專利名稱：一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌肽，特別涉及一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
刺激隱核蟲(chóng)是目前嚴(yán)重威脅海洋魚(yú)類的一種傳播性極強(qiáng)的寄生蟲(chóng)，已被列為農(nóng)業(yè) 部2008年12月11日發(fā)布的新版《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中的二類動(dòng)物疫病，它 所引發(fā)的“白點(diǎn)病”和繼發(fā)性細(xì)菌性感染，如白鰓病、細(xì)菌性潰瘍等，給我國(guó)海水魚(yú)類養(yǎng)殖帶 來(lái)了巨大的損失。特別是大黃魚(yú)的白點(diǎn)病危害最為嚴(yán)重，自2005年起，每年給我國(guó)大黃魚(yú) 養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了超過(guò)3億元的經(jīng)濟(jì)損失，寄生蟲(chóng)的防治是目前魚(yú)類養(yǎng)殖急需解決的重要課 題。目前，防治海水魚(yú)類“白點(diǎn)病”的方法十分有限，雖然一些化學(xué)藥物的使用能起到 一些效果，但是抗蟲(chóng)藥物在海區(qū)大水體中的長(zhǎng)期超量使用，可使海洋污染加劇和海洋魚(yú)類 健康嚴(yán)重受損。特別需要指出的是，寄生蟲(chóng)感染后常會(huì)伴隨著嚴(yán)重的細(xì)菌繼發(fā)感染，而超量 使用抗生素預(yù)防和控制細(xì)菌病害，將帶來(lái)細(xì)菌耐藥性、水產(chǎn)品安全性、環(huán)境污染諸多問(wèn)題， 反而嚴(yán)重影響到水產(chǎn)品食品安全及海水養(yǎng)殖健康發(fā)展?？咕?Antimicrobial Peptides,AMP)具有廣譜性、高效性、選擇毒性、穩(wěn)定性及 不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，自發(fā)現(xiàn)和研究至今被認(rèn)為是現(xiàn)有抗生素的最佳替代品。我國(guó)已從 大黃魚(yú)、石斑魚(yú)等6種海水養(yǎng)殖魚(yú)類中獲得了近20個(gè)抗菌肽，經(jīng)驗(yàn)證具有較強(qiáng)的抗細(xì)菌和 抗真菌活性。抗菌肽還具有抗寄生蟲(chóng)的作用，可以有效地殺滅引起人類及動(dòng)物寄生蟲(chóng)病的寄生 蟲(chóng)，如瘧疾、Chagas氏病、萊什曼病等。目前發(fā)現(xiàn)一種合成的天蠶素-蜂毒素雜合體對(duì)萊 什曼原鞭毛蟲(chóng)有損傷作用，起作用的靶目標(biāo)是細(xì)胞質(zhì)膜，它可以快速降低H-OH的通透性， 破壞膜電勢(shì)，質(zhì)膜形態(tài)也受到損壞。2008年，國(guó)外首次報(bào)道雜交斑紋鱸(hybrid striped bass)的抗菌肽piscidin(源自英文單詞Piscine，意為魚(yú)的)具有較強(qiáng)的抗外寄生蟲(chóng)的作 用。鑒于上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗菌肽Piscidin具有殺蟲(chóng)抗菌的雙重功能，2008年，陳勇等克 隆出了部分大黃魚(yú)piscidin-like的cDNA序列(1、陳勇，等，大黃魚(yú)Piscidin-Iike抗菌肽 基因部分cDNA的克隆與序列分析，廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，47 (4) :575-579)， 所推導(dǎo)出的成熟肽序列與已報(bào)道的雜交斑紋鱸(hybrid striped bass)抗菌肽piscidin 同樣具有 22 個(gè)氨基酸(2、Fernandes，et al (2010)Atlantic Cod piscidin and its diversification through positive selection. PLosONE 5(3) :e9501. doi : 10.1371/ journal, pone. 0009501)，同樣屬于陽(yáng)離子抗菌肽，研究結(jié)果為尋找解決大黃魚(yú)刺激隱核蟲(chóng) 病的防治帶來(lái)了極為重要的啟示。然而，我國(guó)海水魚(yú)類抗菌肽的研究工作非常缺乏，目前尚 未報(bào)道鑒定出任何一種抗菌肽具有殺滅刺激隱核蟲(chóng)的作用，甚至還沒(méi)有任何報(bào)道發(fā)現(xiàn)它們 具有抗蟲(chóng)功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽。本發(fā)明的第二目的在于提供一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽的制備方法。本發(fā)明的第三目的在于提供一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽在制備殺滅刺激隱核 蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。