專利名稱：斯克瑞泰Scriptaid在制備治療創(chuàng)傷性腦損傷疾病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑斯克瑞泰(Scriptaid)新的藥用用途,具體涉及斯克瑞泰Scriptaid在治療創(chuàng)傷性腦損傷中的用途，
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷性腦損傷(traumaitc brain injury, TBI)是神經(jīng)外科領(lǐng)域常見(jiàn)的急癥之一，尤其是重型TBI，死亡率達(dá)到30% -50% ;即便存活下來(lái)，其中輕度損傷患者中的10%會(huì)遺留永久殘疾，中度和重度患者可達(dá)到66%和100%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，TBI目前已成為全世界35歲以下青壯年人群第一位死亡和致殘?jiān)?。在我?guó)，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，交通運(yùn)輸業(yè)、建筑業(yè)、體育事業(yè)發(fā)展十分迅速，交通事故、建筑工傷、運(yùn)動(dòng)意外事故等意外傷害大大增加，由此 造成腦外傷的發(fā)病率逐年增高，對(duì)社會(huì)和病人家庭造成極大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。組蛋白(histone)是真核生物核染色體的重要構(gòu)成成分，與DNA共同構(gòu)成染色體的基本結(jié)構(gòu)單位-核小體。現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了 4種組蛋白H2A、H2B、H3和H4，每一種組蛋白各二個(gè)分子，形成一個(gè)組蛋白八聚體，約200bp的DNA分子盤繞在組蛋白八聚體構(gòu)成的核心結(jié)構(gòu)外面，形成了一個(gè)核小體。研究報(bào)道，由組蛋白修飾所引起的染色體局部構(gòu)象的改變，在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，是相關(guān)基因表達(dá)開(kāi)放與關(guān)閉的調(diào)節(jié)機(jī)制之一。組蛋白乙?；降恼{(diào)控，是這種調(diào)節(jié)機(jī)制的一個(gè)基礎(chǔ)，平衡的精確調(diào)控保證了細(xì)胞正常功能的執(zhí)行。乙?；{(diào)節(jié)還可以影響DNA與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物的結(jié)合，調(diào)控DNA的復(fù)制和修復(fù)、基因表達(dá)、染色質(zhì)組裝和細(xì)胞有絲分裂。調(diào)控組蛋白乙?；癄顟B(tài)的酶分為2類，組蛋白乙酸化酶(histone acetylase,HAT)和組蛋白去乙酸化酶(histone deacetylase,HDAC),兩者相互拮抗，維持體內(nèi)乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡。HAT催化組蛋白氨基末端上數(shù)個(gè)賴氨酸殘基的乙?；?，使組蛋白分子的電荷被中和，從而減弱組蛋白與DNA的結(jié)合，并影響組蛋白分子之間和組蛋白與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的相互作用，由此促進(jìn)染色質(zhì)的松解和相關(guān)基因表達(dá)水平的提高；HDAC則催化組蛋白脫乙?；?，引起相應(yīng)基因表達(dá)下降。鑒于乙?；腿ヒ阴；惓Ｅc很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，國(guó)外學(xué)者已對(duì)HDAC抑制劑類神經(jīng)保護(hù)劑在TBI的應(yīng)用作了初步探索。有研究發(fā)現(xiàn)，在TBI后組蛋白乙酰化水平顯著降低，并且可能與繼發(fā)性氧化應(yīng)激損傷和興奮性毒性相關(guān)；使用某些HDAC抑制劑能明顯改善TBI后運(yùn)動(dòng)功能，增強(qiáng)神經(jīng)可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力，減輕腦組織損傷，同時(shí)阻止神經(jīng)退行性變。所述的Scriptaid是異羥肟酸類中較新型的HDAC抑制劑，副作用較小，安全系數(shù)較高，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有將Scriptaid運(yùn)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑斯克瑞泰(Scriptaid)新的藥用用途，尤其涉及斯克瑞泰Scriptaid在制備神經(jīng)保護(hù)藥物及治療創(chuàng)傷性腦損傷藥物中的用途，
