的活化巨噬細胞群，以消除這些細胞。其他合適的免疫原包括宿主動物通過對非天然的 抗原或半抗原，例如異硫氰酸熒光素(FITC)或二硝基苯的免疫已產(chǎn)生了新的免疫性的抗 原或抗原肽，和對其存在先天免疫性的抗原，例如超抗原和胞壁酰二肽。還考慮到，MHC I限 制性肽可以與配體連接，用于使細胞免疫性重新定向于巨噬細胞并引起T細胞殺滅巨噬細 胞。巨噬細胞結(jié)合配體和免疫原、細胞毒性試劑、細胞因子或成像劑，在根據(jù)本發(fā)明可 能形成偶聯(lián)物而使用時，可以通過使用任何一種本領(lǐng)域公知的形成復(fù)合物的方法而進行偶 聯(lián)。這種方法可以包括配體直接、或通過連接基團如二價的接頭間接地與免疫原通過共價、 離子、或氫鍵鍵合。偶聯(lián)物一般通過配體與導(dǎo)向的實體間的共價鍵合而形成，該共價鍵通過 復(fù)合物相應(yīng)成分上的酸、醛、羥基、氨基、或疊氮基之間形成酰胺、酯或亞氨鍵而生成。另一 種方法是如以上所述，配體復(fù)合物可以是包含脂質(zhì)體的復(fù)合物，其中導(dǎo)向的實體(即成像 劑、或免疫原、細胞毒性劑或巨噬細胞功能改變劑)包含在脂質(zhì)體內(nèi)，該脂質(zhì)體本身與活化 的巨噬細胞結(jié)合配體共價連接。在本發(fā)明的一個實施方案中，配體是葉酸、葉酸的類似物、或任何其他葉酸受體結(jié) 合分子，葉酸配體通過下述過程與導(dǎo)向?qū)嶓w偶聯(lián)利用三氟乙酸酐通過蝶?；B氮化物中 間體制備葉酸的Y-酯。該過程引起葉酸配體的合成，通過葉酸的谷氨酸基團的Y-羧基 與導(dǎo)向的實體偶聯(lián)?；蛘撸~酸的類似物可以通過谷氨酸基團的α-羧基部分或α和Υ 羧酸實體進行偶聯(lián)。本發(fā)明的一個方面，根椐本發(fā)明的分子式Ab-X所采用的偶聯(lián)物用于配制包含有效 量的偶聯(lián)物及其可藥用載體的治療或診斷組合物。通常，這種組合物是配制成腸胃外使用 的形式。根據(jù)本發(fā)明，有效使用的該偶聯(lián)物的量取決于很多參數(shù)，包括需要治療或診斷的 疾病性質(zhì)、偶聯(lián)物的分子量、它的施用途徑及其在組織中的分布、以及與其他治療或診斷試 劑共同使用的可能性。施用于患者的有效量一般根據(jù)身體的表面積、患者的體重、醫(yī)生對 患者病情的估計。有效量的范圍可以為約lng/kg-約lmg/kg，更典型的是約lyg/kg-的 500 μ g/kg，最典型的是約 1 μ g/kg-約 100 μ g/kg。用于監(jiān)測或診斷時，成像步驟通常在導(dǎo)向活化的巨噬細胞的成像劑施用后約1-6 小時進行。任何施用配體偶聯(lián)物的有效方案都可采用。例如，配體偶聯(lián)物可以按單次劑量施 用，或可以分開按每天多次劑量的方式施用。此外，一種交錯的方式，例如每周1-3天可以 用來代替每天治療的方式，為了對本發(fā)明加以限定，這種周期性的或交錯的日常方案認為 是與每天的治療是等效的，并屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個實施方案中，采用多次注射配體 偶聯(lián)物的方式，例如以12-72小時的間隔或48-72小時的間隔，對患者治療。初次注射后，可 以按數(shù)天或數(shù)月的間隔對患者給予補充注射配體偶聯(lián)物，補充注射可以防止疾病的復(fù)發(fā)。 或者，可以預(yù)防性施用配體偶聯(lián)物，以防止已知有形成巨噬細胞介導(dǎo)的病癥傾向的患者發(fā)生疾病。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以使用一種以上的配體偶聯(lián)物，例如，宿主動物可 以用異硫氰酸熒光素和二硝基苯預(yù)先免疫，隨后用與相同或不同的活化巨噬細胞導(dǎo)向配體 連接的異硫氰酸熒光素和二硝基苯，按照共同施用的方案進行治療。根據(jù)本發(fā)明，配體偶聯(lián)物通過腸胃外施用，最典型的是腹膜內(nèi)注射、皮下注射、肌 內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射或鞘內(nèi)注射。配體偶聯(lián)物也可以用滲透泵遞送給患者。腸胃外劑型的 例子包括偶聯(lián)物的水溶液，例如等滲鹽水的溶液、5%葡萄糖或其他眾所周知的可藥用液體 載體，如乙醇、甘油、酯和酰胺。根據(jù)本發(fā)明所采用的腸胃外組合物可以是包含一劑或多劑 可重配的凍干形式組合物。本發(fā)明的另一個方面，配體偶聯(lián)物可以配制成本領(lǐng)域已知的許 多緩釋劑型中的任何一種，例如美國專利No. 