專利名稱：針對(duì)藍(lán)舌病毒的重組疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及:包含呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)(更具體而言，藍(lán)舌病毒(或BTV))的至少一種多核苷酸或者編碼至少一種BTV抗原、免疫原或表位的至少一種核酸分子的載體(vector),例如可以包含并表達(dá)BTV的至少一種多核苷酸的體內(nèi)和體外表達(dá)載體，或者可以包含并表達(dá)至少一種BTV抗原、免疫原或表位的體內(nèi)和體外表達(dá)載體；以及針對(duì)藍(lán)舌病的免疫原性組合物和疫苗，例如這樣的組合物或疫苗，其可以包含所述載體中的一種或多種和/或所述載體的表達(dá)產(chǎn)物中的一種或多種。本發(fā)明還涉及使用所述載體、組合物和疫苗的方法，其包括針對(duì)該病毒進(jìn)行免疫接種和疫苗接種，表達(dá)出所述多核 苷酸的表達(dá)產(chǎn)物，在測(cè)定法中使用所述表達(dá)產(chǎn)物或用于產(chǎn)生在測(cè)定法中可用的抗體；本發(fā)明還涉及制備尤其是所述多核苷酸、載體、組合物、疫苗、測(cè)定法的方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)舌病(BT)是反芻動(dòng)物的由節(jié)肢動(dòng)物傳播的傳染性病毒疾病。牛和山羊可容易被致病BTV感染，但是未呈現(xiàn)廣泛的血管損傷，因此這些物種通常不會(huì)顯示出明顯的臨床跡象。相反地，綿羊中的該疾病的特征在于口、鼻和前胃的粘膜的卡他性炎癥，以及蹄的冠狀帶和板(laminae)的炎癥。上皮發(fā)生脫落，并最終發(fā)生口腔粘膜壞死；腫脹且發(fā)炎的舌和口可以呈現(xiàn)藍(lán)色,該病由此而得名(Spreull 1905)。據(jù)估計(jì),綿羊中的死亡率為1_30%。BTV是環(huán)狀病毒屬(呼腸孤病毒科)的原型病毒，并且由至少24種不同的血清型構(gòu)成(Wilson和Mecham 2000)。已經(jīng)在全球的熱帶和溫帶地區(qū)各處鑒定出BTV的不同毒株。在歐洲遠(yuǎn)至北緯45度、在亞洲和北美洲遠(yuǎn)至北緯50度以及南至南緯35度處都發(fā)生過BTV感染。在反芻動(dòng)物之間BTV并不是接觸傳染的，因此BTV的分布取決于庫蠓屬(Culicoidessp.)的節(jié)肢動(dòng)物媒介物(vector)物種(蠓)的存在，在世界不同地區(qū)存在不同的媒介物物種。近期的數(shù)據(jù)表明，遺傳漂變和建立者效應(yīng)有助于BTV野生株的個(gè)體基因區(qū)段的多樣化(Bonneau, Mullens等人2001 )。已經(jīng)顯示，BTV血清陽性的動(dòng)物對(duì)于同源BTV血清型的再感染具有抗性。
反芻動(dòng)物的BTV感染是暫時(shí)的，而庫蠓屬昆蟲媒介物的感染是持久的。病毒血癥的持續(xù)時(shí)間取決于動(dòng)物的種類和BTV的毒株。已經(jīng)報(bào)道，綿羊中的病毒血癥可以是非常短暫的,在BTV感染的個(gè)體綿羊中病毒血癥可以持續(xù)至多41天，在山羊中病毒血癥可以持續(xù)至多42天，而在牛中病毒血癥可以持續(xù)至多100天。由于牛的BTV感染通常導(dǎo)致延長(zhǎng)的但并非持續(xù)的病毒血癥，因此牛起到了儲(chǔ)庫的作用，從中病毒可以被庫蠓屬媒介物攝取，然后傳播給其他反會(huì)動(dòng)物(Anderson, Stott 等人 1985;MacLachlan 1994;MacLachlan 和Pearson 2004)。人們對(duì)許多庫蠓屬媒介物物種的生態(tài)學(xué)了解得較少，它們的繁殖地點(diǎn)大部分沒有被表征，并且它們的散布速度也是未知的。在北美洲,Culicoides sonorensis是BTV的主要媒介物。雌性庫蠓屬昆蟲持續(xù)地被BTV感染，并可以在至多14天的外潛伏期后傳播該病毒(Mullens, Tabachnick等人1995)。在溫帶,BTV可以通過垂直感染的昆蟲媒介物而越冬，雖然近期的數(shù)據(jù)表明，在所述昆蟲媒介物的幼蟲階段中的持續(xù)BTV感染過程中，外部衣殼基因的表達(dá)降低(White, Wilson等人2005)。BTV病毒粒子的直徑為 69nm,其具有雙殼層外殼(衣殼)，所述雙殼層外殼有時(shí)被來源于受感染細(xì)胞的細(xì)胞膜的脂蛋白“假包膜”所包圍。BTV基因組包含10個(gè)不同的雙鏈RNA區(qū)段，它們共同編碼了 7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VPl至VP7)和4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a) (Roy 1996);其中9個(gè)基因組區(qū)段為單順反子，而區(qū)段10利用第二個(gè)框內(nèi)起始密碼子而編碼NS3和NS3A。