具體而言，本發(fā)明進(jìn)行了有關(guān)Scriptaid抗創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果證實(shí)，所述的Scriptaid具有明確抗腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，為其作為一種新型抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷藥物及其臨床應(yīng)用提供了較完整的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本發(fā)明中，通過(guò)建立小鼠局灶性腦挫裂傷模型(controlled cortical impact,CCI),對(duì)于Scriptaid抗創(chuàng)傷性腦損傷作用進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明(I)HDAC抑制劑Scriptaid對(duì)于創(chuàng)傷性腦損傷小鼠具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，且存在著明顯的量效關(guān)系，結(jié)果顯示，低劑量(1.5yg/g)時(shí)效果不十分顯著；隨著使用量逐漸增加(3.5、5.5yg/g)能明顯改善TBI后小鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙，減少腦創(chuàng)傷后組織缺失；(2) Scriptaid (3. 5 μ g/g)能明顯減輕海馬神經(jīng)元變性壞死,顯著改善TBI后小鼠學(xué)習(xí)記憶功能；(3) Scriptaid能顯著抑制TBI后的HDAC活性，促進(jìn)乙酰化H3、H4水平顯著增加， 該分子機(jī)制可參與其神經(jīng)保護(hù)作用。本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證實(shí),所述的Scriptaid副作用較小,安全系數(shù)較高,對(duì)于創(chuàng)傷性腦損害所致的急、慢性損傷均具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。本發(fā)明所述的Scriptaid適用于制成藥物制劑,可進(jìn)一步制成緩釋或控釋藥物制劑；制成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物制劑；制成注射制劑或輸液制劑；或與其它藥物組成復(fù)方藥物制劑。本發(fā)明制成的藥物制劑，用于治療各種神經(jīng)或創(chuàng)傷性腦損傷性疾病。所述藥物優(yōu)選以片劑或膠囊形式使用，或以無(wú)菌注射劑或滴注液形式使用。本發(fā)明所涉及的神經(jīng)損傷性疾病包括由作用于腦底或脊柱的物理力，局部缺血，中風(fēng)，呼吸停止，心跳停止，腦血檢形成或檢塞，AIDS所致神經(jīng)障礙，和大腦出血，腦脊髓炎，腦積水，術(shù)后事件，腦感染，震蕩或顱內(nèi)壓升高所引起的創(chuàng)傷性腦損傷，和/或上述病癥的
后遺癥。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明將Scriptaid對(duì)于TBI損傷的神經(jīng)保護(hù)作用作了全面評(píng)估，同時(shí)對(duì)于其可能涉及作用靶點(diǎn)作了初步驗(yàn)證；所述新靶點(diǎn)的驗(yàn)證，為神經(jīng)保護(hù)藥物的開(kāi)發(fā)提供更多的理論依據(jù)和新的研究思路；在臨床應(yīng)用時(shí)，為TBI治療提供一個(gè)新的藥物選擇，同時(shí)將會(huì)有廣泛的商業(yè)化應(yīng)用前景，在促進(jìn)人類的健康事業(yè)方面亦具有十分明顯的社會(huì)意義。