4，713，249 ；5, 266，333 ；和5，417，982中所描 述的生物可降解的碳水化合物基質(zhì)，其公開的內(nèi)容作為參考文獻在此引入。實施例1材料EC20 (連接葉酸的螯合劑99mTc)、EC28 (相同的99mTc螯合復(fù)合物，無葉酸)、以及 葉酸-異硫氰酸熒光素(葉酸-FITC)由Endocyte，Inc. (West Lafayette, IN)饋贈。熱滅 活的丁酸支原體購自BD Biosciences (SparkS，MD)。葉酸、輕礦物油、氯甲雙磷酸、膠原酶-A 和鏈霉抗生物素蛋白-R-藻紅蛋白購自Sigma Chamical Co. (St. Louis, MO)，Dulbecco的 改進的 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)購自 Gibco-BRL (Gathersberg, MD)。3H-葉酸購自 American RadioIabeIedChemicals, Inc. (St. Louis, M0), Microcon -30 _ 自 Millipore Corp. (Bedford, MA)。RK-4-生物素和 ED2-R-藻紅蛋白抗體分別由 BachemBiosciences，Inc. (Pphiladepgia, PA)禾口 Accurate Chemical andScientific Corp. (ffestbury, NY)獲得。實施例2關(guān)節(jié)炎的動物模型對 150_200g 的雌性劉易斯大鼠(Charles RiverLaboratories, Inc.， Wilmington,ΜΑ)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，η = 4/劑量組。簡單地說，將0. 5mg懸浮于礦物油(5mg/ml) 中的熱滅活的丁酸支原體，在第O天，注射入用氯胺酮和甲卞噻嗪麻醉后的大鼠的左后足。 使疾病進展21天，根據(jù)每日的基準對動物進行稱重，以保證其健康狀態(tài)。根據(jù)注射的腳爪 明顯腫脹、由于全身關(guān)節(jié)炎的全身進展而使所有未注射的肢體進展性腫脹、以及受影響肢 體的X光照片分析，證明所有治療的動物都患上了關(guān)節(jié)炎。所有的大鼠在葉酸-FITC施用 之前，維持缺乏葉酸的飲食(DYEYS，Inc.，Bethlehem, PA) 3周，以便將血清中的葉酸水平降 低至生理上相關(guān)的濃度。對照大鼠也維持缺乏葉酸的飲食，但不誘導(dǎo)其形成關(guān)節(jié)炎。實施例3內(nèi)源巨噬細胞的消除通過用脂質(zhì)體氯甲雙磷酸殺滅內(nèi)源的巨噬細胞來評價與巨噬細胞無關(guān)的葉 酸連接的成像劑的攝取。將卵磷脂酰膽堿(60mol% )和膽固醇(40mol% )的簿膜在 等滲的氯甲雙磷酸溶液(250mg/ml)中再水合，形成了脂質(zhì)體。然后用IOml熱管擠出 器(LipexBiomembranes, Vancouver, Canada)將脂質(zhì)體通過IOOnm的聚碳酸酯薄膜擠 出10次，產(chǎn)生小的單層泡。未包裹的氯甲雙磷酸通過Spectrapor300，OOOMr-cutoff 醋酸纖維素膜(Spectrum Laboratories, RanchoDomingues, CA)透析除去，并按照 J. Microencapsul. 3 (2) 109-14 (1986)中所述測定余下的脂質(zhì)體中氯甲雙磷酸的濃度。在誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎17天之后，成像劑(EC20)的施用3天之前，使指定要耗盡巨噬細胞的大鼠接受單 次含有20mg氯甲雙磷酸的氯甲雙磷酸脂質(zhì)體的腹膜內(nèi)注射。實施例4閃爍照相和生物分布分析成像劑施用12小時之前，所有的動物接受5ml正常鹽水的皮下注射，以保證 未結(jié)合的成像劑的適當(dāng)排泄。誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎21天后，對大鼠(每組的η = 3)腹膜內(nèi)注 射500 μ Ci (2. 3nmol/大鼠)的EC20(葉酸+螯合劑)、EC20+500倍摩爾過量的葉酸，或 EC28(無葉酸部分)。4小時以后，大鼠經(jīng)受核閃爍照相成像或生物分布分析。為了進行閃爍照相，用氯胺酮和甲卞噻嗪麻醉大鼠，并以腹側(cè)位放在圖像采集表 面。用Technicare Omega 500 Sigma 410放射性同位素γ照相機以每分鐘50-75，000次 的計數(shù)速度操作1分鐘，以采集圖像。在采集全身圖像后，用1/8”鉛板封閉上身(膝蓋骨 以上)的射線，得到后肢的圖像。用裝備MedasysTMPinnacle軟件的基于MedasysTMMS-DOS 的計算機對全部數(shù)據(jù)進行分析。