專利名稱：siRNA綴合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種綴合物、制備該綴合物的方法以及利用該綴合物傳遞SiRNA的方法，其中，在癌癥和其它傳染性疾病的基因療法中用于促進(jìn)siRNA傳遞的聚合物通過(guò)可降解鍵(degradable bond)或不可降解鍵綴合到siRNA。
背景技術(shù)：
RNA干擾是指這樣一種機(jī)制，其為在基因表達(dá)過(guò)程中，雙鏈RNA(dsRNA)通過(guò)核苷酸序列特異性方式啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄后沉默，并且這種機(jī)制首先在線蟲(C.elegans)中被發(fā)現(xiàn)，并常見(jiàn)于植物、果蜆和脊椎動(dòng)物(Fire等，自然(Nature), 391:806-811, 1998 ； ；Novina&Sharp,自然(Nature) ,430:161-164，2004)。已知以如下方式發(fā)生RNA干擾進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的19 25bp的dsRNA與RISC(RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)結(jié)合，且僅反義(向?qū)?鏈與mRNA結(jié)合而與mRNA的核苷酸序列互補(bǔ)，從而通過(guò)存在于RISC的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域降解IE mRNA(Rana, T. M. , Nat. Rev. Mo I. Cell Biol. , 8:23-36, 2007 ；Tomari, Y.和 Zamore, P.D., Genes Dev. , 19:517-529，2005)。當(dāng)dsRNA被傳遞到細(xì)胞中，它特異性地結(jié)合靶基因序列以降解mRNA，因此，它被認(rèn)為是一種可調(diào)控基因表達(dá)的新型工具。然而，對(duì)于人類來(lái)說(shuō)，由于向人體細(xì)胞引入dsRNA會(huì)誘導(dǎo)抗病毒干擾素途徑，因此難以獲得RNAi效果。在2001年，Elbashir和Tuschl等發(fā)現(xiàn)向人體細(xì)胞導(dǎo)入21nt長(zhǎng)度(核苷酸長(zhǎng)度)的小dsRNA不會(huì)引起干擾素途徑，但特異性地降解革巴 mRNA (Elbashir, S. M. , Harborth, J.，Lendeckel, ff. , Yalcin, A. , Weber, K. , Tuschl,Τ·，自然(Nature)，411，494-498，2001 ； ；Elbashir, S. Μ.，Lendeckel, ff.，Tuschl, T.，基因(Genes) &Dev. , 15, 188-200，2001 ； ；Elbashir, S. M. , Martinez, J. , Patkaniowska, A. , Lendeckel, ff.，Tuschl, T.，EMBO J.，20，6877-6888，2001)。因此，21nt 長(zhǎng)度的 dsRNA 已經(jīng)作為一種新型的功能基因組工具引起了公眾的注意，并命名為小干擾RNA(siRNA)。自從siRNA被報(bào)道在動(dòng)物細(xì)胞中抑制特定基因表達(dá)上具有極好的效果，siRNA作為一種基因治療的藥物引起了廣泛關(guān)注。實(shí)際上，由于它的高活性和精確的基因選擇性，根據(jù)20年的研究結(jié)果，siRNA有望成為一種目前用作治療藥物的反義寡核苷酸(ODN)的替代治療藥物(Dana J. Gary等，控釋雜志(Journal of ControlledRelease) 121:64-73，2007)。用于治療的siRNA技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢(shì)，與其它藥物相比，它易于設(shè)計(jì)并具有高目標(biāo)選擇性和抑制特定基因表達(dá)的性能。此外，由于RNA干擾利用生命系統(tǒng)中天然存在的機(jī)制抑制基因表達(dá)，所以它毒性較低。目前0ΡΚ0 Inc.開(kāi)發(fā)的濕性老年黃斑變性病的治療藥物“貝伐西尼(Bevasiranib) ”為一種siRNA，其可選擇性地作用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，誘導(dǎo)新血管形成以抑制VEGF的表達(dá)，并通過(guò)了三期臨床試驗(yàn)(Dejneka NS等，Mol Vis.，28 (14) : 997-1005，2008)。此外，目前正在研發(fā)含有革巴向多種基因的 siRNA 的治療藥物(Ryan P. Million, Nature Reviews Drug Discovery7:115-116，2008)。盡管各種結(jié)果表明體內(nèi)通過(guò)RNA干擾誘導(dǎo)特異性的表達(dá)抑制，但siRNA在體內(nèi)的傳遞還有許多問(wèn)題需要解決，如在血液中被酶降解、與血液中組分的相互作用以及非特異性地傳遞給細(xì)胞(Shigeru Kawakami 和 Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22