圖I :TBI術(shù)前及術(shù)后1、3、5、7天各組小鼠肌力測(cè)試結(jié)果，其中分?jǐn)?shù)越高，表明神經(jīng)功能越正常。與同一時(shí)間的對(duì)照組(0μ g/g)相比，*P
<O. 05，**P < O. 01。圖2 TBI術(shù)前及術(shù)后3、5、7天各組肢體不對(duì)稱測(cè)試結(jié)果，其中正常情況下，小鼠左右對(duì)稱使用前肢，縱坐標(biāo)越高表明患肢使用率越少。與同一時(shí)間的對(duì)照組(O μ g/g)相比，*P < O. 05，**P < O. Ol0圖3 TBI術(shù)前及術(shù)后1、3、5、7天各組小鼠錯(cuò)步測(cè)試結(jié)果，其中分?jǐn)?shù)越少，表明神經(jīng)功能越正常。與同一時(shí)間的對(duì)照組(0μ g/g)相比，*P
<O. 05，**P < O. 01。
圖4 TBI后7天各組小鼠腦片焦油紫染色例圖，其中=Scriptaid各治療劑量組與對(duì)照組相比，缺損區(qū)域不同程度變小。圖5 =TBI后第29至33天水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練結(jié)果，其中與同一時(shí)間假手術(shù)組相比，##P < O. 01 ;與同一時(shí)間對(duì)照組相比，*P < O. 05，**P < O. 01。圖6 =TBI后第35天各組大鼠海馬CA3區(qū)焦油紫染色圖，其中假手術(shù)組海馬組織無(wú)明顯損傷，CA3區(qū)錐體細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，可見(jiàn)淺染的突起，錐體細(xì)胞排列整齊致密，形態(tài)完整，尼氏小體豐富；對(duì)照組損傷側(cè)海馬組織有明顯損傷，主要表現(xiàn)在CA3區(qū)大量錐體細(xì)胞缺失，殘留的錐體細(xì)胞排列松散不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞胞核固縮，核仁欠清晰，尼氏小體減少或消失；Scriptaid治療組損傷 側(cè)海馬錐體細(xì)胞排列比較整齊致密，胞核飽滿，核仁較清晰，僅有少量散在的錐體細(xì)胞缺失或胞核固縮。圖7 :各組 Westernblot 例圖，其中，有左至右，各組依次代表假手術(shù)組，對(duì)照組，Scriptaid小劑量組(I. 5 μ g/g)、中劑量組(3. 5 μ g/g)、高劑量組(5. 5 μ g/g);分別提取各組TBI后I天損傷側(cè)腦皮層核蛋白行Western blot，總的H3蛋白作為內(nèi)參。
具體實(shí)施例方式I、實(shí)驗(yàn)材料和方法I. I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組清潔級(jí)成年雄性C57/BL6鼠(由中科院動(dòng)物中心提供)，8_10周齡，25_28g，術(shù)前動(dòng)物在本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)2 3天，自由飲食，室溫20-22°C，每日光照12h/黑暗12h，使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境。將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組、Scriptaid小劑量組(1.5yg/g)、中劑量組(3. 5 μ g/g)、高劑量組(5. 5 μ g/g)，每組12只行神經(jīng)功能測(cè)評(píng)，其中8只組織學(xué)染色，余下4只急性取腦組織提取蛋白；上述所有動(dòng)物術(shù)后觀察I周。另取一批小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組、Scriptaid組(3. 5 μ g/g)，每組8只用于水迷宮測(cè)定及組織學(xué)染色，共觀察5周。手術(shù)后即腹腔注射相應(yīng)劑量的Scriptaid，假手術(shù)組、對(duì)照組注射等量的生理鹽水I. 2模型制備利用PSI公司的TBI-0310顱腦損傷儀制備標(biāo)準(zhǔn)化的小鼠局灶性腦挫裂傷模型(controlled cortical impact, CCI)。密封罐內(nèi)異氟醚誘導(dǎo)小鼠麻醉后,剪去其頭頂部皮毛，俯臥位固定于Knof立體定位儀上，打開(kāi)麻醉機(jī)，通過(guò)面罩持續(xù)麻醉(15-2%異氟醚/空氣、呼吸頻率65次/分鐘、吸呼比I : I、潮氣量3ml)。