在二十面體病毒粒子顆粒中，基因組RNA通過雙層蛋白質(zhì)衣殼而殼體化(Verwoerd，Els等人1972)。二十面體的核心由兩個(gè)主要蛋白質(zhì)(VP3和VP7)和三個(gè)次要蛋白質(zhì)(VP1、VP4、VP6)組成，并且被外部衣殼所包圍，所述外部衣殼由VP2和VP5 (分別由基因組區(qū)段2和5編碼)組成(Roy 1996)。VP2負(fù)責(zé)BTV的結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞、中和、血清型特異性以及血細(xì)胞凝集。多聚體形式的VP2 (二聚體和三聚體)裝飾了位于病毒顆粒外表面上的VP5支架結(jié)構(gòu)的大部分表面(Hassan和Roy 1999)。在24種BTV血清型中，VP2的變化最大，并且抗VP2抗體的水平與在體外和體內(nèi)的病毒中和有關(guān)(Huismans和Erasmus1981)。在BTV的不同血清型和毒株之間，VP5也顯著地變化(de Mattos, de Mattos等人1994; DeMaula, Bonneau等人2000)，并且雖然到目前為止還沒有鑒定出VP5特異性的中和性MAb，但是已經(jīng)有數(shù)據(jù)表明，該蛋白質(zhì)通過其對(duì)VP2的構(gòu)象影響而在中和和血清型決定中起著作用(Huismans 和 Erasmus 1981; Roy, Urakawa 等人 1990; DeMaula 等人，2000)。將純化的VP2 (其通過用BTV抗核心血清進(jìn)行免疫吸附而除去痕量的VP7)注射到綿羊中。50微克VP2的初始劑量足以誘導(dǎo)沉淀VP2的抗體以及中和性和抑制血細(xì)胞凝集的抗體。這些綿羊完全受到保護(hù)而能夠抵抗相同BTV血清型的強(qiáng)毒株的攻擊。即使在攻擊之前沒有檢測(cè)到中和抗體，較低劑量的VP2仍提供了顯著水平的保護(hù)(Huismans, van der Walt等人1987)。進(jìn)來的數(shù)據(jù)顯示，VP2和NSl表現(xiàn)出被細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)所識(shí)別的表位(Andrew, Whiteley等人1995)，而VP7和VP5不可能具有CTL表位。到目前為止，VP3、VP4、VP6、NS2和NS3沒有在綿羊中激發(fā)CTL應(yīng)答(Lobato，Coupar等人1997)。下表I (從(Wilson和Mecham 2000)進(jìn)行了修正)概括了 BTV的基因及其蛋白質(zhì)功能: 表1.監(jiān)舌病毒基因及所編碼的蛋白質(zhì)(其中包括蛋白質(zhì)的位置、性質(zhì)和功能)
權(quán)利要求
1.用于在易患環(huán)狀病毒疾病的動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)環(huán)狀病毒屬病毒(ον)的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，其包含重組痘病毒，其中所述重組痘病毒包含編碼具有如SEQ ID Ν0:20(或

圖11)所示的氨基酸序列的藍(lán)舌病毒(BTV) VP2的核酸分子。
2.包含重組痘病毒的免疫原性組合物，其中所述重組痘病毒包含核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:1所不的序列。
3.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，其中所述重組痘病毒為重組禽痘病毒。
4.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中所述重組禽痘病毒為金絲雀痘病毒。
5.權(quán)利要求4的免疫原性組合物，其中所述金絲雀痘病毒為ALVAC。
6.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。
7.權(quán)利要求6的免疫原性組合物，其中所述佐劑為卡波姆。
8.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含:所述動(dòng)物的除了BTV之外的其他病原體的抗原或免疫原或其表位；或者載體，所述載體包含并在所述動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)編碼所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子;或者所述動(dòng)物的滅活或減毒的除了 BTV之外的其他病原體。
9.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，其中所述動(dòng)物為羊類動(dòng)物、牛類動(dòng)物、貓類動(dòng)物或馬類動(dòng)物。
10.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物用于制備在動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)BTV的保護(hù)性應(yīng)答的試劑中的用途。