所述一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽命名為抗菌肽Lyc-piscidin-His，其氨基酸序 列如下lie Trp Gly Leu lie Ala His Gly Val Gly His Val Gly Arg Leu lie His Gly Leu lie Arg Gly His。所述一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽的制備方法采用固相化學(xué)法，其具體步驟如 下使用多肽合成儀合成殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽，合成的殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽 經(jīng)過(guò)三氟乙酸剪切，再用反向柱純化，即得殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽。所述一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽能夠有效抑制并殺滅革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌 的生長(zhǎng)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用總體強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，對(duì)海洋細(xì)菌的抑制和殺滅作用稍 低于非海洋細(xì)菌。同時(shí)，殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽對(duì)刺激隱核蟲(chóng)也有較強(qiáng)的殺滅效果，在較 低濃度下短時(shí)間內(nèi)即可殺死全部的刺激隱核蟲(chóng)(具體情況參見(jiàn)實(shí)施例)，因此可將其制備 成殺滅刺激隱核蟲(chóng)的藥物。本發(fā)明所制備的殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)，含有豐富的 堿性氨基酸，帶較強(qiáng)的正電荷，在C-末端帶有酰基化的甘氨酸。為增強(qiáng)其作為陽(yáng)離子抗菌 肽的特性，其C-末端加上了一個(gè)His氨基酸，使其具備更強(qiáng)的抗菌活性和抗蟲(chóng)特性，能夠防 治海洋魚(yú)類刺激隱核蟲(chóng)病與細(xì)菌疾病。抗菌肽Lyc-Piscidin-His不僅適用于刺激隱核蟲(chóng) 病的治療藥物開(kāi)發(fā)，而且可形成具有抗蟲(chóng)抗菌雙重功效的飼料添加劑。對(duì)于解決海水魚(yú)類 養(yǎng)殖的嚴(yán)重寄生蟲(chóng)疾病問(wèn)題具有重要意義，特別對(duì)于解決目前非常嚴(yán)重的大黃魚(yú)“白點(diǎn)病” 提供了重要的思路，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。


圖1為抗菌肽Lyc-piscidin-His殺滅刺激隱核蟲(chóng)的動(dòng)力學(xué)曲線。在圖1中，橫坐 標(biāo)為時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為死亡率(％)；曲線1為無(wú)抗菌肽的對(duì)照，曲線2為所加入的抗菌 肽 Lyc-piscidin-His 濃度為 3 μ mol/L,曲線 3 為 6 μ mol/L,曲線 4 為 12 μ mol/L,曲線 5 為 24 μ mol/L,曲線 6 為 48 μ mol/L。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但并不作為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。本發(fā)明在已克隆大黃魚(yú)piscidin-like部分cDNA的基礎(chǔ)上(參見(jiàn)文獻(xiàn)陳勇，等， 大黃魚(yú)Piscidin-Iike抗菌肽基因部分cDNA的克隆與序列分析，廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué) 版)，2008,47 (4) =575-579)，根據(jù)所推導(dǎo)出的大黃魚(yú)抗菌肽piscidin-like成熟肽序列，設(shè) 計(jì)出了具有殺滅刺激隱核蟲(chóng)效果的抗菌肽Lyc-Piscidin-His的氨基酸序列，并提供了抗菌肽的制備方法與用途。實(shí)施例1抗菌肽Lyc-Piscidin-His的人工合成肽序列設(shè)計(jì)根據(jù)已獲得大黃魚(yú)piscidin-like部分cDNA序列和所推導(dǎo)出的氨基酸序列，通過(guò) 生物信息學(xué)分析，利用BLAST軟件(參見(jiàn)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院網(wǎng)站http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)比對(duì)，確定抗菌肽大黃魚(yú)Piscidin-like成熟肽(即抗菌肽Lyc-Piscidin-His)為 22個(gè)氨基酸，其序列為lie Trp Gly Leu lie Ala His Gly Val Gly His Val Gly Arg Leu lie His Gly Leu lie Arg Gly0確定抗菌肽大黃魚(yú)Piscidin-like優(yōu)勢(shì)域?yàn)?8個(gè)氨基酸，其序列為His Gly Ala Glu Glu Gln His Val Gln Leu Asp Lys Arg Ser Leu Ser Tyr Asp Pro Pro Lys LysLeu Gln Trp Arg Glu Asp。