專利名稱：鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8的HLA-A^*0201限制性CTL表位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種抗原蛋白的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位，特別 涉及1型糖尿病(TlDM)主要自身抗原鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8 (ZnTS)的HLA-A*0201限制性CTL表位， 還涉及該CTL表位的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
TlDM是由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的以胰島β細(xì)胞特異性損傷導(dǎo)致胰島素生成絕對(duì)不足 為特征的一種自身免疫性疾病，多發(fā)生于兒童和青少年，起病急，如不及時(shí)治療可引發(fā)累及 心、肝、腎、神經(jīng)、眼等重要組織器官的嚴(yán)重并發(fā)癥，是兒童和青少年致殘及早亡的主要原因 之一。近年來(lái)，我國(guó)兒童和青少年患TlDM的人數(shù)逐年遞增，TlDM正在成為危害我國(guó)兒童和 青少年健康的主要疾病。TlDM目前以胰島素終身替代療法和非特異性免疫抑制為主要治療 手段，治療費(fèi)用高昂且副作用大，因此急需建立一種特異性免疫干預(yù)治療策略。ΖηΤ8 又稱 SLC30A8，是 SLC30 (solute-linked carrier 30)基因編碼的陽(yáng)離子擴(kuò) 散輔助(CDF)家族的一個(gè)新成員，主要以二聚體形式定位于β細(xì)胞胰島素分泌/儲(chǔ)存性囊 泡膜上，介導(dǎo)鋅離子從胞漿至囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，參與胰島素的合成、儲(chǔ)存和分泌的調(diào)節(jié)。大鼠胰 島素瘤INS-IE細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，血糖水平正常情況下只采取補(bǔ)鋅措施提高胞外鋅離子水平， 并不能使胞內(nèi)鋅總含量相應(yīng)升高，而&ιΤ8過(guò)表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞攝取和儲(chǔ)存鋅離子，增加胞內(nèi) 鋅總含量。此外，ZnTS可能在血糖升高刺激的胰島素分泌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。血糖水平 正常時(shí)，ZnTS過(guò)表達(dá)雖可使胞內(nèi)鋅總含量升高，但胰島素分泌量并不明顯增加，而血糖水平 升高時(shí)，ZnTS過(guò)表達(dá)可明顯使胰島素分泌量增加，幾乎是非過(guò)表達(dá)&ιΤ8 β細(xì)胞的兩倍。研 究發(fā)現(xiàn)，ZnTS與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)&1Τ8變異時(shí)，鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低，囊泡 內(nèi)鋅離子濃度下降，其參與形成的胰島素六聚體明顯減少，胰島素儲(chǔ)存水平降低，外界高糖 刺激下分泌至胞外的胰島素相應(yīng)不足；囊泡內(nèi)鋅離子濃度下降還導(dǎo)致囊泡內(nèi)胰島素原與胰 島素的比值升高，胞吐作用時(shí)胰島素原不能完全轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素，β細(xì)胞分泌胰島素的功能 損傷；同時(shí)，鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低使過(guò)量鋅離子積聚在胞漿中，當(dāng)達(dá)到或超過(guò)毒性閾值時(shí)可 誘發(fā)大量β細(xì)胞死亡。&1Τ8也可作為自身抗原引起τ細(xì)胞介導(dǎo)的以β細(xì)胞受損為特征 的自身免疫反應(yīng)，甚至誘發(fā)T1DM。&1Τ8引起β細(xì)胞自身免疫損傷的可能機(jī)制為aiT8抗 原表位被MHC-I分子提呈，表達(dá)在β細(xì)胞表面，⑶8+Τ細(xì)胞識(shí)別后經(jīng)穿孔素依賴性途徑和/ 或i^is/i^sL途徑殺傷β細(xì)胞；β細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子IFN-g和TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)后可能表達(dá) MHC-II分子，從而將&ιΤ8抗原表位遞呈給CD4+T細(xì)胞，后者分泌多種細(xì)胞因子，并能激活巨 噬細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，最終損傷β細(xì)胞。&ιΤ8還能激活B細(xì)胞產(chǎn)生特異性的&ιΤ8抗 體(ZnT8A)，參與誘導(dǎo)β細(xì)胞死亡。研究還發(fā)現(xiàn)，&ιΤ8基因rsl3266634(R325W)的單核苷 酸多態(tài)性(SNP)與TlDM抗原抗體特異性和2型糖尿病(T2DM)易感性均存在顯著相關(guān)性， 但其導(dǎo)致β細(xì)胞功能異常并最終誘發(fā)TlDM和T2DM的分子機(jī)制目前尚不清楚。綜上，ZnTS 過(guò)表達(dá)可增加囊泡鋅儲(chǔ)備和胞漿鋅總含量并能在血糖升高時(shí)促進(jìn)胰島素分泌，因此，刺激 ZnTS使其合成增加或功能增強(qiáng)有望降低糖尿病患者低鋅血癥帶來(lái)的損害，防止胞內(nèi)鋅耗竭引起的β細(xì)胞凋亡和/或其誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷；aiT8具有免疫原性，可作為抗原引起β 細(xì)胞自身免疫損傷，因此，針對(duì)&1Τ8研制的相關(guān)疫苗或抗體也許可以預(yù)防或治療T1DM。