碘伏皮膚消毒，沿頭皮中線切開(kāi)皮膚，用撐開(kāi)器或止血鉗固定頭皮和筋膜，止血后用棉簽分離骨膜，充分暴露顱頂骨，尤其前囟區(qū)域。以前囟前I. 5mm,中線右側(cè)旁開(kāi)I. 5mm處為中心，以牙科鉆開(kāi)一直徑為3mm的骨窗(中心區(qū)域?yàn)轭~頂葉交界處的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)混合皮層)，充分暴露硬腦膜，并保持硬腦膜外形完整，注意止血。打開(kāi)壓縮空氣推動(dòng)撞擊器，設(shè)定參數(shù)，撞擊速度3. 5m/s，撞擊深度1. 5mm,撞擊停留時(shí)間150ms，然后撞擊，及時(shí)止血。縫合頭皮，置IVC鼠籠喂養(yǎng)。假手術(shù)組僅切開(kāi)頭皮和頡骨開(kāi)窗，不打擊。I. 3神經(jīng)功能評(píng)估I. 3. lffire-hanging test (肌力測(cè)試)
將小鼠放置于直徑2mm，長(zhǎng)度50cm的不銹鋼絲中點(diǎn)上，平臺(tái)高度37cm，共觀察4次，每次30s。評(píng)分細(xì)則0分，30s內(nèi)從鋼絲掉下；1分，用兩只前爪緊抓在鋼絲上；2分，除了上述I分之外，嘗試爬到鋼絲上；3分，用兩只前爪和一只(或兩只)后爪緊抓在鋼絲上；4分，用四肢緊抓在鋼絲上，并且用尾巴纏繞在鋼絲上；5分，30內(nèi)逃到一側(cè)的支架。I. 3. 2Cylinder test (前肢不對(duì)稱測(cè)試)將小鼠置于直徑7. 5cm,高度為38cm透明圓柱中，攝像機(jī)全方位連續(xù)拍攝5min。分析時(shí)用每秒10幀速度觀察，實(shí)驗(yàn)中小于5次起身的小鼠被排除。統(tǒng)計(jì)時(shí)，同時(shí)計(jì)算左側(cè)、右側(cè)及雙側(cè)前肢接觸圓柱壁的次數(shù)。前肢不對(duì)稱使用率=(右側(cè)碰壁次數(shù)-左側(cè)碰壁次數(shù))/(左側(cè)碰壁次數(shù)+右側(cè)碰壁次數(shù)+雙側(cè)碰壁次數(shù))X 100% ;數(shù)值越高，表明損傷程度越重。I. 3. 3Grid walking and footfault test (錯(cuò)步實(shí)驗(yàn))將小鼠鼠放于不銹鋼架上，此架上有2cmX 2cm的正方形小柵欄，鋼架長(zhǎng)40cm，寬20cm上，距離地面50cm ;分別計(jì)數(shù)動(dòng)物I分鐘內(nèi)左前肢和左后肢在柵欄上走的總步數(shù)，同時(shí)分別計(jì)數(shù)動(dòng)物左前肢和左后肢沒(méi)有踏在柵欄上而踏空了的步數(shù)作為踏錯(cuò)步數(shù)。錯(cuò)步率=踏錯(cuò)步數(shù)/總步數(shù)X 100%。I. 3. 4Morris water maze (水迷宮測(cè)試)具體操作方法如下水迷宮分為四個(gè)象限，將一圓形平臺(tái)固定于水迷宮的第一象限，低于水面Icm的深度，實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)階段，第一階段一學(xué)習(xí)期(TBI后第29-33天)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于第二、三、四象限的指定位置隨機(jī)放入水中，動(dòng)物入水時(shí)面向水池壁，由安裝于水迷宮正上方的攝像頭監(jiān)控動(dòng)物90s內(nèi)在水中的運(yùn)動(dòng)情況，包括游泳速度、經(jīng)過(guò)各象限的時(shí)間和距離、到達(dá)平臺(tái)的潛伏期等指標(biāo)。如果動(dòng)物在90s內(nèi)未能到達(dá)平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)操作人員引導(dǎo)其找到平臺(tái)，動(dòng)物到達(dá)平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上滯留IOs后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第二階段一記憶期(TBI后第34天)將平臺(tái)從第一象限移走，把經(jīng)過(guò)前一階段訓(xùn)練的動(dòng)物于同樣的位置隨機(jī)放入水中，動(dòng)物入水時(shí)面向水池壁，由安裝于水迷宮正上方的攝像頭監(jiān)控動(dòng)物90s內(nèi)在水中的運(yùn)動(dòng)情況，包括游泳速度，經(jīng)過(guò)各象限的時(shí)間和距離，經(jīng)過(guò)之前平臺(tái)所在位置的次數(shù)等指標(biāo)。I. 4 焦油紫染色(CV staining)4%多聚甲醛灌注后取腦，經(jīng)后固定、蔗糖平衡后，行快速冷凍切片，片厚25
