專利名稱：缺失調(diào)亡抑制基因病毒的構(gòu)建及在腫瘤基因治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種缺失凋亡抑制基因病毒的構(gòu)建以及所構(gòu)建的重組病毒用于腫瘤的基因治療，屬于分子病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，也屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的嚴(yán)重疾病。腫瘤的發(fā)生與防治研究過去是、現(xiàn)在是、并在未來一定時期內(nèi)仍將是生命科學(xué)研究的熱點。世界衛(wèi)生組織(WHO)1997年5月3日在日內(nèi)瓦發(fā)布世界健康狀況報告，預(yù)測未來的25年間，世界大部分國家患腫瘤的病人數(shù)量可能大大增加。從現(xiàn)在到2005年，歐盟國家內(nèi)，婦女肺癌患者將增加33％，男性前列腺癌患者將增加40％，全世界，特別是發(fā)展中國家，患其它種類腫瘤的人數(shù)也將迅速增加。各種腫瘤每年導(dǎo)致630萬人死亡。
在中國，腫瘤現(xiàn)在已成為僅次于心腦血管病的第二大致死病因，腫瘤嚴(yán)重威脅著人們的健康。研究腫瘤，治療腫瘤，刻不容緩。
現(xiàn)在對腫瘤的治療首選手術(shù)切除，配合放、化療。放、化療都有諸如骨髓抑制(白、紅細(xì)胞、血小板減少)、肝腎損害等嚴(yán)重副作用。中草藥治療癌癥尚處于摸索階段，機制不清楚，療效不穩(wěn)定，對提高機體免疫力有一定的幫助，但想選擇性殺死瘤困難重重。許多病毒內(nèi)既存在凋亡基因，又存在凋亡抑制基因，呈相對平衡狀態(tài)，正是由于凋亡基因等的存在，病毒才導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、機體受損。但凋亡抑制基因也是病毒復(fù)制所需要的，病毒這一絕對的細(xì)胞內(nèi)寄生物，沒有細(xì)胞則不能完成復(fù)制，就沒有子代病毒釋放出來去感染周圍的細(xì)胞。從整體上來看，缺失凋亡抑制基因的病毒在正常細(xì)胞中不能復(fù)制，不會對機體造成嚴(yán)重危害，而腫瘤細(xì)胞呈無限增殖狀態(tài)或“凋亡抑制”狀態(tài)，它能支持缺失凋亡抑制基因的病毒的復(fù)制，因此這種病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)能選擇性增殖，進而裂解殺死腫瘤細(xì)胞。
已發(fā)現(xiàn)的病毒凋亡抑制基因有腺病毒(Adenovirs)的Elb、單純皰疹病毒(HSV)的γ134.5、巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE1、IE2、人乳頭瘤病毒(HPV)E6等基因，從理論上講缺失這些基因的病毒都可望用于腫瘤的生物治療。
1996年10月Science周刊報導(dǎo)了美國ONYX制藥公司用缺失凋亡抑制基因ElB55K的腺病毒突變體治療腫瘤的工作。缺失病毒在正常細(xì)胞中不復(fù)制，但能在癌細(xì)胞中復(fù)制并最終裂解殺滅癌細(xì)胞。將缺失病毒注入荷人宮頸癌的裸鼠瘤體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)所有腫瘤尺寸均顯著減小，60％的實驗?zāi)[瘤完全消退，[Bischoff J.R.,1997,Science,274:373]。1997年11月，Science又報導(dǎo)了一期臨床試驗結(jié)果32例受試頭頸癌患者中，12例腫瘤尺寸明顯減小，減小幅度可達(dá)90％，未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用。[Barinaga M.1997,Science,278:1037]。但他們沒有在EIB55K缺失腺病毒中插入治癌效應(yīng)基因，沒有對腺病毒進行改造使其成為通用的基因治療載體。國內(nèi)尚未見到開展此類工作的報導(dǎo)。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種安全、穩(wěn)定、有高度靶向性和選擇性的、能在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并最終可以裂解殺傷腫瘤細(xì)胞的缺失凋亡抑制基因的重組病毒。