專利名稱：包含用于治療癌癥及感染性疾病的熱休克蛋白或α2－巨球蛋白的組合物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明要求2001年8月21日提交的美國臨時專利申請No.60/313,629和2001年12月6日提交的No.60/337,222的權(quán)益，上述兩項申請在此完整地引入作為參考。
本發(fā)明是在政府的支持下完成的，國立衛(wèi)生院授權(quán)號為CA/A184479。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
1、引言本發(fā)明涉及預(yù)防和治療感染性疾病，及原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤疾病的方法和組合物。在感染性疾病及癌癥的預(yù)防和治療實踐中，將包含來源于抗原細胞和/或其消化產(chǎn)物的胞漿及膜來源蛋白的組合物，與熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物，以增強對腫瘤及感染性病原(agent)的免疫應(yīng)答。
2、發(fā)明背景2.1熱休克蛋白熱休克蛋白(HSPs)，亦稱為應(yīng)激蛋白，最初鑒定為細胞在熱休克反應(yīng)時合成的蛋白。根據(jù)分子量的不同將HSPs分為五大家族HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和smHSP。隨后發(fā)現(xiàn)家族中的許多成員可在包括營養(yǎng)缺失、代謝紊亂、氧自由基、缺氧和細胞內(nèi)病原體感染在內(nèi)的其他應(yīng)激性刺激反應(yīng)中誘導(dǎo)產(chǎn)生(見Welch，1993，5，Scientific American，56-64；Young，1990，Annu.Rev.Immunol.，8401-420；Craig，1993，Science，2601902-1903；Gething等，1992，Nature 35533-45；Lindquist等，1988，Annu.Rev.Genetics 22631-677)。
對熱休克及其他生理性應(yīng)激產(chǎn)生的細胞反應(yīng)進行研究，發(fā)現(xiàn)HSPs不僅參與這些不利情況下的細胞保護，而且參與未應(yīng)激細胞中的基本生化和免疫過程。HSPs可完成各種不同的分子伴侶功能。例如，定位于細胞胞漿、細胞核、線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的HSP70家族成員(Lindquist等，1988，Ann.Rev.Genetics，22631-677)參與正常細胞的蛋白轉(zhuǎn)運、折疊和裝配。HSPs可與蛋白或多肽結(jié)合，在酸性條件或有三磷酸腺苷存(ATP)存在的條件下釋放所結(jié)合的蛋白或多肽(Udono和Srivastava，1993，J.Exp.Med.1781391-1396)。
Srivastava等研究了針對甲基膽蒽所誘導(dǎo)近親繁殖小鼠肉瘤的免疫應(yīng)答(1998，Immunol.Today，978-83)。在這些研究中發(fā)現(xiàn)負責(zé)對這些腫瘤產(chǎn)生不同免疫原性的分子是96kDa的糖蛋白(gp96)和84～86kDa的細胞內(nèi)蛋白(Srivastava等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，833407-3411；Ullrich等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，833121-3125)。用從特定腫瘤分離的gp96或p84/86接種小鼠可使該小鼠對這種特定的腫瘤產(chǎn)生免疫力，但對抗原截然不同的腫瘤則無免疫力。對編碼gp96和p84/86的基因進行分離、鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者之間有著明顯的同源性，顯示gp96和p84/86分別為同一熱休克蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞漿的存在形式(Srivastava等，1988，Immuogenetics，28205-207；Srivastava等，1991，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，167109-123)。另外，發(fā)現(xiàn)HSP70可激發(fā)對其源性腫瘤的免疫應(yīng)答，對抗原性截然不同的腫瘤則不能激發(fā)免疫應(yīng)答。但是，和肽相脫離的HSP70喪失了其免疫原活性(Udono和Srivastava，1993，J.Exp.Med.，1781391-1396)。這些觀察結(jié)果表明單獨的熱休克蛋白本身不具備免疫原性，但可與抗原肽形成非共價復(fù)合物，該復(fù)合物激發(fā)對該抗原肽的特異性免疫應(yīng)答(Srivastava等，1993，Adv.Cancer Res.，62153-177；Udono等，1994，J.Immunol.，1525398-5403；Suto等，1995，Science，2691585-1588)。
