專利名稱：三萜衍生物及含有它們的內(nèi)皮素-受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在藥物領(lǐng)域有用的化合物及其應(yīng)用，更具體地講，涉及新的能與內(nèi)皮素競爭其受體并可用于預(yù)防和治療由內(nèi)皮素過量分泌造成的疾病的三萜衍生物，以及含有它們的藥物組合物。
已被M.Yanagisawa等人于Nature，332，PP.411，1988中公開的內(nèi)皮素是一種由21種氨基酸組成的內(nèi)皮衍生的血管收縮肽，并且被認(rèn)為通過激活細(xì)胞膜上的特異性受體而對包括血管，氣管等不同組織和器官起作用?，F(xiàn)已認(rèn)定這種肽能導(dǎo)致平滑肌收縮，并且認(rèn)為這種肽過量分泌可能導(dǎo)致各種循環(huán)疾病如高血壓，心肌缺血(coronary ischemia)，腦病，腎病，各種器官的循環(huán)衰竭，以及哮喘。
據(jù)報(bào)道TXA2-受體拮抗劑和TXA2合成酶抑制劑等可以阻止內(nèi)皮素過量分泌后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加，但是，迄今為止尚沒有關(guān)于抗內(nèi)皮素的特異性拮抗劑的報(bào)道，因而需要開發(fā)能夠抑制內(nèi)皮素不同作用的藥物。在此種情況下，本發(fā)明者進(jìn)行了廣泛研究并發(fā)現(xiàn)從Myrica Cerifera L中所提取的某些三萜衍生物特別能與內(nèi)皮素競爭其受體(PCT/JP/91/01707，WO92/12991，USP5，248，807)。
本發(fā)明者懷著開發(fā)更多具有更高活性內(nèi)皮素拮抗劑的目的經(jīng)過繼續(xù)努力現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)些新三萜衍生物能夠用于實(shí)現(xiàn)上述目的。
因此，本發(fā)明提供了式(Ⅰ)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中R1代表氫或可代謝的酯殘基;R2代表氫或-R3-R4，其中R3代表-SO3-，-CH2COO-，-COCOO-，或-COR5COO-(R5代表低級亞烷基或低級亞烯基)，R4代表氫或低級烷基。
盡管所有式(Ⅰ)化合物都是高活性內(nèi)皮素拮抗劑并可用于本發(fā)明目的，但優(yōu)選那些其中R1代表氫的化合物，較優(yōu)選其中R1代表氫且R2代表-COCH＝CHCO2H的那些化合物。
對本發(fā)明來講，在此處所公開和權(quán)利要求要求保護(hù)的下列術(shù)語限定如下。
R1定義中術(shù)語“可代謝的酯殘基”獨(dú)立表示能夠在生物內(nèi)分解而再形成具有生物活性羧酸的酯殘基?？纱x的酯殘基的實(shí)例包括(1-酰氧基)低級烷基如新戊酰氧基甲基，乙酰氧甲基，1-乙酰氧基乙基等等;(1-烷氧羰氧基)低級烷基如1-(乙氧羰氧基)乙基，1-(異丙羰氧基)乙基等等，以及(5-甲基-1，3-二氧環(huán)戊烯-4-基)甲基等。
術(shù)語“低級亞烷基”指由式-(CH2)n-(n＝1-6)表示的C1-C6亞烷基，優(yōu)選C1-4亞烷基如亞甲基，1，2-亞乙基，1，3-亞丙基等。
術(shù)語“低級亞鏈烯基”是指C1-C6亞鏈烯基，如1，2-亞乙烯基，1，3-亞丙烯基，1，4-亞丁烯基等。優(yōu)選由式-(CH＝CH)m-(m＝1-3)所示的那些基團(tuán)。
R4定義中的術(shù)語“低級烷基”指直鏈或支鏈C1-C6烷基，如甲基，乙基，丙基，叔丁基。本發(fā)明化合物(Ⅰ)可與堿金屬(鈉，鉀等)，堿土金屬(鈣，鎂等)，銨或有機(jī)堿(三乙銨、三甲銨等)成鹽。
本發(fā)明化合物(Ⅰ)可與無機(jī)酸(HCl，H2SO4等)，有機(jī)酸(苯磺酸，對-甲苯磺酸等)等成鹽。
具有內(nèi)皮素受體拮抗活性的本發(fā)明式(Ⅰ)化合物是新化合物。盡管它們的制備可按本專業(yè)已知的方法來進(jìn)行，但它們可按下列方法有效制備。
如此，化合物(Ⅰ)可通過使式(V)化合物(該化合物已公開于WO92/12991內(nèi)) 與相應(yīng)的醛于Horner-Emmons反應(yīng)的反應(yīng)條件下在胺如三乙胺以及碳酸銫或溴化鋰存在下反應(yīng)來制備。起始化合物(V)可由經(jīng)按類似于WO92/12991中所述的方法通過提取從蠟果楊梅中得到的物質(zhì)衍生得到。簡言之，是將植物的枝條作極性溶劑(如，醇如甲醇，乙醇，異丙醇，正丁醇，仲丁醇，叔丁醇;丙酮;或乙腈)室溫提取數(shù)天。所得溶液用與水不混溶的有機(jī)溶劑(如，氯代烴象氯仿，二氯甲烷;乙酸乙酯;或正丁醇)進(jìn)一步提取并將提取液進(jìn)行硅膠色譜分離。將分離出的物質(zhì)然后進(jìn)行化學(xué)改性得到式(Ⅳ)Myricerone 化合物(Ⅴ)通過將化合物(N)與二甲膦酰乙酸反應(yīng)而得。
化合物(V)然后與式(Ⅲ)醛 其中R2的定義同上，R6代表叔丁氧羰基(以下簡寫作BOC)或氫，在Horner-Emmons反應(yīng)的反應(yīng)條件反應(yīng)。將所得縮合產(chǎn)物脫保護(hù)和/或化學(xué)改性得到本發(fā)明化合物Ⅰ。
Horner-Emmons反應(yīng)可按下述兩種方法中的任何一種來進(jìn)行。方法1
式(Ⅰ)羧酸，例如，其中R2代表-COCH＝CHCO2H的式(Ⅰ)化合物，的制備可直接通過使化合物(Ⅴ)與具有所要取代基的醛(Ⅲ)，例如其中R2代表-COCH＝CHCO2Me且R6代表氫的化合物(Ⅲ)，在適當(dāng)溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亞硯(DMSO)，乙腈或類似溶劑中于二氮雜雙環(huán)十一碳烯(DBU)，氯化鋰等存在于0-50℃，優(yōu)選室溫反應(yīng)0.1-24hr，優(yōu)選0.5-2hr，用乙酸乙酯，二氯甲烷等提取反應(yīng)混合物得到甲基酯，并水解所述甲基酯來進(jìn)行。