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠口服或接種自身抗原，可以減 緩甚至完全阻斷TlDM的發(fā)生、發(fā)展。同時(shí)，有愈來(lái)愈多的證據(jù)表明自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞 (即CTL)在TlDM中具有十分重要的致病作用。因此，近年來(lái)發(fā)展了用CTL表位替代完整自 身抗原來(lái)誘導(dǎo)免疫耐受的策略。相對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子天然抗原，小分子表位肽具有更 易誘導(dǎo)免疫耐受、相對(duì)安全、易于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；苽浜图兓葍?yōu)點(diǎn)，還可以通過(guò)一些氨基酸位 點(diǎn)的化學(xué)修飾最大限度地增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)的能力。已有研究利用自身抗原CTL表位或其改 造肽配體(APL)在NOD小鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)了特異性CTL免疫耐受，對(duì)TlDM有一定的防治作 用。同時(shí)研究報(bào)道，TlDM的發(fā)生與人類HLA-A*0201分子密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約60%的TlDM 患者攜帶HLA-A*0201等位基因。因此，從自身抗原中篩選出其HLA-A*0201限制性CTL表 位，對(duì)人類TlDM的防治研究具有重要意義。據(jù)發(fā)明人所知，ZnTS的HLA-A*0201限制性CTL表位目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供&ιΤ8的HLA_A*0201限制性CTL表位，該表 位能夠有效結(jié)合HLA-A*0201分子，二者之間具有高親和力，所形成的復(fù)合物穩(wěn)定，而且能夠 有效激發(fā)特異性的CTL應(yīng)答，分泌高水平的IFN-γ，并能對(duì)負(fù)載相應(yīng)表位的靶細(xì)胞產(chǎn)生高 效殺傷作用。為達(dá)到此目的，本發(fā)明首先采用基于肽與MHC-I分子結(jié)合強(qiáng)度的算法BIMAS和 SYFPEITHI以及基于蛋白酶體剪切特異性的算法PAProc對(duì)&ιΤ8的HLA_A*0201限制性 CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，然后根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果合成了可能的表位肽，并通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)(1)肽與 HLA-A*0201分子的親和力檢測(cè)，(2)肽與HLA-A*0201分子復(fù)合物的穩(wěn)定性檢測(cè)，(3)肽刺 激肽特異性CTL殺傷靶細(xì)胞的能力和分泌IFN- γ的能力檢測(cè)，對(duì)這些可能的表位肽進(jìn)行了 功能鑒定，最終獲得了 &ιΤ8的HLA-A*0201限制性CTL表位，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示，優(yōu)選氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發(fā)明的目的之二在于提供所述的aiT8的HLA-A*0201限制性CTL表位在制藥方 面的應(yīng)用。為達(dá)到此目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案aiT8的HLA-A*0201限制性CTL表位可 單獨(dú)或聯(lián)合其他免疫顯性自身抗原CTL表位和/或藥學(xué)上可接受的載體，按照藥學(xué)領(lǐng)域的 常規(guī)方法，制成TIDM治療性肽疫苗，用于TlDM的臨床免疫治療。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 aiT8的HLA-A*0201限制性CTL表位，該表 位能夠有效結(jié)合HLA-A*0201分子，二者之間具有高親和力，所形成的復(fù)合物穩(wěn)定，而且能夠 有效激發(fā)特異性的CTL應(yīng)答，分泌高水平的IFN- γ，并對(duì)負(fù)載相應(yīng)表位的T2細(xì)胞具有高效 殺傷能力，可用于制備TlDM治療性肽疫苗，在TlDM的臨床免疫治療領(lǐng)域有著潛在、良好的 開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1為合成的候選表位肽P1、P2、P3的高效液相色譜圖(左)和質(zhì)譜圖(右)。