從腫瘤細胞提純的HSPs和肽的非共價復(fù)合物可用于治療和預(yù)防癌癥，其見于1996年4月11日提交的WO96/10411號PCT出版物和1997年3月20日提交的WO97/10001號PCT出版物(分別為于1998年5月12日公布的No.5,750,119號美國專利和于1998年11月17日公布的No.5,837,251號美國專利，將其完整在此引入作為參考)。HSP-肽復(fù)合物的分離和純化已有描述，如從病原體感染細胞分離，并應(yīng)用于諸如病毒、包括細菌、原生動物、真菌和寄生蟲在內(nèi)的其他細胞內(nèi)病原體等所致感染的治療和預(yù)防(實例見1995年9月21日提交的WO95/24923號PCT出版物)。也可將應(yīng)激蛋白和抗原肽形成復(fù)合物來制備免疫原性應(yīng)激蛋白-抗原復(fù)合物，1997年3月20日提交的WO97/10001號PCT出版物(于2000年2月29日公布的No.6,030,618號美國專利)描述了該類化合物在癌癥和感染性疾病治療和預(yù)防中的應(yīng)用。1997年3月20日提交的WO97/10002號PCT出版物(同時見于1999年11月16日公布的No.5,985,270號美國專利)描述了使用應(yīng)激蛋白-抗原復(fù)合物在體外致敏用于過繼免疫治療的抗原呈遞細胞。
2.2.α2-巨球蛋白α2-巨球蛋白是包含C3、C4、C5補體成分的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白超家族的成員。人類血漿蛋白α2-巨球蛋白(α2M)是720kDa的同源四聚體蛋白，最初認為它是蛋白酶及血漿和炎性流體蛋白酶清道夫分子(綜述見Chu和Pizzo，1994，Lab.Invest.，71792)。α2M以包含1474個氨基酸殘基的前體形式合成。前23個氨基酸充當(dāng)信號肽，將其切割后產(chǎn)生包含1451個氨基酸殘基的成熟蛋白(Kan等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，822282-2286)。
α2M以共價結(jié)合的方式與含親核氨基酸側(cè)鏈的蛋白和肽鏈混雜地結(jié)合(Chu等，1994，Ann.N.Y.Acad.Sci.，737291-307)，并將它們導(dǎo)向表達α2M受體(α2MR)的細胞(Chu和Pizzo，1993，J.Immunol.，15048)。α2M和α2M受體的結(jié)合由α2M羧基端部分介導(dǎo)(Holtet等，1994，F(xiàn)eBS Lett.，344242-246)，關(guān)鍵的殘基已得以鑒定(Nielsen等，1996，J.Biol.Chem.，27112909-12912)。
眾所周知，α2M具有抑制蛋白酶的活性，它通過多個結(jié)合位點與各種蛋白酶結(jié)合(例如Hall等，1981，Biochem.Biophys.Res.Commun.，100(1)8-16)。蛋白酶與α2M的相互作用，導(dǎo)致復(fù)雜的結(jié)構(gòu)重排，稱作“轉(zhuǎn)化”。這是蛋白酶被硫酯捕獲后在α2M的“餌(bait)”區(qū)內(nèi)切割的結(jié)果。構(gòu)象的改變暴露出受體結(jié)合所需的殘基，使α2M-蛋白酶復(fù)合物可以與α2MR結(jié)合。甲胺可以誘導(dǎo)與蛋白酶類似的構(gòu)象改變和切割。α2M在未切割前的形態(tài)不能被其受體識別，這種形態(tài)稱為“慢形態(tài)”(s-α2M)。切割后的形態(tài)則稱為“快形態(tài)”(f-α2M)(綜述見Chu等，1994，Ann.N.Y.Acad.Sci.，737291-307)。最近也發(fā)現(xiàn)α2MR可與gp96、hsp90、hsp70、鈣網(wǎng)蛋白等HSPs結(jié)合(Basu等，2001，Immunity，14(3)303-13)。
研究顯示，除了抑制蛋白酶活性外，α2M與抗原形成復(fù)合物時可使抗原呈遞細胞如巨噬細胞攝取該抗原、呈遞給T淋巴細胞的能力提高到原來的2個數(shù)量級(Chu和Pizzo，1994，Lab.Invest.，71792)，也可使該抗原誘導(dǎo)T細胞增殖(Osada等，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.，14626-31)。進一步的證據(jù)顯示抗原與α2M形成復(fù)合物可促進未成熟的脾細胞生成抗體(Osada等，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.，150883)，在實驗兔(Chu等，1994，J.Immunol.，1521538-1545)和小鼠(Mitsuda等，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1011326-1331)中激發(fā)體外抗體反應(yīng)。α2M-抗原肽復(fù)合物還可誘導(dǎo)體外細胞毒T細胞反應(yīng)(Binder等，2001，J.Immunol.，1664698-49720)。