方法2方法2具有能夠十分容易制備化合物(Ⅰ)的各種衍生物的優(yōu)點(diǎn)。其中R2代表氫的式(Ⅰ)胺的制備可通過下述方法進(jìn)行使化合物(Ⅴ)與醛(Ⅲ)(其中R2代表氫且R6代表BOC)按類似于方法1所述的方法反應(yīng)，用苯甲醚和三氟乙酸于0-50℃，優(yōu)選室溫處理形成的縮合產(chǎn)物0.1-24小時(shí)，優(yōu)選0.5-2hr使其脫保護(hù)，并利用，例如，硅膠柱色譜手段純化產(chǎn)物。所得胺被進(jìn)一步用于制備各種衍生物。
根據(jù)下面所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以很清楚地知道本發(fā)明化合物(Ⅰ)具有內(nèi)皮素受體拮抗活性，不僅可被用于預(yù)防和治療循環(huán)疾病如血管收縮，高血壓等病癥，還可用于降低免疫抑制劑孢菌素的腎毒性。
對于臨床使用，本發(fā)明化合物可按常規(guī)方法與常用載體，稀釋劑，賦形劑一同被制成適于口服，胃腸外或肛門給藥的適當(dāng)制劑。
盡管本發(fā)明化合物的適宜日劑量依據(jù)各種因素而變化，所述因素如欲要的治療效果，給藥途徑，病人的年齡和體重等，但對于成年患者，日劑量通?？诜?0mg至2g，優(yōu)選50mg-1g，胃腸外給藥為5mg-2g，優(yōu)選50mg-1g，以1-4次分劑量給用。
下列實(shí)施例被用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，不能被認(rèn)作限制本發(fā)明。
制備1制備Myricerol(4)
1)將蠟果楊梅的枝條(170kg)室溫下用甲醇提取，得到提取物(9.6kg)。將提取物分成數(shù)份(每份500g)并分別分配在乙酸乙酯(1.5L)和水(1L)之間。將所得乙酸乙酸溶液(總計(jì)2.4kg)分成數(shù)分(每份200g)并分別通過ODS硅膠(Chromatorex ODS，F(xiàn)uji-Division Chemical Ltd.，800g)色譜分離，用甲醇/水(8515)洗脫，得到含有化合物(1)和(2)的餾分(a)(總計(jì)135.4g)和主要包含化合物(3)的餾分(b)(總計(jì)226.5g)將餾分(a)進(jìn)行乙酰化作用繼之采用離心液-液分配色譜法分離(洗脫劑正乙烷/甲苯/甲醇/水，70∶30∶35∶15)，得到含乙?；衔?1)的餾分(171g)和含乙?；衔?2)的餾分(56g)。從前一餾分可得到乙酰化化合物(1)(23g)。
將乙?；衔?2)(56g)二等分并將各部分溶于10%甲醇含水氫氧化鉀溶液(700ml，含水量，10%)。將溶液在氬氣氛中加熱回流72hr。加入水(100ml)，然后將混合物減壓蒸餾除去甲醇，用稀HCl調(diào)節(jié)至PH6，并用乙酸乙酯(300ml)(×3)提取。將乙酸乙酯溶液用水洗滌并蒸去乙酸乙酯。向殘余物中加入甲醇并濾出所形成的沉淀。母液經(jīng)ODS硅膠色譜分離，用甲醇/水(85∶15)洗脫并濾出所分離出的結(jié)晶。合并第一批和第二批產(chǎn)物并用甲醇重結(jié)晶得到化合物(4)(13.5g)。
主要包含化合物(3)的餾分(b)(226g)用堿按與上所述的相同方式處理得到化合物(4)(43g)。M.P.250-251℃。
Myricerol(4)D25+65.3°(CHCl3).
MS m/z 472(C30H48O4).
IR(CHCl3)3504，1695cm-1.
1H NHR(CDCl3)δ5.85(1H，br-t，H-12)，3.78(1H，d，J＝12.2Hz，H-27)，3.19(1H，d，J＝12.2Hz，H-27)，3.22(1H，dd，J＝15.6，5.2Hz，H-3)，2.93(1H，dd，J＝14.0，4.6Hz，H-18)，0.98，0.96，0.91，0.88，0.76，0.71(each 3H，s，H-23，H-24，H-25，H-26，H-29，H-30).
13C NMR(CDCl3)δ38.1(C-1)，26.9(C-2)，78.8(C-3)，38.7(C-4)，54.9(C-5)，18.2(C-6)，32.3(C-7)，39.8(C-8)，48.4(C-9)，37.1(C-10)，24.5(C-11)，129.5(C-12)，137.9(C-13)，47.5(C-14)，24.5(C-15)，22.5(C-16)，46.0(C-17)，40.5(C-18)，45.0(C-19)，30.8(C-20)，33.5(C-21)，32.5(C-22)，28.0(C-23)，15.8(C-24)，15.5(C-25)，18.3(C-26)，62.9(C-27)，181.4(C-28)，33.0(C-29)，23.8(C-30).
2)或者，將按似上述1)的方法由蠟果楊梅枝條(100kg)所得到的乙酸乙酯可溶性部分(1.6kg)進(jìn)行硅膠色譜分離(洗脫劑甲醇/水，85∶15)并收集包含化合物(1)(7g)的部分和隨后的包含化合物(2)和(3)的混合物(142g)部分。后一餾分用堿按上述方式處理得到化合物(4)的粗晶體，將該結(jié)晶重結(jié)晶得到化合物(4)(36g)。
制備2制備Horner-Emmons試劑(化合物Ⅴ) 1)制備化合1室溫及氮?dú)夥障掠?0分鐘內(nèi)向制備1所制備的Myricerol(4)(10.19g，21.55mmole)的吡啶(80ml)溶液內(nèi)滴加入乙酐(80ml，0.86mole)并室溫?cái)嚢杌旌衔?.5hr。待冷至0°后，在5分鐘內(nèi)向混合物內(nèi)滴加入甲醇(69ml，1.70mole)。將混合物室溫?cái)嚢?0分鐘并傾到冰冷卻的濃HCl(90ml)/水(200ml)/二氯甲烷(400ml)的混合物內(nèi)。分出有機(jī)層后，水層用二氯甲烷(400ml)提取。各有機(jī)層用1NHCl(300ml)，鹽水(300ml)(×2)洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物形式化合物1(12.0g、21.55mmole產(chǎn)量100%)。M.P.185-186℃。
化合物11H NMR(CDCl3)δ ppm0.72(s，3H)，0.84(s，3H)，0.87(s，3H)，0.86(s，3H)，0.93(s，6H)，0.8-2.0(m，22H)，2.03(s，3H)，2.05(s，3H)，2.88(dd，J＝4.6Hz，J＝13.8Hz，1H)，4.04(ABq，A部分，J＝12.7Hz，1H)，4.16(ABq，B部分，J＝12.7Hz，1H)，4.47(dd，J＝6.6Hz，J＝9.4Hz，1H)，5.57(brs，1H)IR(CHCl3)1718，1690cm-1.
