專利名稱：：肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)，即涉及制備具有免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)并可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和實驗生物化學(xué)中的生物活性物質(zhì)的方法?，F(xiàn)有技術(shù)本領(lǐng)域的大量研究結(jié)果證明了開發(fā)新型無害免疫調(diào)節(jié)肽的重要性。這種肽的應(yīng)用將阻止在免疫缺陷背景下發(fā)生諸如惡性腫瘤、膿毒、慢性及潛伏感染等的發(fā)病率的增長。最常見的分離新肽的方法包括從組織抽提物中分離活性肽組分，分級分離和純化，包括對個別物質(zhì)的分離與鑒定(SUN1600047，SUN1638849，SUN1737798)。在實用醫(yī)學(xué)中，胸腺抽提物被普遍認(rèn)為是免疫過程的調(diào)節(jié)因子，例如，胸腺素組分5(Goldstein，A.L.，GunaA.，LatzM.M.，HardyH.A.，WhiteA.)thyamalin(CH，N659586)。抽提物含有具多肽本質(zhì)的物質(zhì)，方法的復(fù)雜性、活性物質(zhì)的低產(chǎn)量以及其物理、化學(xué)和生物特性的顯著改變，使從天然原材料生產(chǎn)這些產(chǎn)品受到限制。另外，壓載(ballast)成分在天然胸腺制劑中的存在會引發(fā)負面效應(yīng)。后者成為產(chǎn)生合成肽的刺激物。迄今為止，多種免疫調(diào)節(jié)肽已經(jīng)合成PCT/WO089/06134，SUN1541821，SUN1518956，EPN230052，EPN406931，USN5021551，USN5013723。每種合成肽具有必要性質(zhì)的有限組合，是高活性、低毒性、無副作用的，因此可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中。發(fā)明描述本發(fā)明的目的是合成一種具有免疫調(diào)節(jié)作用和具有下式的新型生物活性肽X-A-D-Trp-Y其中A代表D-Glu、iD-Glu；X代表H或Gly、Ala、Leu、Ile、Val、NVal、Pro、Tyr、Phe、Trp、D-Ala、D-Leu、D-Ile、D-Val、D-NVal、D-Pro、D-Tyr、D-Phe、D-Trp、γ-氨基丁酸、ζ-氨基己酸；Y代表Gly、Ala、Leu、Ile、Val、NVal、Pro、Tyr、Phe、Trp、D-Ala、D-Ile、D-Val、D-NVal、D-Pro、D-Tyr、D-Phe、D-Trp、γ-氨基丁酸、ζ-氨基己酸、-OH或取代的酰胺(C1-C3)。本發(fā)明的另一個目的是開發(fā)一種肽合成的新的基本方法。這種方法以最簡單的步驟，獲得具有以上述及的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的高產(chǎn)量。這在醫(yī)藥生產(chǎn)中具有決定性意義。新方法的原理包括通過用各種D-Trp-Y衍生物打開叔丁氧羰基谷氨酰胺(D或L)酸內(nèi)酸酐在溶液中合成含谷氨酰基的肽。之后，對α-、γ-異構(gòu)體進行了層析分離。利用叔丁氧羰基氨基酸的活化醚類構(gòu)建肽鏈，完成了進一步的合成。表1顯示了一系列新肽類似物的Rf1(氯仿-甲醇-32％乙酸＝60∶45∶20)和Rf2(丁醇-吡啶-水-乙酸＝5∶5∶4∶1)值。表1<</tables>發(fā)明的優(yōu)選的實施方案下列實施例用以說明本發(fā)明。實施例，H-D-Glu-D-Trp-OH和H-iD-Glu-D-Trp-OH1.Boc-D-Glu-OH的制備將14.7g(0.1M)H-D-Glu-OH溶于200ml蒸餾水，用1MKOH將pH調(diào)至10.2。加入在二噁烷中的BOC233.0g(0.3M)，充分混合。用pH-stat監(jiān)測pH值。反應(yīng)完成時，將混合物轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用3×150ml乙酸乙酯從堿性介質(zhì)中抽提，將0.2％硫酸溶液緩慢加入到水相中調(diào)pH至3.0，將Boc-D-Glu-OH抽提進有機相(3×200ml)。有機層用3×200mlNa2SO4飽和溶液洗至中性，在硫酸鈉上干燥，然后真空下蒸發(fā)至油狀。產(chǎn)量16.7g(68％)。2.Boc-D-Glu-Trp-OH和Boc-iD-Glu-D-Trp-OH混合物的制備將16.7g(0.068M)Boc-D-Glu-OH溶于200ml二甲基甲酰胺，冷卻至0℃，將N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺20.6g(0.1M)溶于100ml二甲基甲酰胺中的溶液加入到此溶液中，邊加邊攪拌。混合物于4℃攪拌4小時，然后室溫下放置8小時。過濾分離二環(huán)己基碳化二亞胺沉淀，用2×50ml二甲基甲酰胺洗滌。真空條件下蒸發(fā)濃縮濾液至1/2體積，冷卻至4℃并邊強力攪拌邊加入24.3g(0.1M)H-D-Trp-OH。使溶液溫?zé)嶂潦覝?。在氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇?∶3∶1的體系中，由TLC控制反應(yīng)的完成(表現(xiàn)為Boc-D-Glu酸的內(nèi)酸酐斑點消失)。過濾分離剩余的二己基脲，真空條件下蒸發(fā)二甲基甲酰胺。