3、發(fā)明概述本發(fā)明包括用于預(yù)防和治療癌癥和感染性疾病的抗原蛋白和肽與熱休克蛋白(HSP)或α2-巨球蛋白(α2M)的復(fù)合物的制備方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備HSPs和抗原細胞或病毒顆粒的一組(population)抗原蛋白的復(fù)合物的方法。該方法包括將一組來源于抗原細胞或病毒顆粒的抗原蛋白與一種或幾種不同的熱休克蛋白在體外形成復(fù)合物，其中該組抗原蛋白包括存在于抗原細胞、病毒顆?；蚩乖毎募毎M分(cellular fraction)中不同蛋白的至少50％或至少50種不同蛋白。在另一個實施方案中，該方法包括將蛋白制品與一種或幾種不同的熱休克蛋白在一定條件下體外接觸，使得蛋白制品中的蛋白與熱休克蛋白形成復(fù)合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含HSPs和抗原細胞或病毒顆粒的一組抗原肽的復(fù)合物，其中分別使用一種或多種不同的蛋白酶消化抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒的蛋白制品而生成該組抗原肽。也可將抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒的蛋白制品充分暴露于ATP、鹽酸胍(guanidium hydrochloride)和/或酸性條件中，從蛋白制品中的蛋白復(fù)合物中洗脫抗原肽，從而產(chǎn)生該組抗原肽。使用任意一種或同時使用兩種方法產(chǎn)生的抗原肽在體外與一種或幾種不同的HSPs形成復(fù)合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備α2M和抗原細胞的一組抗原蛋白的復(fù)合物的方法。該方法包括將一組來源于抗原細胞或病毒顆粒的抗原蛋白與α2M在體外形成復(fù)合物，其中該組抗原蛋白包含存在于抗原細胞或病毒顆粒，或抗原細胞的細胞組分中不同蛋白的至少50％或至少100種不同蛋白。在另一個實施方案中，該方法包括在使蛋白制品中的蛋白與α2M形成復(fù)合物的條件下，將蛋白制品與α2M進行體外接觸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含α2M和抗原細胞或病毒顆粒的一組抗原肽的復(fù)合物，其中分別使用一種蛋白酶或多種蛋白酶消化抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒的蛋白制品而生成該組抗原肽。也可將抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒的蛋白制品暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件中，從而生成該組抗原肽。使用任意一種或同時使用兩種方法產(chǎn)生的抗原肽在體外與α2M形成復(fù)合物。
在各種實施方案中，抗原細胞可以是癌細胞或受病原體或感染性病原(agent)感染的細胞，優(yōu)選人細胞?？乖毎部梢允遣≡w或感染性病原的細胞，或其變異體?？乖毎牡鞍字破房蓛H包含胞漿蛋白，或僅包含膜來源蛋白，也可同時包含胞漿和膜來源蛋白。蛋白制品可以是粗制的、未分級分離的細胞裂解液。在一個具體的實施方案中，可以利用本領(lǐng)域中已知方法裂解抗原細胞、去除細胞碎片及非蛋白物質(zhì)，任選地純化蛋白，從而制備蛋白制品。在某些實施方案中，沒有使用選擇性地去除或保留抗原細胞其他蛋白中一種或幾種特定蛋白的制備方法來制備所需蛋白制品。
在某些實施方案中，抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒的蛋白制品可在適合酶反應(yīng)的條件下用各種蛋白酶水解，蛋白酶可以是但不僅限于胰酶、葡萄球菌肽酶I(亦稱為V8蛋白酶)、糜蛋白酶、胃蛋白酶、組織蛋白酶G、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶。可取樣并利用已知技術(shù)進行分析以確定肽鏈長度，從而監(jiān)測消化程度。優(yōu)選在使所得包含抗原肽的該組肽的平均長度為約7～20個氨基酸殘基的條件下實施消化步驟。利用不同蛋白酶消化蛋白制品的等分試樣從蛋白制品產(chǎn)生不同組的肽也是合乎要求的。在與HSP或α2M形成復(fù)合物之前，對用不同消化手段所得肽可以進行組合。在包含抗原肽的該組肽與HSP或α2M形成復(fù)合物之前，將蛋白酶滅活或從該組肽中分離出來，及任選地純化該組肽也是合乎需要的。
在某些實施方案中，將抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒的蛋白制品與三磷酸腺苷(ATP)、鹽酸胍和/或酸性條件接觸，使得可以洗脫抗原肽，而不必先分離HSP復(fù)合物。此法洗脫的抗原肽包含與HSPs及I類和II類MHC分子內(nèi)源性相關(guān)的肽。
在本發(fā)明的各個實施方案中，根據(jù)該組抗原肽與HSP或α2M形成復(fù)合物所用的方法，反應(yīng)可以產(chǎn)生以共價或非共價鍵與HSP或α2M形成復(fù)合物的抗原肽。預(yù)期用于形成復(fù)合物的熱休克蛋白包括但不限于HSP60、HSP70、HSP90、gp96、鈣網(wǎng)蛋白、grp78(或BiP)、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)、HSP110及grp170。通常優(yōu)選人HSPs及人α2M。HSP和抗原肽的復(fù)合物在用于或用作治療性或預(yù)防性組合物之前可進一步純化。本發(fā)明也提供了包含HSP和/或α2M、抗原細胞、蛋白制品和/或蛋白酶的試劑盒。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種在受試者中誘導(dǎo)針對第一抗原細胞或病毒顆粒的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將包含免疫原用量的、與一組抗原蛋白/肽形成復(fù)合物的HSP和/或α2M的組合物施用于個體，其中該組抗原蛋白/肽由第二抗原細胞或病毒顆粒制備。抗原肽的獲得方法包括用蛋白酶消化抗原細胞的蛋白制品，或是將蛋白制品暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件中。第一和第二抗原細胞或病毒顆粒表達至少一種共同的(common)抗原決定簇。