2)化合物2的制備在室溫及氮?dú)夥障孪蚨宜狨?(12.0g，21.55mmole)中加入5%KOH的甲醇溶液(300ml，水含量，5%)。將混合物室溫?cái)嚢?hr，冷卻至0℃，用4NHCl(60ml)中和并減壓蒸去甲醇。殘余物溶于冰卻的水(400ml)/乙酸乙酸(600ml)中。分出有機(jī)層后，水層用二氯甲烷(200ml)提取。各有機(jī)層用鹽水(400ml)洗滌，無水硫酸鎂干燥，并濃縮。殘余物溶于四氫呋喃(THF)(50ml)中。加入硅膠(50g)后，將混合物濃縮并利用柱色譜純化(SiO2)，500g;二氯甲烷→乙酸乙酯/乙酸甲酯(1∶4)→乙酸乙酯)，得到目標(biāo)化合物2(6.38，12.40mmole產(chǎn)率58%)。M.P.257-258℃;[α]D+103.5°(C＝1.0/CHCl3)。
化合物21HNMR(CDCl3δppm0.72(s，3H)，0.76(s，3H)，0.87(s，3H)，0.90(s，3H)，0.93(s，3H)，0.98(s，3H)，0.9-2.0(m，22H)，2.02(s，3H)，2.88(dd，J＝4.2Hz，J＝13.6Hz，1H)，3.22(dd，J＝5.4Hz，J＝10.0Hz，1H)，4.05(ABq，A部分，J＝12.4Hz，1H)，4.17(ABq，B部分，J＝12.4Hz，1H)，5.57(t，J＝3.1Hz，1H).
IR(CHCl3)3510，1722，1692cm-1.
13C NMR(CDCl3)δ ppm15.5，15.6，18.2，18.3，21.3，22.7，23.4，23.6，23.8，27.0，28.0，30.6，32.4，33.0，33.0，33.6，37.2，38.5，38.7，39.9，40.7，44.9，44.9，46.1，48.7，55.2，66.3，78.8，127.2，137.2，171.1，182.1.
3)化合物3的制備將化合物2(18.13g，35.23mmole)和氯仿(600ml)的混合物用丙酮(300ml)稀釋。在室溫及氮?dú)夥諚l件下向所形成的溶液內(nèi)滴加入瓊斯試劑(CrO3/H2SO4，約2.43M硫酸溶液，21.75ml，52.85mmole)并將混合物在同樣溫度下攪拌30分鐘。向此混合物內(nèi)滴加入甲醇(42.94ml，1.06mole)并室溫?cái)嚢?0分鐘。將反應(yīng)混合物傾入水(400ml)中并用氯仿提取(800ml)(×2)。有機(jī)層用水(400ml)洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物(17.39g，33.92mmole，產(chǎn)率96%)。[α]D+108.5(Cl.0/CHCL3)。
化合物31HNMR(CDCl3)δppm0.78(s，3H)，0.88(s，3H)，0.94(s，3H)，1.02(s，3H)，1.03(s，3H)，1.08(s，3H)，0.9-2.0(m，20H)，2.01(s，3H)，2.3-2.7(m，2H)，2.90(dd，J＝4.2Hz，J＝13.6Hz，1H)，4.05(ABq，A部分，J＝12.6Hz，1H)，4.20(ABq，B部分，J＝12.6Hz，1H)，5.59(br s，1H).
IR(CHCl3)1725，1696cm-1.
13C NMR(CDCl3)δppm15.2，18.1，19.5，21.2，21.4，22.6，23.3，23.6，23.8，26.4，30.6，32.0，32.3，32.4，33.5，34.0，36.9，39.0，39.8，40.7，44.7，45.0，46.3，47.4，47.9，55.1，65.9，127.0，137.0，170.8，183.7，217.4.
4)化合物(Ⅳ)(Myricerone)的制備向化合物3(17.38g，33.9mmole)中加入5%KOH甲醇溶液(870ml，水含量，5%)并將此混合物于65℃攪拌3hr，冷至室溫并減壓蒸餾除去甲醇至有白色晶體沉淀為止。殘余物用冰冷卻的4NHCL(200ml)/二氯甲烷(600ml)酸化并分出有機(jī)層。水層用二氯甲烷提取(300ml)(×2)。各有機(jī)層用水(400ml)洗滌(×2)，無水硫酸鎂干燥并用色譜法純化(SiO2，140g;二氯甲烷→乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶9→1∶6→1∶4)，得到目標(biāo)化合物(Ⅳ)(13.0g，27.62mmole，產(chǎn)率81%)。M.P.，226-227℃;[α]D+91.3℃(Cl.1/CHCl3)。
化合物(Ⅳ)1HNMR(CDCl3)δppm0.76(s，3H)，0.92(s，3H)，0.97(s，3H)，1.01(s，6H)，1.08(s，3H)，1.0-2.1(m，20H)，2.3-2.6(m，2H)，2.94(dd，J＝4.5Hz，J＝13.5Hz，1H)，3.24(ABq，A部分，J＝11.8Hz，1H)，3.78(ABq，B部分，J＝11.8Hz，1H)，5.87(br s，1H).
IR(CHCl3)3510，1696cm-1.
13C NMR(CDCl3)δppm15.5，18.3，19.5，21.3，22.4，23.8，24.1，24.4，26.5，30.8，32.0，32.2，33.0，33.5，34.0，36.8，38.7，39.7，40.4，44.9，46.2，47.3，47.5，47.6，54.7，63.1，129.4，137.7，183.4，217.4.
5)化合物(Ⅴ)的制備于室溫及氮?dú)夥諚l件下向二甲膦酰乙酸(7.07g，42.1mmole)的二氯甲烷(100ml)溶液內(nèi)加入亞硫酰氯(9.21ml，126mmole)，并將混合物室溫?cái)嚢?hr，濃縮得到?；?7.85g)。
于-78℃及氮?dú)夥諚l件下向化合物(Ⅳ)(6.60g，14.0mmole)的二氯甲烷(70ml)溶液內(nèi)滴加入吡啶(4.53ml，56mmole)，與此同時(shí)內(nèi)溫升至-73℃。于25分鐘內(nèi)向混合物內(nèi)滴加入上面所制的?；?7.85g，14.0mmole)的二氯甲烷(70ml)溶液，與此同時(shí)內(nèi)溫升至-68℃。于-75℃攪拌40分鐘后，減壓蒸去溶劑。殘留物懸浮于THF(84ml)并冷至0℃。向此懸浮液內(nèi)加入2NNaOH(14ml，28mmole)并將混合物于0℃攪拌hr。將反應(yīng)混合物傾入冰冷卻的1NHCl(50ml)/乙酸乙酯(200ml)內(nèi)并分出有機(jī)層。水層用乙酸乙酯(150ml)提取(×2)。待各有機(jī)層用鹽水(100ml)(×2)洗滌后，將它們合并，用無水硫酸鎂干燥并濃縮。殘留物利用柱色譜純化(SiO2，150g;乙酸乙酯/正已烷(11)→乙酸乙酯→氯仿/甲醇(100∶1→50∶1→21∶1))，得到目標(biāo)化合物(Ⅴ)(7.43g，11/97mmole，產(chǎn)率85%)。M.P.，110-113℃;[α]D22+83.9°(C1.0/CHCl3)。
化合物(Ⅴ)1HNMR(CDCl3δppm0.80(s，3H)，0.89(s，3H)，0.94(s，3H)，1.02(s，3H)，1.04(s，3H)，1.08(s，3H)，1.0-2.0(m，20H)，2.3-2.7(m，2H)，2.8-3.0(m，1H)，2.95(d，2JPH＝22.0Hz，2H)，3.78(s，3H)，3.83(s，3H)，4.13(ABq，A部分，J＝12.9Hz，1H)，4.32(ABq，B部分，J＝12.9Hz，1H)，5.60(br s，1H).