對于生物分布的分析，通過腹膜內(nèi)注射nebutal或戊巴比妥鈉使大鼠安樂死。然 后收集肝、脾、心、肺、腸和腎，并用Y計數(shù)器(PackardBioScience Co. ,Meridian,CT)通過 計數(shù)測定每種組織的放射性。實施例5組織的葉酸受體水平的測定每種組織的葉酸受體水平測定如下。簡單地說，將組織均質(zhì)化并通過離心分離細 胞膜。使膜蛋白溶解過夜，然后轉(zhuǎn)移至Microcon -30過濾裝置，并用50nM 3H-葉酸溫 育。用于測定非特異結(jié)合的每個樣本的2個重復(fù)試樣同樣也暴露于50nM 3H-葉酸治療，但 在1000倍過量的未標記的葉酸存在下進行。將未結(jié)合的3H-葉酸通過膜洗去后，回收結(jié)合 3H-葉酸的膜蛋白，并在閃爍計數(shù)器(Packard BioScience Co.)中計數(shù)，以確定每克組織中 活性葉酸受體的數(shù)量。實施例6葉酸受體在肝臟中表達的細胞類型的鑒定首先用氯胺酮和甲卞噻嗪使患關(guān)節(jié)炎的和健康的大鼠麻醉，然后從下腹部至胸腔 切開中線切口。將24號的導(dǎo)管插入肝靜脈，同時將24號的針插入左心室作為灌注液的出 口。然后通過導(dǎo)管先輸入普通的鹽水，隨后輸入膠原酶A溶液(0. 05 %的Gey平衡鹽溶液)， 對大鼠進行灌注。每種溶液以20ml/分的速度灌注2分鐘。灌注后，立即將肝取出，除去 外層膜組織。剩下的膠狀組織懸浮于膠原酶-A溶液(0.025%溶于DMEM的溶液)中，并在 1 μ M葉酸-FITC+lmM葉酸存在下、37°C下溫育2小時。然后將細胞洗滌3次以除去未結(jié)合 的葉酸-FITC，并直接制備用于流式細胞術(shù)。實施例7流式細胞術(shù)的分析樣品制備及分析已暴露于葉酸-FITC的肝細胞制備物用氯化銨裂解緩沖液(150mMNH4Cl，IOmM KHCO3, ImM EDTA，pH7. 4)4°C下處理10分鐘，以裂解紅細胞。用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次后， 剩余的細胞與用ED2R-藻紅蛋白標記的小鼠抗_大鼠巨噬細胞抗體，或RK-4生物素標記的 小鼠抗-大鼠粒細胞抗體一起在4°C下溫育1小時。將細胞再洗2次，并將已接受生物素化的第一抗體的細胞進一步與鏈霉抗生物素蛋白-R-藻紅蛋白溫育30分鐘。經(jīng)過最后2次 洗滌后，在FACScan Coulter XL流式細胞分析儀上檢查細胞的FITC和藻紅蛋白雙重染色。實施例8免疫療法介導(dǎo)的抗佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的保護作用按照實施例2所述的方案誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，研究葉酸-FITC偶聯(lián)物(葉酸異硫氰酸熒 光素偶聯(lián)物)的抗佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。在施用丁酸支原體(佐劑)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎之前的38 和10天，用FITC-KLH(150 μ g)在用于試驗中的每只大鼠的尾基部免疫，誘導(dǎo)抗FITC的抗 體。FITC-KLH的免疫聯(lián)合佐劑一起進行(該佐劑即為，例如TiterMax Gold(150 μ g)，明礬 (150 μ g)，或GPI (150 μ g)，這些都是誘導(dǎo)抗FITC抗體的佐劑，與誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的佐劑相反)。 然后在第0天，在免疫動物的左足底注射0. 5mg的熱滅活的丁酸支原體(佐劑)，開始誘發(fā) 關(guān)節(jié)炎。然后在佐劑(丁酸支原體)注射后第1，2，3，9，11和14天，對大鼠腹膜內(nèi)注射鹽 水(對照大鼠)或2000nmole/kg的葉酸FITC(FF)。每天用卡尺測量左足和右足的尺寸。 參照圖9，將注射佐劑的足的測量值(上面的兩條曲線)和未治療的足(下面的兩條曲線) 的測量值作圖。注射佐劑的足的腫脹突然增加是由于無葉酸受體的中性粒細胞的流入。因 此，免疫治療對腳爪腫脹的狀況無影響。但是，約10天之后，活化的巨噬細胞侵襲注射的足 和未注射的足，造成骨的降解，并進一步發(fā)炎。這些活化的巨噬細胞含有功能性的葉酸受 體，并如圖所示，通過與例如葉酸-FITC的葉酸半抗原偶聯(lián)物的結(jié)合，可以使該細胞消失或 減少。實施例9關(guān)節(jié)炎大鼠的葉酸導(dǎo)向的成像按照實施例2和4所述方案。如以上所述，活化而不是靜息的巨噬細胞表達維生 素葉酸的受體。為了測定是否能利用葉酸將99mTc導(dǎo)向關(guān)節(jié)炎的炎癥部位，將葉酸連接的 99mTc螯合劑EC20(參見圖8)通過腹膜內(nèi)對大鼠(η = 5/組)施用，并用、照相機獲得 閃爍照相的圖像。由于EC20的快速清除，施用后至少經(jīng)過4小時，可以得到良好的對比度 (