圖2為候選表位肽P1、P2、P3與HLA-A*0201分子的親和力檢測(cè)結(jié)果。圖3為候選表位肽PI、P2、P3與HLA-A*0201分子復(fù)合物的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果。圖4為候選表位肽PI、P2、P3刺激肽特異性CTL殺傷靶細(xì)胞的能力檢測(cè)結(jié)果。圖5為候選表位肽PI、P2、P3刺激肽特異性CTL分泌IFN- γ的能力檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述。一、預(yù)測(cè)的HLA-A * 0201限制性CTL表位根據(jù)Genbank登錄的人類&ιΤ8的氨基酸序列(登錄號(hào)為AAffi8419)，結(jié)合兩種 不同方法基于肽與MHC-I分子結(jié)合強(qiáng)度的方法(包括BIMAS和SYFPEITHI兩種算法) 和基于蛋白酶體剪切特異性的方法(PAProc算法)來(lái)預(yù)測(cè)&ιΤ8的HLA-A*0201限制性 CTL表位。BIMAS和SYFPEITHI兩種算法均是基于量化矩陣來(lái)預(yù)測(cè)肽與MHC-I分子的結(jié) 合強(qiáng)度。PAProc算法是建立在單層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法以及體外實(shí)驗(yàn)蛋白酶體剪切數(shù)據(jù)上的， 其最大優(yōu)勢(shì)在于區(qū)分了組成性蛋白酶體(constitutive proteasome)和免疫蛋白酶體 (immunoproteasome)不同的剪切特異性。綜合BIMAS、SYFPEITHI和PAProc三種算法的預(yù)測(cè)結(jié)果，本發(fā)明從人類&ιΤ8的 氨基酸序列中篩選出三條綜合得分較高的片段即可能的表位序列P1 :LLIDLTSFL(SEQ IDNo. 1) ；P2 LLSLFSLffL(SEQ ID No. 2)和 P3 =LLSILCIffV(SEQ ID No. 3)。二、合成篩選出的候選表位肽根據(jù)篩選出的可能的表位序列P1、P2和P3，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限 公司合成相應(yīng)的候選表位肽P1、P2和P3。合成方案采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，即由去保護(hù)和激活 交聯(lián)兩個(gè)反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直至合成目的多肽。合成的多肽粗品用高效液相色譜法進(jìn)行純化。 純化后的目的多肽經(jīng)反相高效液相色譜法鑒定純度均大于95%，經(jīng)質(zhì)譜法鑒定分子量與理 論值一致(圖1)。最后冷凍干燥，溫度-70°C保存?zhèn)溆?。三、候選表位肽與HLA-A * 0201分子的親和力檢測(cè)采用HLA-A*0201表達(dá)陽(yáng)性但內(nèi)源性抗原肽遞呈途徑必需的抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體 (TAP)缺陷的T2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。T2細(xì)胞表面空載的HLA-A*0201分子表達(dá)極不穩(wěn)定，呈遞后 很快降解，而結(jié)合了抗原肽的HLA-A*0201分子表達(dá)穩(wěn)定，且抗原肽與HLA-A*0201分子的結(jié) 合力越強(qiáng)，HLA-A*0201分子的表達(dá)量越高。因T2細(xì)胞的內(nèi)源性抗原肽加工處理能力缺失， 故T2細(xì)胞表面HLA-A*0201分子的表達(dá)量增加直觀地反應(yīng)了外源性抗原肽與HLA-A*0201分 子的結(jié)合力。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)大組P1組(候選表位肽PI)、P2組(候選表位肽P》、P3組(候選 表位肽P3)和陰性對(duì)照組(無(wú)關(guān)表位肽RKKRRQRRR)，每個(gè)大組又分為2個(gè)小組10M組和 100M組。將3X IO5個(gè)T2細(xì)胞接種于Iml含有濃度為10M(10M組)或100M(100M組)的肽 (按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)肽，空白對(duì)照不加肽而加入對(duì)應(yīng)量的二甲亞砜)以及濃度為10% (w/ w)的胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在溫度為371、0)2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條 件下培養(yǎng)16小時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入BB7. 2雜交瘤細(xì)胞分泌的鼠抗人HLA-A*0201 單克隆抗體100μ1，4 培養(yǎng)30分鐘，再用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入按體積比為1 50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體100 μ 1，4°C培養(yǎng)30分鐘，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞后，用流式 細(xì)胞儀于波長(zhǎng)488nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，計(jì)算熒光系數(shù)(FI)。結(jié)果如圖2所示，可見不管肽濃度為IOM或100M，Pl組、P2組和P3組的FI值均 明顯高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明候選表位肽P1、P2和P3均能有效結(jié)合HLA-A*0201分子，二者之 間具有高親和力，其中候選表位肽Pl與HLA-A*0201分子的親和力最高，其次為候選表位肽 P2。四、候選表位肽與HLA-A * 0201分子復(fù)合物的穩(wěn)定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為4組P1組(候選表位肽Pl)、P2組(候選表位肽P》、P3組(候選表 位肽P3)和陰性對(duì)照組(無(wú)關(guān)表位肽RKKRRQRRR)。