在另一個實施方案中，提供了一種治療或預(yù)防一類癌癥或感染性疾病的方法，該方法包括將包含與一組抗原肽形成復(fù)合物的HSP和/或α2M的組合物以治療或預(yù)防有效量施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者?？乖鞍?肽是從癌細胞或病原體感染的細胞制備的，所述細胞與癌癥或感染性疾病在抗原上相關(guān)(antigenically related)。病原體或感染性病原(包括病毒顆粒)也可用于制備抗原肽?？乖牡墨@得方法包括用蛋白酶消化抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒的蛋白制品，或是將蛋白制品暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸如三氟乙酸中。
在另一個實施方案中，提供了一種治療或預(yù)防一類癌癥或感染性疾病的方法，該方法包括將已用HSP和/或α2M和一組抗原蛋白/肽的復(fù)合物致敏的抗原呈遞細胞施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者。除了致敏的抗原呈遞細胞外，HSP和/或α2M和一組抗原肽的復(fù)合物也可施用于該受試者。
在各個實施方案中，受試者可在同一部位周期性地，如間隔一周，重復(fù)地施用復(fù)合物。組合物也可經(jīng)多種途徑，如真皮內(nèi)或皮下施用。
4、發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包含用于治療癌癥及感染性疾病之熱休克蛋白(HSP)或α2-巨球蛋白(α2M)的組合物制備方法。本發(fā)明的方法包括在體外制備HSP或α2M與抗原細胞的抗原蛋白及抗原肽的復(fù)合物。在一個實施方案中，該方法包括制備含一組抗原蛋白的抗原細胞蛋白制品，將這組抗原蛋白在體外與HSP或α2M形成復(fù)合物。在另一個實施方案中，該方法還包括在該組抗原肽在體外與HSP或α2M形成復(fù)合物之前，用至少一種蛋白酶消化該組抗原細胞的蛋白制品以產(chǎn)生一組抗原肽。本發(fā)明利用了抗原細胞的全部抗原性潛能。
本發(fā)明的治療或預(yù)防方法基于在需要預(yù)防或治療感染性疾病或癌癥的受試者體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答特異性針對癌細胞的抗原決定簇、導(dǎo)致感染性疾病之感染性病原感染的細胞的抗原決定簇或感染性病原的抗原決定簇。將包含HSP和/或α2M與抗原細胞的肽形成復(fù)合物的組合物施用于個體后，包含HSP和/或α2M與抗原肽形成復(fù)合物的組合物刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答，如細胞毒T細胞反應(yīng)?？乖毎梢允前┘毎蚴芨腥炯毎蚴蔷哂信c癌細胞或受感染細胞相同的抗原決定簇或類似抗原性的細胞。免疫應(yīng)答的結(jié)果之一是，個體的各種免疫效應(yīng)機制作用于癌細胞或受感染細胞，從而使這類疾病得以治療或預(yù)防。
需要治療或預(yù)防感染性疾病或癌癥的個體或受試者是動物，優(yōu)選哺乳動物、非人類靈長類動物，最優(yōu)選人類。本文所用術(shù)語“動物”包括但不局限于牧場動物或其成對動物，如貓、狗、牛、豬、羊、馬、雞等。
本發(fā)明的治療方案和藥物組合物可與其他免疫應(yīng)答增強劑或生理反應(yīng)調(diào)節(jié)劑聯(lián)用，如IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、TNF等細胞因子或其他影響免疫細胞的細胞因子，但不局限于這些。
本發(fā)明的組合物和方法是對其他使用天然生成之HSP-抗原肽復(fù)合物來治療或預(yù)防癌癥或感染疾病之組合物和方法的改進。在這些其他方法中，從癌細胞或受感染細胞分離出特異性的HSP及其與抗原肽的復(fù)合物，然后將它們施用于病人以在體內(nèi)誘導(dǎo)針對該癌細胞或受感染細胞的免疫應(yīng)答(實例見美國專利No.5,750,119和No.5,961,979)。依據(jù)所需HSP類型而規(guī)定的方法分離天然生成的復(fù)合物。因此，天然生成的一類HSP和抗原肽復(fù)合物僅包含與該類HSP共同定位于抗原細胞某一區(qū)室中的那些抗原肽。某些類型HSP普遍存在于癌細胞的區(qū)室中，而某些抗原肽僅存在于癌細胞的某些區(qū)室中。例如，HSP90和HSP70僅在胞漿中發(fā)現(xiàn)。因此，它們僅與位于胞漿中的抗原肽形成復(fù)合物，而不與定位于其他位置如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的抗原肽形成復(fù)合物。也就是說，對于每一特定的HSP來說，僅有一部分抗原細胞的抗原肽可與之結(jié)合。