IR(CHCl3)2944，1728，1696，1263cm-1.
13C NMR(CDCl3)δ ppm15.3，18.0，19.5，21.4，22.7，22.8，23.5，23.7，26.5，30.6，32.2，32.4，32.8，32.9，33.6，34.0，34.9，37.0，39.0，39.9，40.8，45.3，46.3，46.4(d，1JCP＝144Hz)，47.4，53.1(d，2JCOP＝6.4Hz)，53.2(d，2JCOP＝6.4Hz)，66.8，127.4，137.0，165.3(d，2JCCP＝6.4Hz)，183.2，217.3.
制備3醛[Ⅲ]的制備
醛[Ⅲ]可按Somei等人在chem. Pharm.Bull.282515(1980)中所提出的方法來制得。
向羥基硝基苯甲醛[Ⅰ](1g)的乙酸/水(1∶1)(20ml)溶液內(nèi)加入三氯化鈦的水溶液(25ml)并室溫?cái)嚢杌旌衔?0分鐘。反應(yīng)混合物傾到水/乙酸乙酯內(nèi)。水層用碳酸鈉調(diào)節(jié)至PH8并用乙酸乙酯提取。乙酸乙酯提取液用無水硫酸鎂干燥并濃縮到約20ml，得到化合物[Ⅱ]的乙酸乙酯溶液。
在冰冷卻下面此溶液內(nèi)加入吡啶(0.46ml)和3-甲氧羰基丙烯酰氯(442mg)。0℃攪拌30分鐘后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酸提取。濃縮提取液并分離出固體沉淀，過濾得到粉末狀目標(biāo)醛[Ⅲ](432mg，產(chǎn)率29%)化合物[Ⅲ]1HNMR(CDCl3+CD3OD)δppm3.85(s，3H)，6.91(d，1H，J＝15.4Hz)，7.12(d，1H，J＝15.4Hz)，7.14(d，1H，J＝2.8Hz)，7.18(dd，1H，J＝8.8，2.8Hz)，8.58(d，1H，J＝8.8Hz)，9.86(s，1H).
實(shí)施例1化合物(Ⅰ)(R1＝H;R2＝-C(O)CH＝CHCO2H)的制備
1)化合物1m的制備([Ⅲ]和(Ⅴ)的縮合作用)向上述制備2中所得的Horner-Emmons試劑(化合物Ⅴ))(621mg，1mmole)和醛[Ⅲ](299mg，1.2mmole)的二甲基甲酰胺(6ml)溶液內(nèi)加入二氮雜雙環(huán)十一碳烯(DBU)(0.358ml)和氯化鋰(93mg)，并將此混合物室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酸提取并能過硅膠色譜分離(洗脫劑氯仿/甲醇)，得到化合物1m(670mg，產(chǎn)率90%)。
化合物1m1HNMR(CDCl3δppm0.83(s，3H)，0.84(s，3H)，0.93(s，3H)，1.03(s，3H)，1.04(s，3H)，1.07(s，3H)，1.0-2.1(m，20H)，2.2-2.8(m，2H)，2.8-3.0(m，1H)，3.84(s，3H)，4.16，4.40(ABq，2H，J＝13.0Hz)，5.61(br s，1H)，6.27(d，1H，J＝16.0Hz)，6.90(dd，1H，J＝8.8，2.8Hz)，6.94(d，1H，J＝15.2Hz)，7.07(d，1H，J＝2.8Hz)，7.21(d，1H，J＝15.2Hz)，7.44(d，1H，J＝8.8Hz)，7.74(d，1H，J＝16.0Hz).
化合物1m即是化合物1b的前體也是本發(fā)明所要的化合物。
2)化合物1b的制備向甲基酯1m(5mg，6.6μmole)的甲醇(300μ1)溶液內(nèi)加入1NNaOH(100ul)。室溫?cái)嚢杌旌衔?.5小時(shí)并用乙酸乙酯提取。減壓濃縮提取液。殘留物用硅膠色譜純化(洗脫劑乙酸乙酯/乙酸/水，30∶1∶1)，得到化合物1b(3.5mg，產(chǎn)率73%)。
3)化合物1C的制備向上制備的化合物1b(21.9mg，0.03mmole)的水(1.2ml)懸浮液內(nèi)加入0.1NNaOH(600μl)并將所得溶液凍干，得到二鈉鹽(化合物1C)(21.5mg，產(chǎn)率93%)。
實(shí)施例2化合物(Ⅰ)(R1＝H;R2＝H)的制備 1)制備2-氨基-5-羥基化合物(1)的另一種方法
ⅰ)醛(Ⅲ)的制備按照E.Georgavakis等人在Helv.Chim.Acta.，62∶234(1979)中所述方法，制得粗2-氨基-5-羥基苯甲醛。將由吲唑所制得的2-氨基-5-羥基苯甲醛(400mg，3.39mmole)溶于乙酸乙酯(約100ml)內(nèi)。向此溶液內(nèi)加入三乙胺(2.36g)。二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyldicarbonate)((Boc)2O)(37g)和催化量二甲氨基吡啶(DMAP)?；旌衔镉谑覝?cái)嚢?小時(shí)，用氯仿提取并通過硅膠色譜純化(正-已烷/乙酸乙酯，4∶1)，得到醛(Ⅲ)(454mg，產(chǎn)率56%)。
醛(Ⅲ)1HNMR(CDCl3)δppm1.56(s，9H)，6.65(d，1H，J＝8.8Hz)，7.12(dd，1H，J＝8.8，2.8Hz)，7.30(d.1H，J＝2.8Hz)，9.82(s，1H).
ⅱ)羥基保護(hù)的胺(Ⅵ)的制備向化合物(Ⅴ)(294mg，0.47mmole)和上述制備的醛(Ⅲ)(135mg，1.2eq)的異丙醇(4ml)溶液內(nèi)加入碳酸銫(618mg，4eq.)。將混合物室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，用乙酸乙酸提取，并濃縮。殘留物通過利用硅膠色譜純化(已烷/乙酸乙酯，1∶1)，得到縮合產(chǎn)物(Ⅵ)(350mg，產(chǎn)率93%)。
化合物(Ⅵ)
1HNMR(CDCl3)δppm0.83(s，3H)，0.86(s，3H)，0.93(s，3H)，1.03(s，3H)，1.03(s，3H)，1.08(s，3H)，1.57(s，9H)，1.1-2.1(m，20H)，2.2-2.6(m，2H)，2.8-3.0(m，1H)，4.12，4.42(ABq，2H，J＝11.8Hz)，5.64(br s，1H)，6.25(d，1H，J＝15.6Hz)，6.76(d，1H，J＝9.0Hz)，7.04(dd，1H，J＝9.0，2.6Hz)，7.20(d，1H，J＝2.6Hz)，7.75(d，1H，J＝15.6Hz).