將200ml乙酸乙酯和200ml0.2％硫酸溶液加到油狀剩余物上。分離有機層后，用Na2SO4飽和溶液洗滌至pH中性，在Na2SO4上干燥。真空條件下蒸發(fā)乙酸乙酯溶液。得到的油狀沉淀是Boc-D-Glu-D-Trp-OH和Boc-iD-Glu-D-Trp-OH的混合物?？偖a(chǎn)量25.4g(70％)。3.H-D-Glu-D-Trp-OH和H-iD-Glu-D-Trp-OH的制備將25.4g混合物(0.048M)溶于200ml甲酸中，40℃攪拌1小時。真空下蒸發(fā)掉溶劑，至稠油狀。以梯度0.01-0.2M嘧啶乙酸鹽緩沖液用Sephadex柱進行離子交換層析分離和純化肽。產(chǎn)量5.7g(35％)H-D-Glu-D-Trp-OH和5.7g(35％)H-iD-Glu-D-Trp-OH。發(fā)現(xiàn)了肽的下述物理化學(xué)特征基本結(jié)構(gòu)-H-D-Glu-D-Trp-OH和H-iD-Glu-D-Trp-OH經(jīng)驗式-C16H20N3O5分子量-334.35外觀-黃白或灰色粉末溶解性-易溶于水，中等溶于酒精，不溶于氯仿紫外光譜-譜范圍在250-300nm，最大吸收峰在280±2nm，肩峰在287±2nm。在Balb/c小鼠中研究了新肽的生物學(xué)活性。將小鼠脾細胞于含2ml谷氨酰胺和5％失活的胎兒血清的RPMI1640介質(zhì)中懸浮后，涂布到平底板上每孔100mcl(200,000細胞)。所研究的制劑在培養(yǎng)之初加入。使用終濃度為每孔2mcg的刀豆素作為促細胞分裂原。將板于37℃、5％CO2下溫育48小時。在溫育結(jié)束前24小時摻入5mcg/ml劑量的3H-胸腺嘧啶，用閃爍計數(shù)器的每分鐘計數(shù)值(CPM)來評估細胞的增殖情況。結(jié)果見表2。表2</tables>*三次測定的平均值。發(fā)現(xiàn)該新肽抑制脾細胞增殖。為研究該肽的安全性，我們按藥理學(xué)委員會的方法推薦書中的RF“對新型藥用物質(zhì)的總體毒性作用的臨床前研究的要求”(M.，1985)進行了急性毒性測定。根據(jù)測定結(jié)果，1000倍腹膜內(nèi)劑量的肽不引起急性毒性反應(yīng)，以該劑量不可能達到LD50。商業(yè)應(yīng)用該生物活性肽能夠廣泛地用于醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中。權(quán)利要求1.一種下式的肽X-A-D-Trp-Y，其中A代表D-Glu、iD-Glu；X代表H或Gly、Ala、Leu、Ile、Val、NVal、Pro、Tyr、Phe、Trp、D-Ala、D-Leu、D-Ile、D-Val、D-NVal、D-Pro、D-Tyr、D-Phe、D-Trp、γ-氨基丁酸、ζ-氨基己酸；Y代表Gly、Ala、Leu、Ile、Val、NVal、Pro、Tyr、Phe、Trp、D-Ala、D-Leu、D-Ile、D-Val、D-NVal、D-Pro、D-Tyr、D-Phe、D-Trp、γ-氨基丁酸、ζ-氨基己酸、-OH或取代的酰胺(C1-C3)。2.一種制備下式的肽方法X-A-D-Trp-Y，其中A代表D-Glu、iD-Glu；X代表H或Gly、Ala、Leu、Ile、Val、NVal、Pro、Tyr、Phe、Trp、D-Ala、D-Leu、D-Ile、D-Val、D-NVal、D-Pro、D-Tyr、D-Phe、D-Trp、γ-氨基丁酸、ζ-氨基己酸；Y代表Gly、Ala、Leu、Ile、Val、NVal、Pro、Tyr、Phe、Trp、D-Ala、D-Leu、D-Ile、D-Val、D-NVal、D-Pro、D-Tyr、D-Phe、D-Trp、γ-氨基丁酸、ζ-氨基己酸、-OH或取代的酰胺(C1-C3)，該方法包括以下步驟利用D-Trp-Y鉀鹽打開叔丁氧羰基谷氨酰胺(D或L)酸的內(nèi)酸酐在溶液中合成肽；在預(yù)先用甲酸處理脫離叔丁氧羰基時，采用活化的乙醚和混合的酸酐進一步構(gòu)建肽鏈，繼而層析分離α-、γ-異構(gòu)體。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué),特別是涉及獲得具有免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)并可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和實驗生物化學(xué)中的生物活性物質(zhì)的方法。本發(fā)明所說明的問題是產(chǎn)生一種式X－A－D－Trp－Y的具有免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)新型合成生物活性肽,在上式中A代表D－Glu、iD－Glu;X代表H或Gly、Ala、Leu、Ile、Val、NVal、Pro、Tyr、Phe、Trp、D－Ala、D－Leu、D－Ile、D－Val、D－NVal、D－Pro、D－Tyr、D－Phe、D－Trp、γ－氨基丁酸、ζ－氨基己酸;Y代表Gly、Ala、Leu、Ile、Val、NVal、Pro、Tyr、Phe、Trp、D－Ala、D－Leu、D－Ile、D－Val、D－NVal、D－Pro、D－Tyr、D－Phe、D－Trp、γ－氨基丁酸、ζ－氨基己酸、－OH或取代的酰胺(C文檔編號A61K38/07GK1189837SQ96195153公開日1998年8月5日申請日期1996年5月6日優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日發(fā)明者V·I·戴金,A·M·克羅特科夫申請人:V·I·戴金,A·M·克羅特科夫