因此，為了激發(fā)針對癌細胞或受感染細胞中大量抗原決定簇的免疫應(yīng)答，必須利用各自的分離方法從癌細胞或受感染細胞分離出各種HSP及其肽復(fù)合物，然后將它們施用于病人。這種方法非常費力，且可能需要大量抗原細胞，而這些抗原細胞在某些情況下無法獲得。本發(fā)明在體外生成實際上代表抗原細胞所有抗原的肽，然后將這些肽與一種或幾種不同的HSP和/或α2M形成復(fù)合物，所形成的復(fù)合物可用于在病人中激發(fā)免疫應(yīng)答，從而解決了這一問題。利用本發(fā)明的方法，即使不是共同定位于抗原細胞同一區(qū)室中的抗原肽和HSP也可形成復(fù)合物。本發(fā)明的方法使得特定類型的HSP與抗原細胞中的大部分甚至每一抗原肽形成復(fù)合物成為可能。相應(yīng)地，利用本發(fā)明制備的組合物可以更有效地誘導(dǎo)針對抗原細胞的免疫應(yīng)答。此外，本方法不需要預(yù)先將HSP復(fù)合物與相關(guān)肽分離，因此可以使用很少量的起始材料，而起始材料常受供應(yīng)限制。
而且，癌細胞、受感染細胞或病原體的抗原特征(profile)經(jīng)過一段時間后如在治療的過程中可能會改變。許多病原體突變并合成宿主的免疫細胞和抗體不能識別的突變蛋白來逃避宿主的免疫系統(tǒng)。已知癌細胞可以發(fā)生突變，合成突變蛋白，其中一些不能為宿主的免疫系統(tǒng)所識別，從而對某些藥物產(chǎn)生耐藥性。本發(fā)明中一個實施方案的優(yōu)勢之一是對來源于癌細胞、受感染細胞或病原體的胞漿和/或膜的蛋白進行消化，可以使更大范圍及更具多樣性的抗原肽與HSPs及α2M形成復(fù)合物。結(jié)果免疫應(yīng)答受抗原細胞上更大量的抗原決定簇介導(dǎo)，從而使抗原細胞如癌細胞或受感染細胞更難躲過免疫系統(tǒng)的識別和作用。
在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明的方法產(chǎn)生非天然存在的α2M-肽復(fù)合物。已知α2M是一種可與各種細胞外蛋白尤其是蛋白酶結(jié)合的細胞外蛋白，然后將它們滅活并將它們帶至細胞內(nèi)。通常α2M不能接近抗原細胞的所有抗原肽，因而也不能與所有抗原肽形成復(fù)合物。本發(fā)明的方法使α2M可以與范圍更大的胞漿或膜來源、或抗原細胞之胞漿或膜來源蛋白消化而產(chǎn)生的肽形成復(fù)合物。
第4.1部分所述的是抗原細胞的來源，蛋白制品可由這些抗原細胞制備。第4.2部分提供了制備抗原細胞之不同類型蛋白制品的方法及消化蛋白制品的方法。第4.3和4.4部分分別描述了用于與抗原肽形成復(fù)合物之HSP或α2M的分離或生產(chǎn)。第4.5部分描述了HSP和抗原肽復(fù)合物的體外形成。第4.6部分描述的是使用復(fù)合物預(yù)防和治療癌癥及感染性疾病的方法，以及所治療的癌癥和感染性疾病類別。第4.7部分描述了利用本發(fā)明方法制備的組合物在過繼免疫中的應(yīng)用。第4.7部分提供了本發(fā)明的復(fù)合物在預(yù)防性保護動物免受癌細胞生長的效果的實驗數(shù)據(jù)。
4.1、抗原細胞的來源本發(fā)明的抗原細胞包含受試者免疫應(yīng)答所需的抗原決定簇。
為預(yù)防或治療癌癥或感染性疾病，本發(fā)明的方法提供了與抗原蛋白及抗原肽形成復(fù)合物的HSP和α2M，其中抗原蛋白及抗原肽，如腫瘤特異性抗原及腫瘤相關(guān)抗原的片段來源于癌細胞，優(yōu)選人類癌細胞。將來源于癌細胞或具有與該癌細胞相同抗原決定簇或顯示類似抗原性之細胞的蛋白(如胞漿和/或膜來源蛋白)進行蛋白分解消化而生成這些抗原肽。也可將蛋白暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件下而產(chǎn)生抗原肽。本文所用的術(shù)語“同種癌”的細胞或組織指同一組織或由相同組織癌癥轉(zhuǎn)移的癌癥組織或細胞。
為治療或預(yù)防感染性疾病，本發(fā)明的方法提供了HSP及α2M與抗原肽相復(fù)合的組合物，其中抗原肽來源于受病原體或可致感染性疾病的感染性病原，或來源于包括但不局限于下列病原體病毒、細菌、真菌、原生動物和寄生蟲等等。優(yōu)選感染人類的病原體。將從癌細胞、包含病毒顆粒的細胞或具有與該癌細胞相同抗原決定簇或顯示類似抗原性的細胞獲得的蛋白(如胞漿和/或膜來源蛋白)進行蛋白分解消化而產(chǎn)生了這些抗原肽。也可將蛋白暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件下而產(chǎn)生抗原肽?？乖囊部蓮娘@示感染性疾病致病原(病原體)或其變異體所具有抗原性的抗原細胞獲得。