圖1)。重要的是，關(guān)節(jié)炎大鼠的全身攝取明顯比健康的大鼠更強，而且，EC20與飽和劑量 的游離葉酸一起施用時，該攝取量明顯減少。這說明了所有組織的攝取主要由葉酸特異的 受體確定。器官對EC20的強烈攝取防礙了關(guān)節(jié)炎大鼠全身圖像中肢體的顯現(xiàn)。但是，將身體 中部和上部的放射遮蔽時，很容易獲得后肢的圖像。利用這樣的遮蔽，關(guān)節(jié)炎的肢體呈現(xiàn)出 比健康的肢端更強的EC20攝取，而且這種攝取在過量游離葉酸存在下完全消失(圖1)。此 外，炎癥最嚴重的關(guān)節(jié)炎動物的左后足表現(xiàn)出比受影響較輕的右后足更強的攝取(圖1)。由上述的全身圖像可以得出以下結(jié)論在關(guān)節(jié)炎動物中，腹部器官攝取了大部分 的EC20。為了證實該估計，將肝、脾和腎取出并分別成像(圖2)。關(guān)節(jié)炎大鼠的肝表現(xiàn)出最 高的EC20攝取，而健康大鼠的肝呈現(xiàn)最少的攝取。只有取自關(guān)節(jié)炎大鼠的脾臟能夠顯現(xiàn)。 游離葉酸完全阻斷了 EC20在肝、脾臟的攝取，但游離的維生素僅部分地減少腎的攝取。實施例10巨噬細胞減少的作用除了施用0. 25mCi的EC20以外，其余按照實施例2、3和4中所述的方案進行。為 了測定巨噬細胞是否攝取EC20，采用脂質(zhì)體氯甲雙磷酸制劑全身性消除存在的巨噬細胞(η = 3只大鼠/組)。氯甲雙磷酸治療后4天，對腳爪的大小評價顯示氯甲雙磷酸治療的 大鼠的炎癥明顯地比未治療的大鼠輕(數(shù)據(jù)未表示)。為了測定巨噬細胞消除是否影響對 葉酸連接的成像劑的攝取，對氯甲雙磷酸治療的大鼠進行EC20生物分布的分析，并與健康 大鼠和未用氯甲雙磷酸治療的關(guān)節(jié)炎大鼠的同樣分析進行比較。如圖3所示(黑色條代表 關(guān)節(jié)炎大鼠，淺灰色條代表健康大鼠，深灰色條代表用氯甲雙磷酸治療減少巨噬細胞的關(guān) 節(jié)炎大鼠)，巨噬細胞的減少，使關(guān)節(jié)炎大鼠的肝對EC20的攝取降低約20倍，而保留在脾和 腸中的EC20減少因數(shù)3。在大多數(shù)組織中，氯甲雙磷酸治療減少了 EC20的攝取，甚至低至 在健康大鼠中觀察到的水平，證實了活化的巨噬細胞是大多數(shù)EC20保留在正常組織中的 原因的假設(shè)。相反，在巨噬細胞減少的大鼠中，腎對EC20的攝取有提高，最可能的原因是活 化的巨噬細胞減少了 EC20的內(nèi)化，提供更多的EC20用于與腎的葉酸受體結(jié)合。實施例11關(guān)節(jié)炎組織中葉酸受體介導(dǎo)的EC20的攝取按照實施例2和4中所述的方案。進行2種補充的生物分布研究，以證實關(guān)節(jié)炎 大鼠的組織對EC20的攝取是由葉酸受體介導(dǎo)的(η = 3只大鼠/組)。首先，在500倍過量 的游離葉酸存在(淺灰色條)和不存在(黑色條)的情況下，檢查EC20的生物分布。如圖 4所示，除腎以外，幾乎所有的組織都可看到EC20攝取的完全消失，表明該結(jié)合確實是由葉 酸受體介導(dǎo)的。實際上，過量的葉酸通適競爭將保留在肝、脾、心、肺、腸和血液中的EC20減 少至接近本底水平(圖4)。其次，為了證實葉酸在EC20介導(dǎo)的螯合的99mTc導(dǎo)向中所起的 作用，對缺少葉酸部分的同樣復(fù)合物(EC28)的生物分布也進行了檢查(深灰色條)。仍如 圖4所顯示，除了腎以外，在所有的組織中，EC28的攝取可忽略不計，這種情況下，非導(dǎo)向的 復(fù)合物的保留類似于競爭的葉酸存在下的EC20的保留。實施例12葉酸受體在關(guān)節(jié)炎大鼠各種組織中的表達采用實施例2、4和5中所述的方案。由上述的結(jié)果提示葉酸受體負責(zé)組織對EC20 的攝取。為了證實該假定，申請人試圖直接對各種大鼠組織中的葉酸結(jié)合蛋白進行定量?？?以在每種被檢查的主要器官中對活性葉酸受體進行檢測，關(guān)節(jié)炎大鼠的FR水平明顯增高 (圖5 ；黑色條=關(guān)節(jié)炎大鼠；淺灰色條=健康大鼠)。此外，在生物分布的研究中可以看到 FR含量與EC20的攝取有很好的相關(guān)性。實際上，根據(jù)同一種器官對EC20類似的攝取，F(xiàn)R 分析顯示關(guān)節(jié)炎大鼠的肝和脾中的受體水平大致相等(圖4)。