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明以腺病毒(AdV)或單純皰疹病毒(HSV)為材料，經(jīng)過PCR技術(shù)擴增基因片段，插入質(zhì)粒DNA中，進一步用P53、TNF、Barnase、Reaper等效應(yīng)基因和GFP、LacZ、Neor等標(biāo)記基因，構(gòu)建出轉(zhuǎn)移載體，缺失或插入失活與復(fù)制有關(guān)的凋亡抑制基因，并與相應(yīng)的野生型病毒共轉(zhuǎn)染，篩選重組病毒，即可分別得到Elb55K基因缺失的重組腺病毒或γ134.5基因失活的重組單純皰疹病毒。具體構(gòu)建過程如下一.Elb55K基因缺失的重組腺病毒的構(gòu)建1．從腺病毒DNA中PCR擴增E1區(qū)片段，插入質(zhì)粒DNA中，得到腺病毒E1區(qū)克隆載體；2．在腺病毒E1區(qū)克隆載體中進一步用P53、TNF、Barnase、Reaper等效應(yīng)基因和GFP、LacZ、Neor等標(biāo)記基因，缺失Elb55K基因，并與野生型腺病毒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，篩選Elb55基因缺失的重組腺病毒。
二．γ134.5基因失活的重組單純皰疹病毒的構(gòu)建1．從HSV DNA中PCR擴增γ134.5基因片段，插入質(zhì)粒DNA中，得到HSVγ134.5基因克隆載體；2．在HSVγ134.5基因克隆載體中進一步用P53、TNF、Barnase、Reaper等效應(yīng)基因和GFP、LacZ、Neor等標(biāo)記基因，缺失或失活γ134.5基因，并與野生型HSV共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，篩選出γ134.5基因失活的重組病毒。
通過上述構(gòu)建所得的重組病毒可用于多種腫瘤的基因治療，裂解殺滅腫瘤細(xì)胞，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞及其它p53-腫瘤細(xì)胞等。
與已有技術(shù)相比較，采用本發(fā)明的技術(shù)措施所取得有益效果本發(fā)明首次提出了缺失或失活的基因重組病毒作為腫瘤的基因治療載體，所構(gòu)建的Elb55K基因缺失的重組腺病毒和γ134.5基因失活的重組單純皰疹病毒是基于病毒凋亡與復(fù)制、凋亡與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，這種重組病毒能選擇性地感染腫瘤細(xì)胞而在正常細(xì)胞中僅能發(fā)生流產(chǎn)感染，即可選擇性地殺滅癌細(xì)胞而不殺死正常細(xì)胞，而且安全、穩(wěn)定；這一方案開辟了一條構(gòu)建AdV和HSV新型基因治療載體和進行癌癥基因治療的新途徑，因此，本發(fā)明的技術(shù)不僅在學(xué)術(shù)上有重要的學(xué)術(shù)價值，而且還具有重要的社會和經(jīng)濟效益。
本發(fā)明在構(gòu)建中插入了治癌效應(yīng)基因和標(biāo)記基因，從而大大增強了其治療效應(yīng)，簡化了生產(chǎn)的篩選和監(jiān)控過程，因此，本發(fā)明的構(gòu)建方法還具有簡單、快速、無毒、直觀等特點。
下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)措施作進一步的說明。