既然本發(fā)明要用到癌細胞、受感染細胞或其他抗原細胞的整體，在使用這些方法前就沒必要將抗原肽進行分離或鑒定其特征，甚至不需要對其鑒定。依據(jù)疾病與何種抗原相關(guān)的本性來選擇抗原細胞的來源。在本發(fā)明的一個實施方案中，任何組織或從包括已轉(zhuǎn)移到多個部位之腫瘤的任何腫瘤分離的細胞均可用作該方法的抗原細胞。例如，血液循環(huán)中的白血病細胞、淋巴液或其他體液均可使用，也可使用實體瘤組織(如活檢的原始組織)。本文的術(shù)語癌細胞也包括前瘤細胞，這種細胞處于由正常細胞轉(zhuǎn)化成瘤細胞的過渡形態(tài)。從非瘤性細胞生長過渡到腫瘤通常由過度增生、化生、發(fā)育異常這些步驟組成(這種非正常生長情況的綜述見Robbins及Angell，1976，Basic Pathology，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79)。下文第4.5.2部分提供了可在這里應(yīng)用的非限制性癌癥及其細胞的列表。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，任何被病原體或感染性病原感染的細胞，即受感染細胞均可充當(dāng)制備抗原肽的抗原細胞。尤其優(yōu)選被諸如病毒、細菌、真菌、原生動物或寄生蟲等細胞內(nèi)病原體感染的細胞。第4.5.1部分提供了可感染在這里應(yīng)用的細胞的示范性感染病原列表。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，任何可導(dǎo)致感染性疾病的病原體或感染性病原均可充當(dāng)制備抗原肽的抗原細胞。病原體或感染性病原的變異體也可用作此目的的抗原細胞，如缺乏復(fù)制能力的變異體、非變原性變異體或減弱變異體、非感染性變異體等，但并不局限于這些。例如，許多可在體外培養(yǎng)或從受感染物質(zhì)分離的病毒、細菌、真菌、原生動物或寄生蟲可充當(dāng)抗原細胞的來源?？梢允褂迷擃I(lǐng)域中用來繁殖這類病原體，包括病毒顆粒的已知方法。
來源于癌組織、癌細胞或受感染細胞的細胞系可以用作抗原細胞。優(yōu)選人類癌組織或受感染組織、細胞或細胞株?？捎迷擃I(lǐng)域內(nèi)任何已知方法鑒定、分離這些癌細胞、受感染細胞或抗原細胞。例如，可以用形態(tài)學(xué)、酶檢方法或在病原體或致癌病毒存在的條件下對癌細胞或受感染細胞加以鑒定。如果感興趣的抗原其特征是已知的，也可利用本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的生化或免疫方法對抗原細胞加以鑒定或分離。例如，可以用外科手術(shù)、內(nèi)窺鏡檢查、其他活檢技術(shù)、親和層析及熒光激活細胞分選法(例如使用針對細胞所表達抗原的熒光標(biāo)記抗體)。表現(xiàn)出類似抗原性的抗原細胞具有一種或幾種共同的抗原決定簇，這些抗原決定簇在受試者的免疫應(yīng)答中是必需的(如為了其治療性或預(yù)防性目的)。
如果從受試者獲得的抗原細胞數(shù)量不夠充足，可在應(yīng)用于本方法前將其于體外用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)以增加其數(shù)量?？乖毎恍枰寺』蚣兓蚓邆渫葱?。只要細胞混合物有基本數(shù)量的含感興趣之抗原即可使用細胞混合物。在一個具體的實施方案中，對抗原細胞和/或免疫細胞進行了純化。
為了制備病原體感染的細胞，在體外對易被病原體或引發(fā)疾病的感染性病原感染的未感染細胞進行感染。根據(jù)病原體或感染性病原的傳播模式和生物學(xué)性質(zhì)，可用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)促進病原體或感染性病原的感染及受感染細胞的繁殖。例如，可以用流感病毒感染正常的人成纖維細胞，用分支桿菌感染正常的人施旺細胞。在各種實施方案中，諸如缺乏復(fù)制能力的變異體、非病原性變異體或減弱變異體、溫度敏感變異體等的感染性病原變異體也可用于感染或轉(zhuǎn)化細胞以產(chǎn)生用于制備抗原肽的抗原細胞。如果需要將大量病原體感染細胞或病原體直接充當(dāng)抗原細胞，則可使用本領(lǐng)域內(nèi)的任何已知方法對病原體加以繁殖和培育。這類方法依病原體不同而異，可能不包括感染宿主。例如，在本領(lǐng)域內(nèi)，許多培育處于培養(yǎng)中的病原性細菌、真菌及其他非病毒微生物的技術(shù)包括大規(guī)模發(fā)酵是已知的。
此外，如果編碼腫瘤抗原(如腫瘤特異抗原及腫瘤相關(guān)抗原)或病原體抗原的基因可以獲得，也可用含編碼該抗原核酸分子的表達構(gòu)建體在體外轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染來源于預(yù)計接受者之適當(dāng)類型的正常細胞，以便該抗原在接受者的細胞內(nèi)得以表達。在一個實施方案中，腫瘤相關(guān)抗原為在腫瘤細胞內(nèi)以相對于正常細胞高水平表達的抗原；腫瘤特異抗原為僅在腫瘤細胞表達、正常細胞不表達的抗原。用這種方式，一種或幾種這樣的抗原可任選地在接受者的細胞內(nèi)表達，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解這一點。可用諸如Ausubel等所述(1989，Current protocolsin molecular biology，Wiley Interscience)的任何已知技術(shù)實施轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染及隨后抗原基因在接受者細胞的重組表達。
可在該類細胞表達的適當(dāng)?shù)鞍准半陌ǖ痪窒抻谀切╋@示(用于治療或預(yù)防癌癥的)抗原性的蛋白及肽——包括酪氨酸酶、gp100、melan-A、gp75及粘蛋白在內(nèi)的腫瘤抗原；和(用于治療或預(yù)防感染性疾病的)抗原性的蛋白及肽——包括I型免疫缺陷病毒(HIV-I)、II人型免疫缺陷病毒(HIV-II)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、流感病毒、水痘、腺病毒、II型單純皰疹病毒(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、?？刹《尽⑤啝畈《?、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒及脊髓灰質(zhì)炎病毒的蛋白，以及感染染性病原的蛋白或其片段，感染性病原包括但不局限于分枝桿菌、立克次氏體、支原體、奈瑟菌、軍團菌、利什曼原蟲、kokzidioa、錐蟲、衣原體、及立克次氏體。