顯然，通過氯甲雙磷酸治療 消除全身的巨噬細胞(深灰色條)降低了所有關(guān)節(jié)炎組織中的葉酸受體水平(圖5)，該結(jié) 果也與EC20生物分布的分析非常一致。最后，F(xiàn)R分析證實了關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)和氯甲雙磷酸的 治療都沒有改變在腎或心中的FR水平，可以認為，在腎或心中，F(xiàn)R與活化的巨噬細胞無關(guān)。實施例13功能性葉酸受體在關(guān)節(jié)炎大鼠的肝巨噬細胞上的表達采用實施例2、4、6和7中所述的方案。為了進一步證實關(guān)節(jié)炎大鼠的肝對EC20攝 取量的提高是由于巨噬細胞群所引起的，將膠原酶A灌注的大鼠的肝切除，并用葉酸-FITC 作為FR表達的熒光標記，檢查其解聚細胞對葉酸偶聯(lián)物的攝取。還通過用大鼠肝巨噬細胞 特異的抗體標記同樣的肝懸浮液，有可能表明該巨噬細胞確實是在關(guān)節(jié)炎動物中表達提高 水平的葉酸受體的細胞類型(圖6)。由此，流式細胞分析表明，與健康大鼠相比，關(guān)節(jié)炎大鼠的70%的肝巨噬細胞與葉酸-FITC結(jié)合，而健康大鼠與葉酸-FITC結(jié)合的肝巨噬細胞為 30% (圖6)。此外，關(guān)節(jié)炎巨噬細胞的FITC強度高于健康肝的巨噬細胞。因為葉酸-FI TC的結(jié)合受到過量游離葉酸(ImM)存在的抑制，我們得出結(jié)論肝巨噬細胞對葉酸偶聯(lián)物 的攝取是由葉酸受體介導(dǎo)的。我們還采用對粒細胞特異的抗體檢查組織浸潤的中性粒細胞是否可能攝取葉酸 偶聯(lián)物。雖然在肝臟發(fā)現(xiàn)非常少量的中性粒細胞，這些被檢測出的中性粒細胞未呈現(xiàn)出結(jié) 合葉酸-FITC的能力(數(shù)據(jù)未示出)。對Mac-I+外周血細胞也進行了測試，同樣發(fā)現(xiàn)沒有 結(jié)合葉酸偶聯(lián)物的親和力(數(shù)據(jù)未示出)。實際上，也不存在分類為FITC熒光陽性的外周 血細胞，由此提示，只有存在的組織巨噬細胞(很明顯，只有這些細胞的亞群)在肝中表達 FR。最后，為了開始測試是否有可能用葉酸連接的藥物在患者體內(nèi)導(dǎo)向活化的巨噬細 胞，我們獲得允許檢查28位登記參加最近完成的γ成像劑，即IllIn-DTPA-葉酸臨床試驗 的卵巢癌可疑患者的全身圖像。如圖7所示，一位患者的右膝呈現(xiàn)明顯的成像劑攝取，但左 膝無攝取。很明顯，沒有其他患者顯示任何可測出的關(guān)節(jié)的攝取。根據(jù)要求，參與的醫(yī)生與 匿名的患者接觸，詢問她是否經(jīng)歷任何慢性的關(guān)節(jié)不適。該醫(yī)生反映，患者報告為右膝關(guān)節(jié) 炎。討論活化的巨噬細胞被認為與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)生密切相關(guān)?；罨木奘杉毎?通過分泌金屬蛋白酶直接破壞關(guān)節(jié)組織，并通過釋放細胞因子吸引/激活其他免疫細胞。 關(guān)節(jié)組織中活化的巨噬細胞的定量可能有診斷價值，因為活化的巨噬細胞含量與人的關(guān)節(jié) 的破壞和不良的疾病預(yù)后密切相關(guān)。接受EC20的大鼠的Y照相機閃爍照相表明關(guān)節(jié)炎的附屬部分確實被葉酸導(dǎo)向的 99mTc所照亮。相反，不能看見健康大鼠的腿和足，表明成像劑應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎的選擇性。雖 然佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中，內(nèi)部器官的強度也增加，但來自這種組織的干擾看來并不影響該 方法，因為來自內(nèi)部器官的Y射線很容易屏蔽。在注射EC20后1-2小時之內(nèi)可獲得優(yōu)良 的對比度，該事實進一步表明成像劑的施用、Y照相機閃爍照相、圖像的分析可以在同一試 驗中完成。在佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的大鼠中，已記載了巨噬細胞的全身活化。因此，在EC20攝取 的提高中，巨噬細胞的具體參與是很重要的，因為以前從未在關(guān)節(jié)炎動物中檢查過葉酸導(dǎo) 向的成像劑。為此，進行3個實驗。首先，采用載有氯甲雙磷酸的脂質(zhì)體全身性消除被處理 大鼠的巨噬細胞。不僅引起組織的FR水平大大降低，而且EC20在富含巨噬細胞的器官中 的攝取也幾乎消除，表明存在的巨噬細胞確實可以解釋是FR表達和EC20保留在RES器官 內(nèi)的原因。