將1 X IO6個(gè)T2細(xì)胞接種于Iml含有 濃度為100M的肽(按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)肽，空白對(duì)照不加肽而加入對(duì)應(yīng)量的二甲亞砜)以 及濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在溫度為37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為 5%的條件下培養(yǎng)16小時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再加入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，在溫度 為371、0)2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8小時(shí)取出細(xì)胞，加入 BB7. 2雜交瘤細(xì)胞分泌的鼠抗人HLA-A*0201單克隆抗體100 μ 1，4°C培養(yǎng)30分鐘，用PBS洗 滌細(xì)胞2次，再加入按體積比為1 50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體100 μ 1，4°C培 養(yǎng)30分鐘，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀于波長(zhǎng)488nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，計(jì)算肽 與HLA-A*0201分子復(fù)合物的半數(shù)解離時(shí)間(DC50)。結(jié)果如圖3所示，可見Pl組、P2組和P3組的DC50值均明顯高于陰性對(duì)照組，說(shuō) 明候選表位肽P1、P2和P3均能有效結(jié)合HLA-A*0201分子，且二者結(jié)合形成的復(fù)合物穩(wěn)定， 其中候選表位肽Pl與HLA-A*0201分子的復(fù)合物最穩(wěn)定，其次為候選表位肽P2。五、候選表位肽促進(jìn)特異性的CTL應(yīng)答實(shí)驗(yàn)分為4組P1組(候選表位肽PI)、P2組(候選表位肽P》、P3組(候選表位 肽P3)和陰性對(duì)照組(無(wú)關(guān)表位肽RKKRRQRR 。1、候選表位肽體外誘導(dǎo)肽特異性CTL采用聚蔗糖-泛影葡氨分層液密度梯度離心法從HLA_A*0201陽(yáng)性健康者的外周 血濃縮白細(xì)胞中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC用RPMI 1640培養(yǎng)基在溫度 37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下孵育2小時(shí)，分離非貼壁細(xì)胞[主要為淋巴細(xì)胞 (PBL)]和貼壁細(xì)胞[樹突狀細(xì)胞(DC)]。將DC按細(xì)胞密度為2X106/3ml加入含有濃度 為800IU/ml的集落刺激因子(GM-CSF)、濃度為1000IU/ml的白介素4(IL_4)以及濃度為 10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在溫度為37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下 培養(yǎng)，每2天半量換液并補(bǔ)充GM-CSF和IL-4，第5天加入終濃度為lOng/ml的腫瘤壞死因 子(TNF- a)，第7天獲得成熟DC。向成熟DC中加入終濃度為IOM的肽(按實(shí)驗(yàn)分組加入 相應(yīng)肽)，在溫度37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5 %的條件下孵育2小時(shí)，30Gy放射性處理，獲 得負(fù)載肽的DC。按PBL與DC的數(shù)量比為3 1 6 1向PBL中加入負(fù)載肽的DC，再按 PBL細(xì)胞密度為1. 5X106/2ml加入含有濃度為lOng/ml的白介素7(IL_7)以及濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在溫度為37°C、0)2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)， 第11天加入負(fù)載肽的DC再次刺激培養(yǎng)的PBL，24 48小時(shí)后向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為 10IU/ml的白介素2(IL-2)并補(bǔ)充IL-7至終濃度為lOng/ml，之后每隔7天按照上述相同 方法再次刺激培養(yǎng)的PBL，連續(xù)刺激4次，獲得肽特異性CTL，用含有濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整至適當(dāng)濃度，作為效應(yīng)細(xì)胞。2、肽特異性CTL對(duì)靶細(xì)胞的體外殺傷能力檢測(cè)將1 X IO6個(gè)T2細(xì)胞接種于Iml含有濃度為100M的肽(按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)肽) 以及濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在溫度為37°C、0)2氣體體積分?jǐn)?shù)為 5%的條件下培養(yǎng)16小時(shí)，獲得負(fù)載肽的T2細(xì)胞，作為靶細(xì)胞。