4.2、抗原蛋白及肽的制備依照本發(fā)明，本發(fā)明的組合物包括與HSPs形成復(fù)合物的抗原蛋白，其中該抗原蛋白來源于感興趣之抗原細胞的蛋白制品。本發(fā)明的組合物還包括與α2M形成復(fù)合物的抗原蛋白，其中該抗原蛋白來源于感興趣之抗原細胞的蛋白制品。本發(fā)明的組合物和包括HSPs與抗原肽的復(fù)合物或α2M與抗原肽的復(fù)合物，其中由抗原細胞蛋白制品生成一組肽，然后將肽與HSPs或α2M形成所需復(fù)合物。
在各種實施方案中，為保留抗原蛋白及肽的多樣性并使之最大化，制備蛋白制品的制備方法不能選擇性地去除或保留抗原細胞蛋白及肽中的任意特定蛋白或肽。即使在某些使用胞漿來源或膜來源蛋白的實施方案中，用于制備蛋白制品的方法也不會選擇性的去除或保留胞漿蛋白或膜蛋白的任何特定蛋白。因此，存在于膜或胞漿內(nèi)的的大部分蛋白也存在于抗原細胞蛋白及肽的各蛋白制品中。在優(yōu)選實施方案中，基本上抗原細胞的全部抗原蛋白及肽，和基本上胞漿或膜內(nèi)的所有蛋白及肽均參與復(fù)合反應(yīng)并和HSPs和/或α2M形成復(fù)合物。
4.2.1、抗原細胞的蛋白制品在本發(fā)明一個實施方案中，我們提供了一種來源于癌細胞、受感染細胞或病原體的蛋白制品。例如，為治療癌癥，從癌癥患者手術(shù)后獲得的腫瘤細胞制備出蛋白制品。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所感興趣的一種或幾種抗原蛋白在引入編碼該抗原的重組表達系統(tǒng)的改造細胞系中合成，同時該細胞用于制備蛋白。蛋白可從一種或幾種細胞組分獲得，如抗原細胞的胞漿；也可從抗原細胞的細胞膜及細胞壁提取或溶解而獲得。可使用本領(lǐng)域中任何已知的細胞裂解、細胞內(nèi)容物分離及蛋白富集或分離技術(shù)。實例見Coligan等編《當(dāng)代免疫學(xué)實驗方案》第2卷第8章，John Wiley & Sons，Inc.；Rowland等《病理及臨床微生物學(xué)實驗手冊》，Little Brown & Co.，1994年6月；將其完整在此引入作為參考。依據(jù)分離細胞內(nèi)容物的方法不同，細胞組分包含至少20、50、100、500、1000、5,000、10,000或20,000種不同的蛋白。
本文所用術(shù)語“蛋白制品”指從抗原細胞、抗原細胞的細胞組分或病毒顆粒獲得的蛋白混合物。蛋白也可由細胞組分如胞漿獲得。蛋白也可以是非胞漿蛋白(如來源于細胞壁、細胞膜或細胞器的蛋白)，或同時具有這兩類蛋白。細胞組分可以包括但不局限于胞漿組分、膜組分及諸如內(nèi)源于細胞核、線粒體、溶媒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等的細胞器組分。蛋白制品可從重組細胞或非重組細胞獲得。這里術(shù)語“抗原蛋白”還包括可能存在于制品中的抗原多肽及抗原肽。從抗原細胞或其細胞組分或病毒顆粒獲得的蛋白制品可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知方法選擇性地從其他非蛋白性物質(zhì)純化至各種程度。蛋白制品可包括至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％存在于抗原細胞或病毒顆?；蚩乖毎M分的不同蛋白及肽。
在一個具體的實施方案中，對蛋白制品沒有使用任何制備方法來選擇性去除或保留抗原細胞中一種或幾種特定蛋白。
在一個具體的實施方案中，蛋白制品為未分離的全部細胞裂解液，可能包含細胞的其他非蛋白性物質(zhì)。在另一具體的實施方案中，蛋白制品為一細胞組分的全部蛋白，該組分沒有經(jīng)過進一步分離或純化，可能包含細胞的其他非蛋白性物質(zhì)。在另一個實施方案中，蛋白制品為病毒顆粒制品的全部蛋白。在具體的實施方案中，蛋白制品包含抗原細胞的全部細胞蛋白、全部胞漿蛋白或全部膜結(jié)合蛋白。在各種實施方案中，蛋白制品包括至少20、50、100、500、1000、5,000、10,000或20,000種不同的蛋白。大部分不同的抗原蛋白存在于抗原細胞的蛋白制品中。而且，蛋白制品中的蛋白在體外與HSPs或α2M形成復(fù)合物前可以進行蛋白酶消化。蛋白制品的蛋白在體外與HSPs或α2M形成復(fù)合物前也可以不進行蛋白酶消化。
為制備抗原細胞或病毒顆粒的蛋白制品，可利用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法實施抗原細胞的裂解或細胞壁、細胞膜、病毒顆粒結(jié)構(gòu)的解體。例如，在各種實施方案中，可用機械切割、超聲、凍融、調(diào)節(jié)細胞周圍滲透壓或各種技術(shù)聯(lián)合的方法裂解抗原細胞。在較不優(yōu)選的實施方案中，可以用諸如變性劑的化學(xué)物質(zhì)裂解抗原細胞。