其次，用膠原酶處理使肝細胞解聚，并評價每個細胞對葉酸偶聯(lián)物的攝取。如圖 6所指出，大量被測試為葉酸偶聯(lián)物的攝取陽性的細胞也分類為巨噬細胞標記ED2的陽性， 證實FR確實存在于巨噬細胞上。最后，由于已知其它免疫和髓細胞在佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠 的組織中是增高的，可以想象，還有另外的外滲血細胞類型可能參與EC20的攝取。但是，無 論是肝侵潤的粒細胞，或是循環(huán)中的任何血細胞都不呈現(xiàn)任何與葉酸-FITC結(jié)合的能力。 因此，活化的巨噬細胞看來是關(guān)節(jié)炎大鼠的器官中使葉酸偶聯(lián)物內(nèi)化的主要細胞類型。令人驚奇的是在健康大鼠中竟發(fā)現(xiàn)高達30%的肝巨噬細胞也表達葉酸受體(圖6)。因為在靜息的滑膜巨噬細胞中未發(fā)現(xiàn)功能性的葉酸受體，這就引導(dǎo)人們?nèi)ネ茰y在健康 大鼠的葉酸-FITC結(jié)合部分可能也構(gòu)成活化的群體。兩種觀察到的結(jié)果支持這種假設(shè)。第 一，健康的組織在受到例如外來抗原的免疫刺激后，也發(fā)現(xiàn)有活化的巨噬細胞。由于肝在清 除體內(nèi)外源物質(zhì)中所起的作用，低水平的存留巨噬細胞的活化看來也不是不合理的。第二， 基于局部炎癥和全身巨噬細胞的活化的誘導(dǎo)，肝的葉酸-FITC (和EC20)結(jié)合群體顯著地增 加。由于現(xiàn)已證實了利用葉酸將連接的分子遞送至活化的巨噬細胞的能力，葉酸連接 的成像劑可以對早期出現(xiàn)或繼續(xù)進展的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進行估計。由于活化的巨噬細胞 也可以引起/加重移植物抗宿主疾病、多發(fā)性硬化、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、牛皮癬、骨髓 炎，甚至動脈粥樣硬化，利用葉酸連接的成像/造影劑可能有助于對這些疾病的診斷/評 價。關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)和肝的活化巨噬細胞表現(xiàn)出對葉酸偶聯(lián)物的大量攝取，這表明了無論解 剖部位如何，巨噬細胞在都可以被有效導(dǎo)向。實施例14免疫治療介導(dǎo)的抗佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的保護作用對于圖10所示的測定，除了每天施用3000nmol/kg的葉酸-FITC(在第1、2、和3 天施用3劑)和利用植入大鼠的腹膜腔的滲透泵遞送葉酸-FITC以外，其余按實施例8中 所述的方案進行。通過腹膜內(nèi)注射，將氨甲蝶呤(MTX)按每劑0. 15mg的量在施用佐劑后的 第1、8、和15天每天注射1次。用MTX代替葉酸FITC，用于MTX治療的動物。圖10給出左 腳爪(注射的)和右腳爪(未注射的)的結(jié)果。該結(jié)果表明葉酸-FITC(FF)以及MTX抑制 佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。實施例15免疫治療介導(dǎo)的抗佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的保護作用除了只測量右腳爪的體積，以及葉酸-FITC按3000、600、和120nmol/kg的劑量 (圖11)施用之外，其余按照實施例14中所述的方案進行。FF還按3000nmOl/kg如實施例 14所述以3劑(在圖11表示為“3劑”)施用，或如實施例8中所述在1、2、3、9、11、和14 天(在圖11中表示為FF3000)施用。結(jié)果表明，F(xiàn)F抑制在關(guān)節(jié)炎大鼠右腳爪的佐劑誘導(dǎo) 的關(guān)節(jié)炎(由于關(guān)節(jié)炎的全身進展，假定炎癥出現(xiàn)在未注射的右腳爪)，對于佐劑誘導(dǎo)的關(guān) 節(jié)炎的治療，用FF的延長治療方式比3次初始劑量更有效。實施例16免疫治療介導(dǎo)的抗佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的保護作用 除了用MTX代替FF按0. 15mg的劑量(FF+低劑量、早期MTX、晚期MTX和晚期 FFMTX)治療某些動物之外，其余按照實施例8中所述的方案進行(圖12)。其他動物用 0. 75mg MTX(FF+中劑量)或1. 5mg MTX(FF+高劑量)治療。對于“早期MTX”治療，在誘導(dǎo) 關(guān)節(jié)炎后1、8、和15天對大鼠注射MTX。對于“晚期MTX治療”，在佐劑施用后8和15天對 大鼠注射MTX。所有的測量都是對未注射的右腳爪進行。結(jié)果表明，葉酸-FITC與MTX的聯(lián) 合(早期或后期治療，以及低、中、高劑量的MTX)對佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的抑制比單獨用FF 更好。實施例17免疫治療介導(dǎo)的抗佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的保護作用