ⅲ)脫保護(hù)制備胺1a向化合物(Ⅵ)(330m物0.45mmole)的苯甲醚(3ml)溶液內(nèi)加入三氟乙酸(3.0ml)。將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)并減壓濃縮。殘留物通過硅膠色譜純化(乙酸乙酯)，得到化合物1a(210mg，產(chǎn)率74%)。

利用實(shí)施例2中所制的化合物1a作原料制得化合物1b-1e，1g-1i，及1k。
化合物 R1R21bH COCH=CHCOOH(trans)1cNa COCH=CHCOONa(trans)1dH COCH=CHCOOH(cis)1gH COCOOH1hH COCH2COOH1eH CO(CH)2CCOOH1iH CO(CH2)3COOH1kH SO3H1)化合物1b的制備ⅰ)于-78℃向化合物1a(10mg)的二氯甲烷(150μ1)溶液內(nèi)加入吡啶(13μl)，然后加入3-乙氧羰基丙烯酰氯(32μl，2eq.)。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物1小時(shí)并用乙酸乙酯提取。將提取液減壓濃縮。殘留物通過硅膠色譜純化(氯仿/甲醇，50∶1)，得到化合物(Ⅶ)(7.2mg，產(chǎn)率60%)。
化合物Ⅶ)
1HNMR(CDCl3+CD3OD)δppm0.82(s，3H)，0.86(s，3H)，0.93(s，3H)，1.04(s，6H)，1.06(s，3H)，1.34(t，3H，J＝7.2Hz)，1.1-2.1(m，20H)，2.2-2.7(m，2H)，2.8-3.0(m，1H)，4.28(q，2H，J＝7.2Hz)，4.15，4.40(ABq，2H，J＝13.2Hz)，5.61(br s，1H)，6.24(d，1H，J＝15.8Hz)，6.89(dd，1H，8.6，2.8Hz)，6.94(d，1H，J＝15.4Hz)，7.05(d，1H，J＝2.8Hz)，7.20(d，1H，J＝15.4Hz)，7.47(d，1H，J＝8.6Hz)，7.74(d，1H，J＝15.8Hz).
ⅱ)向乙基酯(Ⅶ)(5mg，6.6μmole)的甲醇(300μl)溶液內(nèi)加入1NNaOH(100μl)。將混合物室溫?cái)嚢?.5小時(shí)并用乙酸乙酯提取，減壓濃縮提取液。殘留物經(jīng)硅膠色譜純化(乙酸乙酯/乙酸/水，30∶1∶1)，得到化合物1b(3.5mg，73%)。
2)化合物1c的制備向上述1)中所制的化合物1b(21.9mg，0.03mmole)的水(1.2ml)懸浮液內(nèi)加入0.1NNaOH(600μl)并將所得溶液凍干，得到二鈉鹽1c(21.5mg，產(chǎn)率93%)。
3)化合物1d的制備0℃及氮?dú)夥罩邢蚧衔?a(3.2mg，0.005mmole)的二氯甲烷(0.2ml)懸浮液內(nèi)加入馬來酐(1.0mg，0.01mmole)和吡啶(0.8μl，0.01mmole)?；旌衔锸覝?cái)嚢?.5小時(shí)，用乙酸乙酯稀釋并傾入冰冷卻的1NHCl中。分出有機(jī)層并將水層用乙酸乙酯提取。將有機(jī)層合并并用鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮。殘留物經(jīng)柱色譜純化(SiO，乙酸乙酯→乙酸乙酯/乙酸/水(30∶1∶1)，得到化合物1d(3.32mg，產(chǎn)率91%)。
4)化合物1e的制備于0℃及氮?dú)夥諚l件下向化合物1a(3.2mg，0.005mmole)的二氯甲烷(0.2ml)懸浮液內(nèi)中入琥珀酐(1.0mg，0.01mmole)和吡啶(0.8μl，0.01mmole)。將混合物溶于DMF(30μl)內(nèi)并室溫?cái)嚢杷纬傻娜芤?小時(shí)。加入催化量DMAP后，將混合物室溫?cái)嚢栊r(shí)，用乙酸乙酯稀釋并傾入冰冷卻的1NHCl中。分出有機(jī)層并將水層用乙酸乙酯提取。各有機(jī)層用鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮。殘余物經(jīng)柱色譜純化(SiO2，乙酸乙酯→乙酸乙酯/乙酸/水(30∶1∶1)，得到化合物1e(2.00mg，產(chǎn)率55%)。
5)化合物1q的制備于-78℃向化合物1a(11.6mg)和吡啶(4.5μl)的二氯甲烷(0.2ml)溶液內(nèi)加入一甲基草酰氯(1.9μl，1.1eq)?；旌衔镉?40℃攪拌10分鐘并提取以及用色譜法純化，得到化合物1q的甲基酯(8.5mg，64%)。于0℃向比甲基酯(7.4mg)的甲醇(0.3ml)溶液內(nèi)加入1NNaOH(0.15ml)并攪拌混合物2小時(shí)。提取反應(yīng)混合物并利用色譜法純化，得到化合物1q(30mg，41%)。
6)化合物1h的制備ⅰ)向化合物1a(6.3mg，0.01mmole)的二氯甲烷(0.3ml)懸浮液內(nèi)加入DMF(30μl)得到一溶液。于-50℃及氮?dú)夥諚l件下向此溶液內(nèi)加入吡啶(1.2μl，0.015mmole)和1M乙氧羰基乙酰氯的二氯甲烷溶液(11μl，0.011mmole)。于-50℃攪拌5分鐘后，混合物用乙酸乙酯稀釋并傾入冰冷卻的1NHCl中。分出有機(jī)層并將水層用乙酯乙酯提取。各有機(jī)層用鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮。殘留物和柱色譜純化(SiO2，乙酸乙酯/正已烷(2∶1)→乙酸乙酯)，得到化合物1h的乙基酯(4.0mg，產(chǎn)率54%)。
1H NMR(CDCl3)δppm0.81(s，3H)，0.87(s，3H)，0.94(s，3H)，1.03(s，6H)，1.07(s，3H)，1.34(t，J＝7.0Hz，3H)，1.0-2.1(m，20H)，2.2-2.6(m，2H)，2.8-3.0(m，1H)，3.54(s，2H)，4.30(q，J＝7.0Hz，2H)，4.18(ABq，A部分，J＝13.3Hz，1H)，4.39(ABq，B部分，J＝13.3Hz，1H)，6.28(d，J＝15.8Hz，1H)，6.82(dd，J＝2.6Hz，8.8Hz，1H)，6.99(d，J＝1.6Hz，1H)，7.39(d，J＝8.8Hz，1H)，7.75(d，J＝15.2Hz，1H).