11.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物用于制備在動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)BTV的免疫學(xué)應(yīng)答的試劑中的用途。
12.權(quán)利要求10或11的用途，其中所述免疫原性組合物進(jìn)一步包括卡波姆佐劑。
13.(a)權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，和(b)分離的BTV抗原、免疫原或其表位在制備用于在動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)BTV的免疫學(xué)應(yīng)答的試劑中的用途，其中在初激-加強(qiáng)方案中在(b)之前施用(a)，或者在初激-加強(qiáng)方案中在(a)之前施用(b)，或者將(a)和(b)順次地或以混合形式一起施用。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述動(dòng)物為羊類動(dòng)物、牛類動(dòng)物、貓類動(dòng)物或馬類動(dòng)物。
15.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物在制備用于鑒別診斷的試劑中的用途，其中所述鑒別診斷包括:向動(dòng)物施用權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物；以及就不由所述免疫原性組合物所表達(dá)的BTV蛋白或其抗體的存在或不存在來測(cè)試所述動(dòng)物。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述動(dòng)物為羊類動(dòng)物、牛類動(dòng)物、貓類動(dòng)物或馬類動(dòng)物。
17.用于施行下列方法的試劑盒，所述方法包括:向動(dòng)物施用(a)權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，和/或(b)BTV抗原、免疫原或表位，并就BTV蛋白或抗體的存在或不存在測(cè)試所述動(dòng)物，所述試劑盒在分開的容器中包括(a)和(b)，以及可選地，關(guān)于施用的說明書。
18.試劑盒，其包含:(a)權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物；和(b)動(dòng)物的除了BTV之外的其他病原體的抗原或免疫原或其表位，或者載體，所述載體包含并在所述動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)編碼所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子，或者所述動(dòng)物的滅活或減毒的除了 BTV之外的其他病原體，其中(a)和(b)在分開的容器中，并且所述試劑盒可選地包含關(guān)于(a)和(b)的混合和/或施用的說明書。
19.權(quán)利要求17或18的試劑盒，其中所述動(dòng)物為貓類動(dòng)物、羊類動(dòng)物、牛類動(dòng)物或馬類動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫原性或疫苗組合物，其用于在對(duì)BTV感染易感的動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)環(huán)狀病毒(更具體地，藍(lán)舌病毒(BTV))的免疫應(yīng)答或保護(hù)性免疫應(yīng)答。所述組合物可以包含制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑以及載體。所述載體可以包含異源核酸分子，并在所述動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)BTV抗原、免疫原或其表位，例如BTV VP2；BTVVP2和VP5；BTV VP2和VP5和VP3和/或VP7。所述組合物可以包含佐劑，例如卡波姆。本發(fā)明還考慮了用于制備和使用此類組合物的方法，其包括初激-加強(qiáng)方案以及包括鑒別診斷。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103143034SQ20121054857
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2007年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月1日
發(fā)明者J·C·F·奧多內(nèi), K·卡拉卡, J·姚, N·J·麥克拉克倫 申請(qǐng)人:梅瑞爾有限公司, 加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)