對于圖13所示的結(jié)果，除了對某些動物在關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)后1、8和15天單獨用 MTX (0. 15mg)治療，或如實施例14中所述，用MTX(0. 15mg ;1、8、和15天)與FF聯(lián)合治療以 外，其余按照實施例8中所述的方案進行。結(jié)果表明，F(xiàn)F和MTX的聯(lián)合對佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié) 炎的抑制程度高于單獨使用MTX或FF。實施例18免疫治療介導(dǎo)的抗佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的保護作用除了將IL-10 (10，000U ；FF10)或 IL-2 (3 μ g/kg ；FF2)與用 FF 治療一起施用(即 將該細胞因子在佐劑施用后1、2、3、9、11和14天通過腹膜內(nèi)注射施用；參見圖14)以外，其 余按照實施例8中所述方案進行。對未注射的右腳爪進測量。結(jié)果表明IL-10或IL-2阻 止了由FF治療引起的對佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的抑制。將上述所有的免疫治療結(jié)果一并考慮， 表明對巨噬細胞有細胞毒性的葉酸連接劑可以用于治療巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況。實施例19關(guān)節(jié)炎大鼠的葉酸導(dǎo)向的圖像對于圖15所示的分析結(jié)果，除了某些動物分別如在實施例8和14中所述用 FF(2000nmol/kg ；1、2、3、9、11 和 14 天)或MTX(0. 15mg ；1、8 禾口 15 天)治療以外，其余按照 實施例2和4中所述的方案進行。結(jié)果表明，除腎以外，F(xiàn)F或MTX阻止了在所有被檢查的器 官中對EC20的攝取。在腎組織中，所檢測的EC20增加的原因有可能是大多數(shù)器官對EC20 攝取的減少提供了更多的EC20通過腎排泄。
權(quán)利要求
通式為Ab X的偶聯(lián)物或復(fù)合物在制備用于治療或監(jiān)測/診斷關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途，其中基團Ab包含葉酸受體結(jié)合配體或其類似物，并且當(dāng)所述綴合物用于制備治療關(guān)節(jié)炎的藥物時，基團X包含免疫原或細胞毒素，并且當(dāng)所述偶聯(lián)物用于制備監(jiān)測/診斷關(guān)節(jié)炎的藥物時，基團X包含成像劑，其中葉酸受體結(jié)合配體或其類似物通過葉酸受體結(jié)合配體或其類似物的谷氨酸的γ 羧基部分與免疫原、細胞毒素或成像劑偶聯(lián)。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中基團X包含免疫原。
3.權(quán)利要求1所述的用途，其中基團X包含細胞毒素。
4.權(quán)利要求1所述的用途，其中的基團X包含成像劑。
5.權(quán)利要求4所述的用途，其中成像劑包含金屬螯合部分。
6.權(quán)利要求5所述的用途，其中成像劑進一步包含金屬陽離子。
7.權(quán)利要求6所述的用途，其中金屬陽離子是核磁共振成像增強劑。
8.權(quán)利要求6所述的用途，其中金屬陽離子是放射性核素。
9.權(quán)利要求8所述的用途，其中放射性核素是锝的同位素。
10.權(quán)利要求4所述的用途，其中偶聯(lián)物具有下式
11.權(quán)利要求lo所述的用途，其中偶聯(lián)物進一步包含金屬陽離子。
12.權(quán)利要求11所述的用途，其中金屬陽離子是放射性核素。
13.權(quán)利要求12所述的用途，其中放射性核素是””T.。
14.權(quán)利要求卜2的任一項所述的用途，其中基團X包含熒光素。