ⅱ)于0℃及氮?dú)夥諚l件下向上述ⅰ)所制備的乙基酯(4.0mg，0.00536mmole)的甲醇(100μl)溶液中加入2NNaOH(50μl，0.10mmole)?；旌衔镉?℃攪拌30分鐘，用乙酸乙酯稀釋并倒入冰冷卻的1NHCl中。分出有機(jī)層并將水層用乙酸乙酯提取。各有機(jī)層用鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮。殘留物用柱色譜純化(SiO2，氯仿/甲醇(50∶1→10∶1)→乙酸乙酯→乙酸乙酯/乙酸/水(30∶1∶1))，得到化合物1h(1.9mg，產(chǎn)率50%)。
7)化合物1i的制備于0℃及氮?dú)夥障孪蚧衔?a(5.0m物0.0079mmole)的DMF(50μl)溶液內(nèi)加入吡啶(1.3μl，0.0158mmole)和戊二酸酐(1.4mg，0.0119mmole)。室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，混合物用乙酸乙酯稀釋并傾入冰冷卻的1NHCl內(nèi)。分出有機(jī)層并將水層用乙酸乙酯提取。各有機(jī)層用鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮。殘留物經(jīng)柱色譜純化(SiO2，氯仿/甲醇(50∶1)→(20∶1)→(10∶1)→(6∶1))得到化合物1i(3.0mg，51%)。
8)化合物1K的制備室溫和氮?dú)夥諚l件下向化合物1a(29.5m物0.0167mmole)的DMF(0.5ml)溶液內(nèi)加入三氧化硫和三甲胺的配合物(325mg，0.233mmole)。室溫?cái)嚢?0分鐘后，將混合物濃縮并利用柱色譜純化(SiO2，乙酸乙酯/乙酸/水(30∶1∶1)→(15∶1∶1)→(8∶1∶1)→(4∶1∶1))，得到化合物1K(4.42mg，產(chǎn)率13%)。
實(shí)施例4制備化合物1n(R1＝H;R2＝CH2COOH)化合物1n可基本上按類似于實(shí)施例2所述的方法制備。
1)制備醛ⅰ)向吲唑(1.0g，8.3mM)的甲醇(10μ)溶液內(nèi)加入28%甲醇鈉的甲醇溶液(3.53ml，18.26mmole)和溴乙酸(1.41g，9.96mmole)，并將混合物加熱回流2小時(shí)。待再加入等量甲醇鈉和溴乙酸后，將混合物再加熱回流1小時(shí)。將加入步驟再重復(fù)兩次將混合物冷至0℃。待加入乙酸乙酯后，混合物用1NHCl調(diào)節(jié)至PH5。分出有機(jī)層并將水層用乙酸乙酯提取。各有機(jī)層溶液用鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮。殘留物經(jīng)柱色譜純化(SiO2，乙酸乙酯→乙酸乙酯/乙酸/水，(40∶1∶1)→(30∶1∶1)→(8∶1∶1))得到1-羧甲基吲唑(487mg，產(chǎn)率33%)。
1N NMR(DMSO)δppm5.27(s，2H)，7.16(dd，J＝7.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，7.39(dd，J＝7.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，7.64(d，J＝8.0Hz，1H)，7.77(d，J＝8.0Hz，1H)，8.09(s，1H).
ⅱ)向1-羧甲基吲唑(236mg，1.34mmole)的THF(2ml)溶液內(nèi)加入重氮甲烷的乙醚溶液，直到淡黃色不再逐漸消失為止。濃縮該溶液并將殘留物通過柱色譜純化(SiO2，乙酸乙酯/已烷，(1∶3)→(1∶2))，得到1-甲氧羰基甲基吲唑(182mg，產(chǎn)率71%)。
1N NMR(CDCl3)δppm3.75(s，3H)，5.18(s，2H)，7.19(ddd，J＝1.0Hz，J＝6.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，7.34(dd，J＝1.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，7.43(ddd，J＝1.0Hz，J＝6.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，7.76(dd，J＝1.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，8.07(s，1H).
ⅲ)在一石英光敏裝置內(nèi)將1-甲氧羰甲基吲唑(100mg，0.526mmole)溶于二惡烷(2ml)內(nèi)并用0.1N硫酸(200ml)稀釋。待向溶液內(nèi)鼓入氮?dú)?0分鐘后，將反應(yīng)混合物冷至0℃，并用高壓汞燈(450瓦)照射20分鐘，用乙酸乙酯提取(×2)。乙酸乙酯提取液用鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮，得到5-羥基-2-甲氧羰基甲氨基苯甲醛(大約8g)。
1H NMR(CDCl3)δppm3.79(s，3H)，4.03(s，2H)，6.49(d，J＝9.6Hz，1H)，7.02(d，J＝2.8Hz，1H)，7.02(dd，J＝2.8Hz，J＝9.6Hz，1H)，9.80(s，1H).
ⅳ)0℃氮?dú)夥障孪蛏鲜觫?所制的粗產(chǎn)物的乙酸乙酯溶液內(nèi)加入吡啶(85μl，1.0.5mmole)和乙酐(55μl，0.579mmole)。待0℃攪拌1小時(shí)及室溫?cái)嚢?5分鐘后，向混合物內(nèi)加入吡啶(4251，5.25mmole)和乙酐(55μl，0.579mmole)。將混合物室溫?cái)嚢?0分鐘，再加入吡啶425μl，5.25mmole)和乙酐(99μl，105mmole)并繼續(xù)在室溫下攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物傾入冰冷卻的1NHCl中并用乙酸乙酯提取。有機(jī)溶液用鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮。殘留物利用柱色譜純化(SiO2;乙酸乙酯/二氯甲烷，1∶9)，得到5-乙酰氧基-2-甲氧羰甲基苯甲醛(89mg，產(chǎn)率67%)。
1H NMR(CDCl3)δppm2.30(s，3H)，3.80(s，3H)，4.04(s，2H)，6.55(d，J＝9.0Hz，1H)，7.16(dd，J＝2.6Hz，J＝9.0Hz，1H)，7.28(d，J＝2.6Hz，1H)，8.63(br s，1H)，9.82(s，1H).
ⅴ)室溫及氮?dú)夥障孪蛏鲜鋈?6.0mg，0.024mmole)的DMF(0.2ml)溶液內(nèi)加入合物(ⅴ)(12.4mg，0.02mmole)，DBU(12.0μl，0.08mmole)和氯化鋰(3.4mg，0.08mmole)并將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋并傾入到冰冷卻的1NHCl內(nèi)。分出有機(jī)溶液并將水層用乙酸乙酯提取。各有機(jī)層用鹽水洗滌，硫酸鎂干燥并濃縮。殘留物經(jīng)用柱色譜純化(SiO2;氯仿→氯仿/甲醇，(100∶1)→(50∶1))得到加成產(chǎn)物(即，化合物1n的甲基酯，R＝CHCO2Me)(10.5mg，產(chǎn)率70%)。
1H NMR(CDCl3)δppm0.83(s，3H)，0.87(s，3H)，0.94(s，3H)，1.02(s，3H)，1.03(s，3H)，1.08(s，3H)，1.0-2.1(m，20H)，2.29(s，3H)，2.2-2.6(m，2H)，2.8-3.0(m，1H)，3.80(s，3H)，3.94(s，2H)，4.13(ABq，A部分，J＝12.6Hz，1H)，4.43(ABq，B部分，J＝12.6Hz，1H)，5.69(br s，1H)，6.27(d，J＝15.6Hz，1H)，6.54(d，J＝8.8Hz，1H)，7.01(dd，J＝2.7Hz，J＝8.8Hz，1H)，7.11(d，J＝2.7Hz，1H)，7.76(d，J＝15.6Hz，1H).