(3): 142-151，2007)。正在通過(guò)部分地利用抗核酸酶的核苷酸類似物或改良傳遞技術(shù)，嘗試克服這些問(wèn)題。改良的傳遞技術(shù)的實(shí)例包括利用病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等的基因傳遞技術(shù)，以及利用脂質(zhì)體、陽(yáng)離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子聚合物的非病毒載體的基因傳遞技術(shù)。然而，由于傳遞的基因有可能整合到宿主的染色體中，從而誘導(dǎo)宿主基因的正常功能發(fā)生異常并激活致癌基因，因此病毒載體存在安全性方面的問(wèn)題，此外，即使以較小的量連續(xù)表達(dá)病毒基因也可能引起自身免疫性疾病，或在由病毒載體誘導(dǎo)的修飾的病毒感染情況下，可能不會(huì)引起有效的保護(hù)性免疫。同時(shí)，非病毒載體的有效性低于病毒載體，但考慮到體內(nèi)安全性和經(jīng)濟(jì)可行性，其具有副作用低和生產(chǎn)成本低的優(yōu)勢(shì)(Lehrman S.，自然(Nature). 401 (6753) : 517-518，1999)。此外，非病毒傳遞方法要求有效地保護(hù)酶或非酶的降解，以便傳遞包括siRNA的RNA分子，其中一種方法為利用編碼短發(fā)夾RNA (shRNA)的DNA表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)DNA的系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于，僅當(dāng)表達(dá)載體存在時(shí)進(jìn)行siRNA表達(dá)。此外，目前siRNA化學(xué)修飾的研究提出一種用于改良針對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性以及低胞內(nèi)攝取的方法(Shigery Kawakami和MitsuruHashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3):142-151，2007)。
在一種siRNA的化學(xué)修飾中，作為被核酸酶降解部位的磷酸二酯鍵用硫代磷酸連接進(jìn)行修飾，或戊糖的2’位被2’ -0-meRNA、2’ -脫氧-2’ -氟尿嘧啶核苷或通過(guò)2’位和4’位連接形成的鎖核酸(LNA)修飾,結(jié)果提高了血清中的穩(wěn)定性((Braasch D. A.等,Bioorg.Med. Chem. Lett. 14:1139-1143，2003 ； ；Chiu Y. L.和 Rana T. Μ.，RNA, 9:1034-1048，2003 ；；Amarzguioui Μ.等,Nucleic Acid Res. 31:589-595，2003)。在另一種化學(xué)修飾中，官能團(tuán)連接到正義(反向?qū)?鏈的3’端區(qū)域，結(jié)果與對(duì)照相比，藥動(dòng)力學(xué)特性得到了改良，體內(nèi)通過(guò)siRNA的親水性和疏水性的平衡在施用時(shí)誘導(dǎo)出較高的效率(Soutschek J.等，Nature432:173-1782004)。然而，上述方法在保護(hù)SiRNA免于核酸酶的消化以及改良細(xì)胞膜透性效率上仍然有許多有待改進(jìn)之處?；谶@一原因，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種綴合物，其中親水性或疏水性聚合物通過(guò)可降解或不可降解鍵綴合到SiRNA，改良了 siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性，并基于此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種綴合物，其中作為生物相容性聚合物的親水性或疏水性聚合物通過(guò)可降解或不可降解鍵綴合到siRNA的正義鏈或反義鏈的末端，以提高siRNA在細(xì)胞內(nèi)傳遞的效率。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種含有聚合物的固相支持物，具體地，施用到人體時(shí)穩(wěn)定性得到證實(shí)的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以及提供一種有效地制備包括RNA、DNA,RNA-DNA嵌合體及其類似物的寡核苷酸的方法，其中，通過(guò)支持物將PEG結(jié)合到它的3’端。本發(fā)明又一目的在于提供制備siRNA綴合物的方法，以及利用siRNA綴合物傳遞siRNA的方法。