專(zhuān)利名稱(chēng)：鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎(duckviral hepatitis, DVH) 是由鴨肝炎病毒(duck hepatitisvirus, DHV)引起雛鴨的一種以肝臟為主要病理變化的急性、高度致死性、接觸性傳染病。臨床表現(xiàn)痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀，以肝臟腫脹和出血為特征性病變。I 3周齡的雛鴨易感，發(fā)病嚴(yán)重，傳播迅速，雛鴨通常出現(xiàn)癥狀后的I小時(shí)內(nèi)死亡，10日齡雛鴨感染后死亡率90% 95%，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。鴨肝炎病毒(DHV)血清型DHV有4個(gè)獨(dú)立的血清型，I型、2型、3型和新型。范書(shū)才等(范書(shū)才，李虹，袁率珍等.新型鴨肝炎病毒的分離鑒定.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，10)通過(guò)試驗(yàn)證明目前在我國(guó)同時(shí)存在I型和新型DHV流行。血清中和試驗(yàn)表明，I型和新型之間缺乏交叉保護(hù)作用。在4個(gè)型的DHV中，I型與新型DHV流行最廣泛，毒力最強(qiáng)；對(duì)3周齡內(nèi)的雛鴨致死率可在80%以上。2型DHV僅在英國(guó)，3型僅在美國(guó)有報(bào)道；二者均呈散發(fā)性流行，致死率低(約20%)。對(duì)于鴨病毒性肝炎的預(yù)防和治療，目前除了加強(qiáng)消毒和疫苗免疫，為此我們進(jìn)行了鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗二價(jià)滅活疫苗的研制工作。研制結(jié)果表明，我們研制的二價(jià)滅活疫苗二價(jià)滅活疫苗效價(jià)高，安全性好，保護(hù)率高，為預(yù)防鴨病毒性肝炎病奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備I型和新型鴨病毒性肝炎的兩種抗原，并進(jìn)行合理配制成I型和新型鴨肝炎病毒油乳劑滅活疫苗，用此疫苗動(dòng)物，可同時(shí)預(yù)防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎，此疫苗具有效價(jià)高、保護(hù)率高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所涉及的二價(jià)滅活疫苗含有鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株的滅活病毒，可同時(shí)預(yù)防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎。制備該二價(jià)滅活疫苗采用的技術(shù)手段選育的新毒株要經(jīng)過(guò)血清學(xué)、分子生物學(xué)等試驗(yàn)進(jìn)行大量的臨床病料分析鑒定工作，最后選出效價(jià)高、免疫原性好制苗用毒株——鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株。制備鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的主要步驟為用鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株作為疫苗生產(chǎn)毒株，分別接種雞胚和鴨胚，經(jīng)孵化、收獲死亡胚胚體和胚液、研磨、凍融后收取病毒液，再經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活制成YBHl株滅活病毒液和YBHX株滅活病毒液，將其混合后加油佐劑經(jīng)乳化制成鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗。本發(fā)明詳細(xì)描述一、生產(chǎn)用毒株
制苗免疫原用鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus) I型YBHl株和新型YBHX株，均由青島易邦生物公程有限公司分離、鑒定、保管和供應(yīng)。國(guó)內(nèi)分離株I型YBHl株和新型YBHX株(兩型毒株均是2008年從山東省某鴨場(chǎng)病死鴨的肝臟中分離)。以上2個(gè)毒株已于2012年08月15日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442。二、疫苗(免疫原)的制備I.制苗用病毒液的制備 (I)YBHl株毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHl株作100倍稀釋?zhuān)蚰仪唤臃N10日齡SPF雞胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚檢查。接種后48 120小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，置2 8°C放置4 12小時(shí)后，收取尿囊液、羊水及胚體，胚體去掉頭和四肢。用胚液勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無(wú)菌容器中，置2 8°C保存。(2)YBHX株毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHX株100倍稀釋?zhuān)蚰仪唤臃N12 13日齡易感鴨胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚檢查。接種后48 120小時(shí)內(nèi)死亡的鴨胚，置2 8°C 4 12小時(shí)，收取尿囊液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無(wú)菌容器中，置2 8°C保存。2.濃縮將收獲的YBHl株和YBHX株病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)分別濃縮至原體積的1/3，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中國(guó)人民共和國(guó)獸藥典二〇一〇年版三部.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明以下簡(jiǎn)稱(chēng)“現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》”)規(guī)定進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。每O. 2ml病毒含量均應(yīng)不低于IO6 3ELD5tlt5濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。3.滅活分別將濃縮后的YBHl株與YBHX株病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%(體積比)甲醛溶液，開(kāi)啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為O. 2%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開(kāi)始計(jì)時(shí))后取出，置2 8°C保存，應(yīng)不超過(guò)3個(gè)月。4.鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗半成品檢驗(yàn)(I)無(wú)菌檢驗(yàn)取滅活的濃縮胚液，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。(2)病毒含量測(cè)定I)濃縮后YBH株病毒含量測(cè)定將濃縮后的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋?zhuān)?0_4、10_5、10_6、10_7 4個(gè)稀釋度，分別尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚O. 2ml。同時(shí)設(shè)接種生理鹽水對(duì)照5枚，每胚O. 2ml。置36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時(shí)。以雞胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，計(jì)算 ELD50。2)濃縮后YBHX株病毒含量測(cè)定將濃縮后的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋?zhuān)?0_4、10_5、10_6、10_7 4個(gè)稀釋度，分別尿囊腔接種12 13日齡易感鴨胚5枚，每胚O. 2ml。