大黃魚(yú)piscidin-like抗菌肽的優(yōu)勢(shì)域主要是為了穩(wěn)定成熟肽的構(gòu)象，增強(qiáng)其生 物學(xué)活性，其與成熟肽相連接的第1個(gè)氨基酸為His。因此，為了增強(qiáng)抗菌肽作為陽(yáng)離子抗 菌肽的特性，在大黃魚(yú)抗菌肽piscidin-like的成熟肽C-末端加上了一個(gè)His，即優(yōu)勢(shì)域的 第1個(gè)氨基酸，經(jīng)驗(yàn)證，這樣設(shè)計(jì)的人工合成肽具有較強(qiáng)的抗菌活性和抗蟲(chóng)特性。因此本發(fā) 明優(yōu)選了含有23個(gè)氨基酸的人工合成抗菌肽Lyc-Piscidin-His，其氨基酸序列為lie Trp Gly Leu lie Ala His Gly Val Gly His Val Gly Arg Leu lie His Gly Leu lie Arg Gly His。實(shí)施例2抗菌肽Lyc-Piscidin-His的制備采用固相化學(xué)法合成抗菌肽Lyc-Piscidin-His，所用儀器為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公 司(AppliedBiosystems)生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀。合成的多肽經(jīng)過(guò)高濃度的三氟乙酸 (TFA)剪切后，用反向柱純化，純化后的多肽通過(guò)質(zhì)譜鑒定。具體步驟如下1)合成從C端到N端逐個(gè)進(jìn)行，由Pioneer多肽合成儀自動(dòng)控制。第1個(gè)氨基酸 His的羧基端裝載到聚苯乙烯材質(zhì)的固相樹(shù)脂載體上，形成一個(gè)對(duì)酸不穩(wěn)定性的連接；樹(shù) 指上His的氨基端連接上9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基保護(hù)試劑進(jìn)行保護(hù)，這種連接是對(duì)堿 不穩(wěn)定的；側(cè)鏈則都連接上叔丁氧羰基進(jìn)行保護(hù)，這種連接是對(duì)酸不穩(wěn)定性的。當(dāng)需要合成下一個(gè)氨基酸Gly時(shí)，樹(shù)脂上His氨基端的9_芴甲氧羰基保護(hù)用哌啶 移除，并檢測(cè)確認(rèn)徹底去除保護(hù)后，加入下一個(gè)用9-芴甲氧羰基保護(hù)了氨基的氨基酸Gly， 通過(guò)Gly被激活的羧基端耦合到His (或延伸肽)上已去除保護(hù)的氨基端，再檢測(cè)確認(rèn)樹(shù)脂 上所有游離的氨基端都完全耦合，這樣就完成了 1個(gè)氨基酸的合成延伸，并可以開(kāi)始下一 個(gè)氨基酸的合成。每一輪合成延伸都包括兩個(gè)步驟(1)對(duì)樹(shù)脂上延伸肽中9-芴甲氧羰基 保護(hù)的氨基端去保護(hù)；(2)耦合下一個(gè)氨基酸。2)當(dāng)人工合成肽完整合成后，用三氟乙酸剪切液將人工合成肽就從樹(shù)脂上釋放下 來(lái)，并對(duì)側(cè)鏈去保護(hù)，形成完整的人工合成肽制品。三氟乙酸剪切液的組成為，按質(zhì)量百分 比三氟乙酸88%，苯酚5%，水5%，三異丙基硅烷2%。3)過(guò)濾去除樹(shù)脂，人工合成肽留存在濾出液中，并加10倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醚， 4000rpm離心lOmin，收集沉淀并室溫干燥。4)純化取干燥后的多肽，溶于0. 三氟乙酸溶液中，樣品處理后經(jīng)反向柱分
1 O
幻鑒定制備的抗菌肽經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析，根據(jù)質(zhì)譜圖計(jì)算出的抗菌肽 Lyc-piscidin-His的分子量為2468. 96。由多肽序列計(jì)算出的理論值為2467. 93。證明制 備的多肽即為設(shè)計(jì)的抗菌肽Lyc-piscidin-His。鑒定合格的抗菌肽產(chǎn)物備用。實(shí)施例3抗菌肽Lyc-Piscidin-His的抗菌活性測(cè)定抗菌肽Lyc-Piscidin-His的抗菌活性測(cè)定采用微量肉湯稀釋法，以金黃色葡萄 球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌和大腸桿菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、銅綠 假單胞菌、熒光假單胞菌和嗜水假單胞菌(所用菌株均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種 保藏中心)等革蘭氏陰性菌作為試驗(yàn)菌種，測(cè)定抗菌肽Lyc-piscidin-His抗菌肽的抗菌活 性。將被測(cè)試菌劃線于MHA (Mueller-Hinton瓊脂固體培養(yǎng)基)平板上，倒置培養(yǎng) 24h0從平板上挑取1個(gè)單菌落接種于MHA斜面培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。