ⅵ)0℃及氮?dú)夥障孪蛏喜剿苹衔?9.7mg，0.013mmole)的甲醇(200μl)溶液內(nèi)加入2NNaOH(100μl，0.20mmole)。0℃攪拌1小時(shí)后，混合物用乙酸乙酯稀釋并用1NHCl酸化。分出有機(jī)層并將水層用乙酸乙酯提取。各有機(jī)層用鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥并濃縮。殘留物經(jīng)用柱色譜純化(SiO2;氯仿/甲醇(50∶1)→(20∶1)→乙酸乙酯→乙酸乙酯/乙酸/水(30∶1∶1))得到化合物1n(5.4mg，產(chǎn)率60%)。
上述實(shí)施例中所制的化合物(Ⅰ)的光譜數(shù)據(jù)總結(jié)如下?；衔?a
Rf0.35(己烷/乙酸乙酯;1∶1).
1H NMR(CD3OD)δppm0.87(s，3H)，0.89(s，3H)，0.95(s，3H)，1.04(s，3H)，1.07(s，6H)，1.1-2.1(m，20H)，2.3-2.6(m，2H)，2.9-3.1(m，1H)，4.15，4.50(ABq，2H，J＝12.6Hz)，5.63(br s，1H)，6.22(d，1H，J＝15.8Hz)，6.70(d，1H，J＝1.5Hz)，6.84(t，1H，J＝1.5Hz)，7.86(d，1H，J＝15.8Hz).
化合物1bRf0.65(乙酸乙酯/乙酸/水;30∶1∶1).
1H NMR(CD3OD)δppm0.85(s，3H)，0.87(s，3H)，0.94(s，3H)，1.03(s，6H)，1.05(s，3H)，1.1-2.0(m，20H)，2.3-2.6(m，2H)，2.8-3.0(m，1H)，4.11，4.49(ABq，2H，J＝12.6Hz)，5.59(br s，1H)，6.36(d，1H，J＝16.0Hz)，6.84(d，1H，J＝15.6Hz)，6.89(dd，1H，J＝8.6，2.6Hz)，7.12(d，1H，J＝2.6Hz)，7.14(d，1H，J＝8.6Hz)，7.20(d，1H，J＝15.6Hz)，7.66(d，1H，J＝16.0Hz).
化合物1c1H NMRδppm(D2O)DSS(Me3SiCH2CH2CH2SO3Na)標(biāo)準(zhǔn)，0.73(s，3H)，0.80(s，3H)，0.87(s，3H)，0.97(s，3H)，1.00(s，6H)，1.1-2.0(m，20H)，2.2-2.6(m，2H)，2.7-3.0(m，1H)，4.05，4.41(ABq，2H，J＝12.4Hz)，5.58(br s，1H)，6.34(d，1H，J＝16.0Hz)，6.87，6.92(ABq，2H，J＝16.0Hz)，7.00(dd，1H，J＝8.6，2.0Hz)，7.19(d，1H，J＝8.6Hz)，7.21(d，1H，J＝2.0Hz)，7.58(d，1H，J＝16.0Hz).
化合物1dRf0.67(乙酸乙酯/乙酸/水;30∶1∶1).
1H NMR(CD3OD)δppm0.85(s，3H)，0.87(s，3H)，0.95(s，3H)，1.03(s，3H)，1.05(s，6H)，1.0-2.0(m，20H)，2.2-2.6(m，2H)，2.8-3.0(m，1H)，4.12(ABq，A部分，J＝12.5Hz，1H)，4.48(ABq，B部分，J＝12.5Hz，1H)，5.62(br s，1H)，6.35(d，J＝15.8Hz，1H)，6.40(d，J＝12.4Hz，1H)，6.49(d，J＝12.4Hz，1H)，6.88(dd，J＝2.8Hz，J＝8.8Hz，1H)，7.11(d，J＝2.8Hz，1H)，7.21(d，J＝8.8Hz，1H)，7.71(d，J＝15.8Hz，1H).
化合物1eRf0.75(乙酸乙酯/乙酸/水;30∶1∶1)1H NMR(CD3OD)δppm0.86(s，3H)，0.89(s，3H)，0.95(s，3H)，1.03(s，3H)，1.06(s，6H)，1.0-2.6(m，24H)，2.6-2.8(m，2H)，2.8-3.0(m，1H)，4.15(ABq，A部分，J＝12.9Hz，1H)，4.50(ABq，B部分，J＝12.9Hz，1H)，5.63(br s，1H)，6.33(d，J＝15.8，1H)，6.85(dd，J＝2.6Hz，J＝8.8Hz，1H)，7.07(d，J＝2.6Hz，1H)，7.12(d，J＝8.8Hz，1H)，7.72(d，J＝15.8Hz，1H).
化合物lqRf0.4(乙酸乙酯/已酸/水;15∶1∶1)1H NMR(CDCl3)δppm0.85(s，6H)，0.93(s，3H)，1.02(s，6H)，1.06(s，3H)，1.1-2.1(m，20H)，2.8-3.1(m，1H)，4.0-4.4(m，2H)，5.60(br s，1H)，6.38(d，1H，J＝16.0Hz)，6.8-7.0(m，1H)，7.11(br s，1H)，7.4-7.5(m，1H)，7.79(d，1H，J＝16.0Hz).
化合物1hRf0.57(乙酸乙酯/乙酸/水;30∶1∶1)1H NMR(CD3OD)δppm0.86(s，3H)，0.89(s，3H)，0.90(s，3H)，0.96(s，3H)，1.03(s，3H)，1.06(s，3H)，1.0-2.1(m，20H)，2.2-2.6(m，2H)，2.9-3.1(m，1H)，3.40(s，2H)，4.14(ABq，A部分，J＝12.0Hz，1H)，4.50(ABq，B部分，J＝12.0Hz，1H)，5.63(br，s，1H)，6.34(d，J＝16.0Hz，1H)，6.86(dd，J＝2.6Hz，J＝8.8Hz，1H)，7.08(d，J＝2.6Hz，1H)，7.21(d，J＝8.8Hz，1H)，7.76(d，J＝10.0Hz，1H).
化合物1iRf0.18(氯仿/甲醇;6∶1)1H NMR(CD3OD)δppm0.86(s，3H)，0.91(s，3H)，0.96(s，3H)，1.03(s，3H)，1.05(s，6H)，1.0-2.1(m，22H)，2.2-2.6(m，6H)，2.9-3.1(m，1H)，4.15(ABq，A部分，J＝12.5Hz，1H)，4.50(ABq，B部分，J＝12.5Hz，1H)，5.63(br s，1H)，6.33(d，J＝15.8Hz，1H)，6.86(dd，J＝2.6Hz，J＝8.8Hz，1H)，7.09(d，J＝2.6Hz，1H)，7.09(d，J＝8.8Hz，1H)，7.70(d，J＝15.8Hz，1H).