將1 X IO6個(gè)靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 離心管中，用含有濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌1次，吸除大部分上清 液，剩余約0. Iml培養(yǎng)基于管底，重懸細(xì)胞，加入相應(yīng)量的SiCr溶液，在溫度為371、0)2氣 體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)2小時(shí)，獲得51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞。在96孔板中，每孔分別 按效靶比(E/T)為100 1,50 1和25 1加入效應(yīng)細(xì)胞與上述51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，每 種效靶比設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)最大釋放孔(用濃度為2mol/L的鹽酸替代效應(yīng)細(xì)胞)和最小 釋放孔[用含有濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細(xì)胞]。將96孔板 1200r/min離心30秒，溫度37°C孵育4小時(shí)，向最大釋放孔中加入終濃度為2% (w/w)的 Triton X-100并吹打混勻，孵育10分鐘，再將96孔板1200r/min離心5分鐘，分別吸取各 孔上清液至SiCr計(jì)數(shù)管，用計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，計(jì)算不同效靶比時(shí)的殺傷率。結(jié)果如圖4所示，可見Pl組、P2組和P3組在各效靶比對(duì)負(fù)載相應(yīng)肽的T2細(xì)胞均 有特異性殺傷作用，且隨著效靶比增大，特異性殺傷作用逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明候選表位肽PI、P2 和P3均能有效激發(fā)CTL的細(xì)胞毒活性，從而特異性殺傷靶細(xì)胞。3、肽特異性CTL分泌IFN- γ的能力檢測(cè)采用ELISP0T檢測(cè)試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測(cè)，具體操作 參照試劑盒說(shuō)明書調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞密度至lX106/ml，取100 μ 1鋪板，加入終濃度為IOM的 肽(按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)肽)，刺激48小時(shí)后去除細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書依次加入一抗、二 抗和顯色劑進(jìn)行反應(yīng)，顯色晾干后讀數(shù)。結(jié)果如圖5所示，可見Pl組、Ρ2組和Ρ3組的斑點(diǎn)數(shù)均明顯高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明 候選表位肽PI、Ρ2和Ρ3均具有良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)CTL分泌IFN- γ。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果候選表位肽Ρ1、Ρ2和Ρ3均能夠有效結(jié)合HLA-A*0201分子，二 者之間具有高親和力，所形成的復(fù)合物穩(wěn)定，而且能夠有效激發(fā)特異性的CTL應(yīng)答，分泌 高水平的IFN- γ，并對(duì)負(fù)載相應(yīng)表位的T2細(xì)胞具有高效殺傷能力；從而可得出以下結(jié)論 序列Pl、P2和P3均為ZnT8的HLA-A*0201限制性CTL表位，相應(yīng)的合成多肽Pl、P2和P3 均為&ιΤ8的HLA-A*0201限制性CTL表位肽，其可用于制備TlDM治療性肽疫苗。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參 照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8的HLA-A*0201限制性CTL表位，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNo. 1、SEQ ID No. 2 或 SEQ ID No. 3 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8的HLA-A*0201限制性CTL表位，其特征在于 氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
3.權(quán)利要求1所述的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8的HLA-A*0201限制性CTL表位在制備1型糖尿病 治療性肽疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8的HLA-A*0201限制性CTL表位及其應(yīng)用，該CTL表位的氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示，其能夠有效結(jié)合HLA-A*0201分子，二者之間具有高親和力，所形成的復(fù)合物穩(wěn)定，而且能夠有效激發(fā)特異性的CTL應(yīng)答，分泌高水平的IFN-γ，并對(duì)負(fù)載相應(yīng)表位的T2細(xì)胞具有高效殺傷能力，可用于制備1型糖尿病治療性肽疫苗，在1型糖尿病的臨床免疫治療領(lǐng)域有著潛在、良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102060910SQ20101054082
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)