15.權(quán)利要求2所述的用途，進一步包括給患者施用選自TiterMaXG。ld、明礬和GPI—lOO的佐劑的步驟。
16.權(quán)利要求3所述的用途，其中所述細胞毒素是氯甲雙磷酸。
17.權(quán)利要求3所述的用途，其中所述細胞毒素是假單胞菌外毒素。
18.權(quán)利要求3所述的用途，其中所述細胞毒素是腎上腺皮質(zhì)激素。
19.權(quán)利要求3所述的用途，其中所述細胞毒素是抗葉酸藥。
20.權(quán)利要求19所述的用途，其中所述抗葉酸藥是氨甲喋呤。
21.權(quán)利要求卜20的任一項所述的用途，其中所述基團X進一步包含脂質(zhì)體。
22.權(quán)利要求卜2l的任一項所述的用途，其中所述藥物是腸胃外劑型。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述腸胃外劑型選自皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和鞘內(nèi)施用。
24.權(quán)利要求卜23的任一項所述的用途，其中所述藥物包含可藥用的載體，其中所述可藥用的載體是液體載體。
25.權(quán)利要求24所述的用途，其中所述液體載體選自鹽水、葡萄糖、乙醇、乙二醇、酯、 酰胺及其組合。
26.權(quán)利要求1-25的任一項所述的用途，其中所述藥物以單個劑量施用。
27.權(quán)利要求1-25的任一項所述的用途，其中所述藥物以一個或多個劑量施用。
28.權(quán)利要求1-27的任一項所述的用途，其中所述偶聯(lián)物以用于治療或監(jiān)測/診斷關(guān) 節(jié)炎的有效量存在，并且其中所述有效量的范圍是每千克體重約lng-約lmg。
29.權(quán)利要求1-27的任一項所述的用途，其中所述偶聯(lián)物以用于治療或監(jiān)測/診斷關(guān) 節(jié)炎的有效量存在，并且其中所述有效量的范圍是每千克體重約1 P g_約500 u g。
30.權(quán)利要求1-27的任一項所述的用途，其中所述偶聯(lián)物以用于治療或監(jiān)測/診斷關(guān) 節(jié)炎的有效量存在，并且其中所述有效量的范圍是每千克體重約1 P g_約100 u g。
31.藥物組合物，該組合物包含通式為Ab-X的偶聯(lián)物或復(fù)合物，其中基團Ab包含葉酸 受體結(jié)合配體，并且基團X包含脂質(zhì)體和能夠改變巨噬細胞功能的化合物，其中所述能夠 改變巨噬細胞功能的化合物包含在脂質(zhì)體中，并且其中基團Ab與脂質(zhì)體共價連接。
32.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中所述能夠改變巨噬細胞功能的化合物選自強的 松、抗雄激素藥物、抗雌激素藥物、雄激素、雌激素和腎上腺皮質(zhì)激素。
33.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中所述能夠改變巨噬細胞功能的化合物是氨甲喋呤。
34.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中所述能夠改變巨噬細胞功能的化合物是抗代謝藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及巨噬細胞介導(dǎo)的疾病的治療和診斷。具體地，本發(fā)明涉及一種治療或監(jiān)測/診斷由活化的巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況的方法。該方法包括對患有巨噬細胞介導(dǎo)的疾病狀況的患者施用有效量的包含通式為Ab-X的偶聯(lián)物或復(fù)合物的組合物的步驟，其中基團Ab包含能與活化的巨噬細胞結(jié)合的配體，以及，在該偶聯(lián)物用于治療上述疾病狀況時，基團X包含免疫原、細胞毒素、或能夠改變巨噬細胞功能的化合物；在該偶聯(lián)物用于監(jiān)測/診斷上述疾病狀況時，基團X包含成像劑。該方法可用于治療患有選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克隆氏病、炎癥、感染、骨髓炎、動脈粥樣硬化、器官移植物排斥、肺纖維化、結(jié)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化的疾病的患者。
文檔編號A61P25/00GK101979095SQ20101054105
公開日2011年2月23日 申請日期2002年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月2日
發(fā)明者M·J·圖爾克, P·S·羅 申請人:普渡研究基金會