化合物1kRf0.29(乙酸乙酯/乙酸/水;8∶1∶1)1H NMR(CD3OD)δppm0.86(s，3H)，0.89(s，3H)，0.95(s，3H)，1.03(s，3H)，1.05(s，3H)，1.07(s，3H)，1.0-2.1(m，20H)，2.3-2.5(m，2H)，2.9-3.1(m，1H)，4.15(ABq，A部分，J＝12.6Hz，1H)，4.46(ABq，B部分，J＝12.6Hz，1H)，5.68(br s，1H)，6.28(d，J＝16.0Hz，1H)，6.81(dd，J＝2.6Hz，J＝8.8Hz，1H)，7.00(d，J＝2.6Hz，1H)，7.40(d，J＝8.8Hz，1H)，8.16(d，J＝16.0Hz，1H).
化合物1nRf0.78(乙酸乙酯/乙酸/水;30∶1∶1)
1H NMR(CD3OD)δppm0.86(s，3H)，0.89(s，3H)，0.95(s，3H)，1.03(s，3H)，1.05(s，3H)，1.07(s，3H)，1.0-2.1(m，20H)，2.2-2.6(m，2H)，2.9-3.1(m，1H)，3.80(s，2H)，4.15(ABq，A部分，J＝13.1Hz，1H)，4.49(ABq，B部分，J＝13.1Hz，1H)，5.67(br s，1H)，6.26(d，J＝15.8Hz，1H)，6.56(d，J＝8.7Hz，1H)，6.78(dd，J＝2.7Hz，J＝8.7Hz，1H)，6.88(d，J＝2.7Hz，1H)，7.89(d，J＝15.8Hz，1H).
利用下述試驗(yàn)實(shí)施例所述方法評估本發(fā)明化合物(Ⅰ)的內(nèi)皮素受體拮抗效應(yīng)。使用公開于WO/92/12991(實(shí)施例1)中的化合物(50-235)作為對照物。
試驗(yàn)1對125Ⅰ-內(nèi)皮素-1與其受體結(jié)合的抑制效應(yīng)在有或無本發(fā)明化合物(Ⅰ)存在下將取自大鼠主動(dòng)脈的平滑機(jī)A7r5細(xì)胞在37℃用25PM125Ⅰ-內(nèi)皮素-1培養(yǎng)1小時(shí)。待反應(yīng)完成之后，通過玻璃纖維濾器過濾分離膜部分結(jié)合的125Ⅰ-內(nèi)皮素-1并用伽馬計(jì)數(shù)器測定其放射性。通過從總結(jié)合中減去在10-7M非放射性內(nèi)皮素-1存在下所測的非特異性結(jié)合計(jì)算特異性結(jié)合。到抑制50%內(nèi)皮素-1與其受體特異性結(jié)合所需要的化合物(Ⅰ)的濃度(nM)(即IC50)列于下表1中。
試驗(yàn)2抑制內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子濃度增大向小杯內(nèi)放入已載有2μMfura-2(Dojin)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌A7r5細(xì)胞懸浮液(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)。利用鈣分析儀(CAF100，Nippon Bunhkou Co.)測定熒光強(qiáng)度的變化。在測定中于340nm和380nm進(jìn)行激發(fā)并于510nm處記錄。按照Grynkiewicz等在J.Biol.chem.，260，pp.3440-3450，1985中所述方法計(jì)算細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子濃度。
該試驗(yàn)通過下述步驟進(jìn)行向小杯內(nèi)的細(xì)胞懸浮液中加入本發(fā)明化合物(Ⅰ)，培養(yǎng)1分鐘，加入10-8M內(nèi)皮素-1，測量熒光強(qiáng)度的變化。達(dá)到抑制50%內(nèi)皮素-1-誘導(dǎo)的細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子濃度的增大所需化合物(Ⅰ)的濃度(nM)(即IC50)見下表1所示。

試驗(yàn)3在分離的大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)抑制內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的收縮在37℃同時(shí)通入混合氣體(95%0+5%CO)下將分離自大鼠胸主動(dòng)脈的模Stip樣品懸浮于改性的Locke-Ringer溶液內(nèi)，并記錄等長張力。本試驗(yàn)中使用取自每個(gè)大鼠的四塊樣品。這樣在測量等長張力之前將三塊樣品用不同濃度的化合物1C(二鈉鹽;實(shí)施實(shí)施例1或3中所制)(10-8M，3×10-8M，和10-7M)處理10分鐘并將所余的一塊樣品不進(jìn)行處理。測量后，畫出內(nèi)皮素-1濃度-收縮曲線，該曲線表明化合物1C能將濃度-收縮曲線整理成濃度-依賴方式，且PA2值為8.8。
試驗(yàn)4在被刺毀腦脊髓大鼠內(nèi)抑制內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的高血壓在乙醚麻醉下將不銹鋼桿(直徑2mm)從右眼眶插入到大鼠的脊柱尾端。將所產(chǎn)生的被刺毀腦脊髓的大鼠置于人工呼吸狀態(tài)并記錄血壓變化。靜脈給藥(內(nèi)皮素-1和實(shí)施例1或3中所制化合物1c)?；衔?c在劑量為0.01和1mg/kg之間能夠以劑量依賴方式降低血壓。
如上所述，本發(fā)明化合物(Ⅰ)能與內(nèi)皮素競爭其受體并因而能特異性地抑制內(nèi)皮素的生物活性。因此，本發(fā)明化合物(Ⅰ)能用于預(yù)防和治療由內(nèi)皮素過量分泌所造成的疾病如高血壓，心肌缺血，腦病，腎病，各種的器官的循環(huán)衰竭，以及哮喘。
權(quán)利要求
1.式(Ⅰ)化合物其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中R1代表氫或可代謝的酯殘基；R2代表氫或-R3R4，其中R3代表-SO3，-CH2COO-，-COCOO-，或-COR5COO-(R5代表低級亞烷基或低級亞鏈烯基)，以及R4代表氫，低級烷基或可代謝的酯殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1代表氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1代表氫且R2代表-COCH＝CHCO2H。
4.一種藥物組合物，包括作為活性成分的權(quán)利要求1中所述的化合物(Ⅰ)以及其藥學(xué)上可接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中R1代表氫。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中R1代表氫且R2代表-COCH＝CHCO2H。
7.一種預(yù)防或治療由內(nèi)皮素造成的疾病的方法，包括給受治療者給用權(quán)利要求1中所述的化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中R1代表氫。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中R1代表氫且R2代表-COCH＝CHCO2H。
全文摘要
本發(fā)明提供了式(I)三萜衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽其中R
文檔編號A61P9/12GK1106368SQ9410280
公開日1995年8月9日 申請日期1994年6月10日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月11日
發(fā)明者鴻池敏郎, 荒木美貴, 林哲良, 櫻井謙介, 東條武彥 申請人:鹽野義制藥株式會(huì)社