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述的目的，首先，本發(fā)明提供一種siRNA-聚合物綴合物，其結(jié)構(gòu)如下A-X-R-Y-B(其中，A和B獨(dú)立地為親水性聚合物或疏水性聚合物；X和Y獨(dú)立地為簡(jiǎn)單的共價(jià)鍵或接頭介導(dǎo)的(linker-mediated)共價(jià)鍵；且R為siRNA)。其次，本發(fā)明提供一種siRNA-聚合物綴合物，其結(jié)構(gòu)如下A-X-R(其中，A為疏水性聚合物；X為簡(jiǎn)單的共價(jià)鍵或接頭介導(dǎo)的共價(jià)鍵；R為siRNA)第三，本發(fā)明提供一種綴合物，其中SiRNA(R)的單鏈含有19 31個(gè)核苷酸。第四，本發(fā)明提供一種綴合物，其中疏水性聚合物(A)的分子量為25(Tl，000。第五，本發(fā)明提供一種綴合物，其中疏水性聚合物㈧為ClfTC5tl烴或膽固醇。第六，本發(fā)明提供一種綴合物，其中共價(jià)鍵(Χ，Υ)為不可降解鍵或可降解鍵。第七，本發(fā)明提供一種綴合物，其中不可降解鍵為酰胺鍵或磷酸鍵。第八，本發(fā)明提供一種綴合物，其中可降解鍵選自二硫鍵、酸裂解鍵、酯鍵、酸酐鍵、生物降解鍵和酶裂解鍵。第九，本發(fā)明提供一種綴合物，其中親水性聚合物(Α或B)為分子量為1，000^10, 000的非離子聚合物。第十，本發(fā)明提供一種綴合物，其中親水性聚合物選自下組聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。第十一，本發(fā)明提供一種結(jié)合聚乙二醇的固相支持物，其結(jié)構(gòu)如下
權(quán)利要求
1.存活素特異性SiRNA和聚合物的綴合物，其結(jié)構(gòu)如下A-X-R-Y-B 其中，A和B之一為親水性聚合物且其另一為疏水性聚合物；X和Y各自獨(dú)立地為簡(jiǎn)單的共價(jià)鍵或接頭介導(dǎo)的共價(jià)鍵；且R為存活素特異性siRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述存活素特異性siRNA(R)的單鏈由19-31個(gè)核苷酸組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述存活素特異性siRNA(R)的單鏈為核苷酸序列 SEQ ID No. Γ4 之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述存活素特異性SiRNA(R)具有化學(xué)修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的綴合物，其中所述化學(xué)修飾包括至少下述之一 將磷酸二酯鍵修飾為硫代磷酸酯連接； 將戊糖2’ -位上的-OH修飾為2’ -OCH3或2’ -脫氧-2’氟尿嘧啶核苷；和 通過(guò)連接戊糖的2’ -位和4’ -位而將戊糖2’ -位上的-OH修飾為鎖核酸型式。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述疏水性聚合物的分子量為25(Tl，000;所述親水性聚合物為分子量為1，00(Γ10，000的非離子聚合物；且所述共價(jià)鍵為不可降解鍵或可降解鍵。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述疏水性聚合物為ClfTC5tl飽和烴或膽固醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述不可降解鍵為酰胺鍵或磷酸鍵；且所述可降解鍵選自二硫鍵、酸裂解鍵、酯鍵、酸酐鍵、生物降解鍵和酶裂解鍵。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述親水性聚合物包括至少下述之一聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。
10.一種納米微粒，其包含權(quán)利要求I所述的綴合物。
11.一種組合物，其包含權(quán)利要求I所述的綴合物作為藥物有效成分。
12.—種組合物，其包含權(quán)利要求10所述的納米微粒作為藥物有效成分。
全文摘要
本發(fā)明提供一種siRNA-聚合物綴合物及其制備方法，更具體地，涉及一種通過(guò)siRNA和用于提高siRNA生物穩(wěn)定性的聚合物的共價(jià)結(jié)合而形成的雜合綴合物，以及制備該雜合綴合物的方法。本發(fā)明的綴合物能提高siRNA的生物穩(wěn)定性，從而實(shí)現(xiàn)治療性siRNA向細(xì)胞的有效傳遞，且即使相對(duì)低濃度的小劑量也具有siRNA的活性。因此，該綴合物不僅可有利地用作癌癥和其它傳染性疾病的siRNA治療工具，也可用作一種新型的siRNA傳遞系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102888404SQ20121030155
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者韓寶藍(lán), 樸翰浯, 申美湜, 李三用 申請(qǐng)人:株式會(huì)社百奧尼