同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照，每胚O. 2ml。置36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時(shí)。以鴨胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，計(jì)算 ELD50。(3)滅活檢驗(yàn)分別將YBHl株和YBHX株滅活后的病毒液尿囊腔接種10日齡SPF雞胚和12 13日齡易感鴨胚各10枚，每胚O. 2ml，置36 37°C繼續(xù)孵育，連續(xù)觀察168小時(shí)。5.滅活疫苗的制備經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)合格后的半成品抗原進(jìn)行疫苗制備(以下配制中各液體成分按體積比計(jì))。油相制備取獸用白油94份，硬脂酸鋁2份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再加司本一 80 6份，至溫度達(dá)到115°C時(shí)，維持30min，冷卻后備用。水相制備將滅活檢驗(yàn)合格的YBHl株和YBHX株病毒液適當(dāng)比例混合，使每O. 2ml水相中含YBHl株和YBHX株病毒含量均不低于106_ 1ELD500取滅菌后的吐溫_80 4份，加入配液罐中，同時(shí)加混合抗原液96份，開(kāi)動(dòng)攪拌電機(jī)攪拌20 30min，使吐溫-80完全溶解。乳化取油相3份放于高速剪切機(jī)內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份，以10000r/min,乳化5分鐘。乳化后,取IOml,以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相彡O. 5ml。三、疫苗成品檢驗(yàn)I.性狀(I)外觀疫苗應(yīng)為乳白色乳劑，無(wú)雜質(zhì)并且外包裝應(yīng)合格。(2)劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。(3)穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000rpm離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不超過(guò)O. 5ml。(4)黏度按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。2.裝量檢查按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。
3.無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。4.安全檢驗(yàn)用21 35日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗2. 0ml，同時(shí)設(shè)對(duì)照5只，在相同的條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14日，記錄試驗(yàn)雞采食、飲水及臨床情況。應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。5.效力檢驗(yàn)用21 35日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗，O. 5ml/只，另取5只同日齡雞不免疫作對(duì)照，免后21日，采血分離血清，分別測(cè)定鴨肝炎I型和新型中和抗體效價(jià)。免疫組抗體效價(jià)，應(yīng)均不低于1:64，對(duì)照組應(yīng)均為陰性。本發(fā)明所涉及微生物本發(fā)明涉及鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus)YBHl株和YBHX株，以上2個(gè)毒株已于2012年08月15日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)=YBHl株為CGMCC No. 6441，YBHX 株為 CGMCC No. 6442。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明從優(yōu)勢(shì)流行菌株中篩選出免疫原性良好的鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株疫苗制備菌株，分別接種雞胚和鴨胚，分別收獲死亡胚胚體和胚液，經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。此疫苗能同時(shí)預(yù)防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎，具有高效、安全性好、保護(hù)率高等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I(一)疫苗(免疫原)制備I制苗用病毒液的制備YBHl株病毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHl株作100倍稀釋?zhuān)蚰仪唤臃N10日齡SPF雞胚100枚，每胚O. 2ml, 36 37°C孵育,每日2次照胚檢查。接種后48 120小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，置2 8°C放置4 12小時(shí)后，收取尿囊液、羊水及胚體，胚體去掉頭和四肢。用胚液勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無(wú)菌容器中，置2 8°C保存。(參見(jiàn)表I)。·
YBHX株病毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHX株100倍稀釋?zhuān)蚰仪唤臃N12 13日齡易感鴨胚100枚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚檢查。接種后48 120小時(shí)內(nèi)死亡的鴨胚，置2 8°C 4 12小時(shí)，收取尿囊液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無(wú)菌容器中，置2 8°C保存。(參見(jiàn)表I)。表I毒液的制備
權(quán)利要求
1.一種鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，其特征在于該滅活疫苗含有鴨病毒性肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株的滅活病毒，可同時(shí)預(yù)防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎。
2.權(quán)利要求I所述鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的制備方法，其特征在于 (1)鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株已于2012年08月15日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442 ； (2)用鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株作為疫苗生產(chǎn)毒株，分別接種雞胚和鴨胚，經(jīng)孵化、收獲死亡胚胚體和胚液、研磨、凍融后收取病毒液，再經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活制成YBHl株滅活病毒液和YBHX株滅活病毒液，將其混合后加油佐劑經(jīng)乳化制成鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎二價(jià)疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明從優(yōu)勢(shì)流行菌株中篩選出免疫原性良好的鴨病毒性肝炎1型YBH1株和新型YBHX株疫苗制備菌株，分別接種雞胚和鴨胚，分別收獲死亡胚胚體和胚液，經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。此疫苗免疫動(dòng)物能同時(shí)預(yù)防由1型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎，具有高效、安全性好、保護(hù)率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102908618SQ20121033756
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者徐保娟, 宮曉, 郭偉偉, 王龍, 孫健, 胡瀟 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司