次日用500 1000 μ 1磷酸鈉緩沖液(ρΗ為7. 2 7. 4)洗脫斜面培養(yǎng)物，再用MHB (Mueller-Hinton肉 湯液體培養(yǎng)基)和磷酸鈉緩沖液調(diào)整菌懸液濃度至OD值(光密度，optical density)= 0. 0018。首先取冷凍干燥的抗菌肽Lyc-piscidin-His溶解于無(wú)菌水中，濃度約為 480 μ mol/L。利用2倍稀釋法稀釋后，將不同濃度的抗菌肽溶液分別加到96孔組織培養(yǎng)板 中，每孔的終濃度分別為0. 375,0. 75,1. 5、3、6、12、24、48ymol/L。然后加入50 μ 1 OD = 0. 0018的測(cè)試菌液。對(duì)照組設(shè)兩組，陽(yáng)性對(duì)照為無(wú)菌水代替抗菌肽Lyc-piscidin-His，陰 性對(duì)照以MHB(MueIler-Hintc)n肉湯液體培養(yǎng)基)和磷酸鈉緩沖液代替待測(cè)菌液。28V培 養(yǎng)24h后肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低蛋白濃度即為試驗(yàn) 菌的最小抑制濃度(MIC，minimum inhibition concentration)，多次重復(fù)確定其最小抑制 濃度MIC。從無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的所有培養(yǎng)孔中分別移取10 40μ1培養(yǎng)液均勻涂布在 MHA(MUeller-Hinton瓊脂固體培養(yǎng)基)培養(yǎng)平板上，28°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜后觀察菌落形成情 況，無(wú)菌落形成的平板即說(shuō)明蛋白濃度已經(jīng)達(dá)到殺菌濃度，無(wú)菌落形成的最低蛋白濃度即 為最小殺菌濃度(MBC，minimum bactericidal concentration)，多次重復(fù)確定其最小殺菌 濃度MBC?？咕腖yc-piscidin-His能夠有效抑制并殺滅試驗(yàn)中所有革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性 菌的生長(zhǎng)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，對(duì)海洋細(xì)菌的抑制和殺滅作用稍低 于非海洋細(xì)菌，抗菌肽Lyc-piscidin-His的抗菌活性參見(jiàn)表1。表 權(quán)利要求
1. 一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽，其特征在于其命名為抗菌肽Lyc-piscidin-His，其 氨基酸序列如下lie Trp Gly Leu lie Ala His Gly Val Gly His Val Gly Arg Leu lie His Gly Leu lie Arg Gly His。
2.如權(quán)利要求1所述的一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽的制備方法，其特征在于采用固相化學(xué)法。
3.如權(quán)利要求2所述的一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽的制備方法，其特征在于所述固 相化學(xué)法的具體步驟為使用多肽合成儀合成殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽，合成的殺滅刺激 隱核蟲(chóng)的抗菌肽經(jīng)過(guò)三氟乙酸剪切，再用反向柱純化，即得殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽。
4.如權(quán)利要求1所述的一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽在制備殺滅刺激隱核蟲(chóng)藥物中 的應(yīng)用。
全文摘要
一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽及其制備方法與應(yīng)用。涉及抗菌肽，提供一種殺滅刺激隱核蟲(chóng)的抗菌肽及其制備方法與應(yīng)用。所述抗菌肽命名為抗菌肽Lyc-piscidin-His，采用固相化學(xué)法合成，所制備的抗菌肽Lyc-Piscidin-His具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)，含有豐富的堿性氨基酸，帶較強(qiáng)的正電荷，在C-末端帶有酰基化的甘氨酸。為增強(qiáng)其作為陽(yáng)離子抗菌肽的特性，其C-末端加上了一個(gè)His氨基酸，使其具備更強(qiáng)的抗菌活性和抗蟲(chóng)特性，能夠防治海洋魚(yú)類刺激隱核蟲(chóng)病與細(xì)菌疾病，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)A61P33/00GK102079782SQ20101057349
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者毛勇, 牛素芳, 王軍, 蘇永全, 鄔陽(yáng), 陳勇 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)