實施例1缺失γ134.5基因帶LacZ標(biāo)記的重組單純皰疹病毒(HSV)的構(gòu)建1．用PCR技術(shù)從單純皰疹病毒中擴增出γ134.5基因，插入質(zhì)粒pGEM-32f的BamHⅠ位點，命名為pG34.5；2．用NotⅠ酶消化pG34.5，切去γ134.5基因中的700bp片段，回收剩余的大片段備用；3．用EcoRⅠ、BamHⅠ消化pSV-LacZ，回收LacZ表達(dá)盒，插入質(zhì)粒pFast的EcoRⅠ、BamHⅠ位點，使LaeZ表達(dá)盒的上游帶NotⅠ位點，新質(zhì)粒命名為pFL。用XhoⅠ、BamHⅠ消化pFL，回收Xkol/BamHⅠ片段，插入質(zhì)粒pBluescript的XhoⅠ、BamHⅠ位點，新質(zhì)粒命名為pBL。pBL中的LacZ表達(dá)盒上、下游均帶NotⅠ位點。用NotⅠ消化pBL，回收上、下游均帶NotⅠ的LacZ表達(dá)盒；4．用T4 DNA連接酶，將2所得剩余大片段與3所得上、下游均帶NotⅠ的LacZ表達(dá)盒連接起來，新質(zhì)粒命名為pG34.5-LacZ+，此質(zhì)粒帶LacZ報導(dǎo)基因及HSVγ134.5基因的左翼、右翼序列，但去掉了HSVγ134.5基因中的700bp片段；5．pG34.5-LacZ+與野生型HSV共轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，發(fā)生同源重組后，篩選帶LacZ報導(dǎo)基因，在X-GaL存在時呈藍(lán)色的重組病毒，即為缺失γ134.5基因帶LacZ標(biāo)記的重組單純皰疹病毒。
實施例2Elb55K基因失活的重組腺病毒的構(gòu)建1．采用PCR技術(shù)從腺病毒DNA中擴增出E2片段，插入質(zhì)粒pUC19的XhoⅠ位點，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體，命名為pUEl；2．用EcoRⅠ,SalⅠ消化質(zhì)粒pSV-LacZ，回收LacZ表達(dá)盒，插入質(zhì)粒pBluescript的SalⅠ,EcoRⅠ位點，新質(zhì)粒命名為pBlueLacZ；3．采用BamHⅠ位點消化pBlueLacZ，回收LacZ表達(dá)盒BamHⅠ大片段，插入pUCEl的Elb55K基因內(nèi)BglⅡ位點，構(gòu)建成Elb55K基因失活的轉(zhuǎn)移載體pElSULacZ；4．采用轉(zhuǎn)移載體pElSULacZ與E3區(qū)缺失的腺病毒pBHGll共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，發(fā)生同源重組，篩選帶LacZ報導(dǎo)基因，在X-Gal存在時呈藍(lán)色的重組病毒，即為Elb55K基因失活的重組腺病毒。
權(quán)利要求
1．一種缺失凋亡抑制基因病毒的構(gòu)建，其特征在于它是以腺病毒或單純皰疹病毒為材料，經(jīng)過PCR技術(shù)擴增基因片段，插入質(zhì)粒DNA中，進一步用標(biāo)記基因和效應(yīng)基因，構(gòu)建出轉(zhuǎn)移載體，缺失或插入失活與復(fù)制有關(guān)的凋亡抑制基因，并與相應(yīng)的野生型病毒共轉(zhuǎn)染，篩選重組病毒，即可分別得到Elb55K基因缺失的重組腺病毒和γ134.5基因失活的重組單純皰疹病毒。
2．按權(quán)利權(quán)求1所述的缺失凋亡抑制基因病毒的構(gòu)建，其特征在于所述的標(biāo)記基因為GFP、LacZ或Neor。
3．按權(quán)利權(quán)求1所述的缺失凋亡抑制基因病毒的構(gòu)建，其特征在于所述的效應(yīng)基因為P53、TNF、Barnase或Reaper。
4．按權(quán)利要求1或2或3所述的缺失凋亡抑制基因病毒的構(gòu)建，其特征在于所構(gòu)建的缺失凋亡抑制基因病毒用于腫瘤的基因治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種缺失凋亡抑制基因病毒的構(gòu)建及其應(yīng)用。它是以腺病毒或單純皰疹病毒為材料,經(jīng)過PCR擴增基因片段,插入質(zhì)粒DNA中,進一步用GFP等標(biāo)記基因和TNF等效應(yīng)基因,構(gòu)建出轉(zhuǎn)移載體,插入失活與復(fù)制有關(guān)的凋亡抑制基因,并與相應(yīng)的野生型病毒共轉(zhuǎn)染,篩選重組病毒,分別得到E1b55K基因缺失的重組腺病毒和ν
文檔編號A61K48/00GK1230595SQ9811349
公開日1999年10月6日 申請日期1998年4月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月2日
發(fā)明者齊義鵬, 肖庚富, 齊兵, 蘇霏, 王業(yè)富, 劉德立, 朱應(yīng), 李曉鋒, 劉子夜 申請人:武漢大學(xué)