腦片直接貼于涂明膠的載玻片上，并置于室溫下風(fēng)干一天，利于貼附。將切片依次放入氯仿30min,丙酮 15min, 100% 乙醇 30min, 95% 乙醇 30s, 70% 乙醇 30s, ddH20 30s (兩次),焦油紫染液 20min, ddH2030s (三次),70% 乙醇 60s,95 % 乙醇 60s, 100 % 乙醇 60s,氯仿 5min,分化劑 3_5min, 95% 乙醇 l_2min, 100% 乙醇 2_3min, 100% 乙醇 2_3min, 二甲苯 l_2min, 二甲苯2-3min, 二甲苯2_3min。最后中性樹(shù)膠封片，蓋玻片封閉，晾干后觀察。1. 5腦缺損體積測(cè)定每只小鼠腦片從前囟前2. 96mm開(kāi)始收集，每12張取I張，共取10張腦片，焦油紫染色之后作腦梗死體積百分比的分析。采用lecai Q1050圖象分析儀測(cè)量每張腦片缺血同
側(cè)未梗死面積及缺血對(duì)側(cè)面積，依據(jù)公式
,
權(quán)利要求
1.斯克瑞泰Scriptaid在制備治療創(chuàng)傷性腦損傷疾病藥物中的用途。
2.按權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的創(chuàng)傷性腦損傷疾病包括的急、慢性腦損傷損疾病。
3.權(quán)利要求I所述的斯克瑞泰Scriptaid在制備神經(jīng)保護(hù)藥物中的用途。
4.按權(quán)利要求I或2或3所述的用途,其特征在于，所述的斯克瑞泰Scriptaid制成制成緩釋或控釋藥物制劑；制成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物制劑；制成注射制劑或輸液制劑；或復(fù)方藥物制劑。
5.按權(quán)利要求I或2或3所述的用途，其特征在于，所述的創(chuàng)傷性腦損傷疾病包括由作用于腦底或脊柱的物理力，局部缺血，中風(fēng)，呼吸停止，心跳停止，腦血檢形成或檢塞， AIDS所致神經(jīng)障礙，和大腦出血，腦脊髓炎，腦積水，術(shù)后事件，腦感染，震蕩或顱內(nèi)壓升高所引起的創(chuàng)傷性腦損傷，和/或上述病癥的后遺癥。
6.按權(quán)利要求I或2或3所述的用途，其特征在于，所述的藥物以片劑或膠囊形式使用。
7.按權(quán)利要求I或2或3所述的用途，其特征在于，所述的藥物以無(wú)菌注射劑或滴注液形式使用。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及組蛋白脫乙酰酶抑制劑斯克瑞泰Scriptaid新的藥用用途，具體涉及斯克瑞泰Scriptaid在治療創(chuàng)傷性腦損傷疾病藥物中的用途，本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，所述Scriptaid能顯著改善創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，減少損傷后腦組織缺失，同時(shí)能明顯減輕海馬神經(jīng)元變性壞死，改善學(xué)習(xí)記憶功能，其副作用較小，安全系數(shù)較高，對(duì)于創(chuàng)傷性腦損害所致的急、慢性損傷均具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。所述的Scriptaid可進(jìn)一步制成緩釋或控釋藥物制劑；制成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物制劑；制成注射制劑或輸液制劑；或復(fù)方藥物制劑，用于治療各種神經(jīng)或創(chuàng)傷性腦損傷性疾病。
文檔編號(hào)A61K31/473GK102846611SQ20111028758
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月24日
發(fā)明者高艷琴, 王國(guó)華, 陳俊, 濮宏建, 陸世鐸 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)