一旦細胞被裂解，最好是去除細胞碎片、非蛋白性物質(zhì)或不含胞漿和/或膜來源蛋白(包括細胞器膜中的蛋白)的物質(zhì)?？梢杂弥T如低速離心或過濾之類的技術(shù)去除這些成分。細胞碎片及完整的細胞去除后，可進行高速離心將留在上清液的胞漿蛋白和沉積于沉淀中的膜來源蛋白分離?？捎帽绢I(lǐng)域內(nèi)眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法將病毒蛋白人病毒顆粒中提取出來。在一些實施方案中，所用方法不會或不設(shè)計用來選擇性地去除或保留抗原細胞、胞漿或膜中的任意一種或幾種特定蛋白。
在其他實施方案中，來源于抗原細胞的蛋白可通過通常的生化及生物物理性質(zhì)任選地分開來，如大小、電荷或其組合?？捎帽绢I(lǐng)域中任何一種已知技術(shù)實施分離。選擇包含至少20、50、100、500、1000、5,000、10,000或20,000種不同蛋白，或包括至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％存在于抗原細胞或病毒顆?；蚩乖毎M分之不同蛋白及肽的蛋白/肽組分，與HSPs或α2M形成復(fù)合物。
一種用于制備包含胞漿蛋白的蛋白制品的示范性而不是限制性方法如下將細胞懸浮于3倍體積的1×裂解緩沖液中于冰上孵育20分鐘；其中裂解緩沖液包含pH7.5的30mM碳酸氫鈉和1mM PMSF，細胞可以是來源于病人活檢的腫瘤細胞或體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，或是受病原體感染的細胞。然后在一個杜恩斯勻漿器中將低滲-腫脹的細胞勻漿直到超過95％的細胞裂解。作為切割的替代選擇，也可在冰上將細胞超聲至鏡檢超過99％的細胞裂解。使用超聲方法時，在超聲前將細胞懸浮于諸如磷酸鹽緩沖液(PBS)的緩沖液中，其中緩沖液包含1mM PMSF。
裂解液于1000×g離心10分鐘以除去完整的細胞、細胞核及其他細胞碎片。所得上清液在約100,000×g離心約1小時，重新獲得上清液。100,000×g的上清可在4℃用PBS或其他適當(dāng)?shù)木彌_液透析36小時(3次，每次100倍體積)以提供本發(fā)明中可溶的胞漿蛋白。如果需要的話，可通過過濾或低速離心去除制品中的不溶性物質(zhì)。
一種用于制備包含膜來源蛋白的蛋白制品的示范性而不是限制性方法如下將細胞懸浮于3倍體積的1×裂解緩沖液中，于冰上孵育20分鐘；其中裂解緩沖液包含pH7.5的30mM碳酸氫鈉和1mM PMSF，細胞可以是來源于病人活檢的腫瘤細胞或體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，或是受病原體感染的細胞。然后在一個杜恩斯勻漿器中將低滲-腫脹的細胞勻漿直到超過95％的細胞裂解。作為切割的替代選擇，也可在冰上將細胞超聲直到顯微鏡觀察超過99％的細胞裂解。使用超聲方法時，在超聲前將細胞懸浮于諸如磷酸鹽緩沖液(PBS)的緩沖液中，其中緩沖液可包含1mM PMSF。
裂解液于100,000×g離心10分鐘以收集細胞膜。將100,000×g離心沉淀用含1％去氧膽酸鈉(不含Ca2+和Mg2+)的5倍體積PBS溶解，于冰上孵育1小時，這樣就可使膜來源蛋白從脂質(zhì)雙層脫離并得以分離。所得懸液于20,000g離心30分鐘，收集所得上清用數(shù)種不同的PBS(不含Ca2+和Mg2+)透析以除去變性劑。所得透析產(chǎn)物于100,000×g離心90分鐘，將上清進一步純化。然后將鈣和鎂同時加入上清，使其終濃度為2 mM。如果需要的話，可通過過濾或低速離心去除制品中的不溶性物質(zhì)。
在一個具體的實施方案中，從抗原細胞獲得的該組胞漿和/或膜來源蛋白可直接與HSP或α2M形成復(fù)合物而不需蛋白酶處理或任何進一步的提取或選擇步驟。作為替代選擇，蛋白在形成復(fù)合物前可進行蛋白酶處理。
4.2.2、來源于抗原細胞的肽依據(jù)本發(fā)明，可將從抗原細胞獲得的胞漿蛋白或膜來源蛋白選擇性地進行消化以產(chǎn)生抗原肽。在一個實施方案中，將胞漿蛋白或膜來源蛋白進行消化。在另一個實施方案中，消化反應(yīng)中同時使用胞漿蛋白和膜來源蛋白來產(chǎn)生抗原肽。在優(yōu)選實施方案中，用于蛋白酶消化的蛋白制品沒有經(jīng)過任何選擇性地去除或保留抗原細胞、胞漿或膜中的任意一種或幾種特定蛋白的制備步驟。
本發(fā)明中可用各種蛋白酶或蛋白分解酶從抗原細胞的蛋白制品產(chǎn)生一組包含抗原肽的肽。酶消化可以單獨進行，也可與本領(lǐng)域眾所周知的任意蛋白分解酶中聯(lián)用，這些酶包括但不局限于胰酶、葡萄球菌肽酶I(亦稱為V8蛋白酶)、糜蛋白酶、胃蛋白酶、組織蛋白酶G、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶。胰酶是一種切割賴氨酸及精氨酸羧端的特異性絲氨酸蛋白酶。受切割位點的數(shù)目所限，可以預(yù)計會保留許多完整的MHC結(jié)合表位。葡萄球菌肽酶I也是一種絲氨酸蛋白酶，可特異性在谷氨酸及天冬氨酸殘基后進行切割?？捎脝我坏牡鞍酌富虻鞍酌富旌衔飳嵤┣懈?。所用的蛋白酶或蛋白分解酶在該特定酶的合適條件下孵育。優(yōu)選純化的酶。也可用非酶學(xué)方法如溴化氰切割產(chǎn)生肽。要消化的蛋白制品可等分成多份反應(yīng)液，每一反應(yīng)液使用一種不同的酶，所得肽可以任意合在一起使用。在酶反應(yīng)中將蛋白完全消化可能是不必要的。反應(yīng)的結(jié)果是每一種存在于蛋白制品中的蛋白均生成了一組多樣的、不同的肽。不同肽組的生成使得當(dāng)這些肽與HSPs或α2M形成復(fù)合物時產(chǎn)生可誘導(dǎo)針對蛋白制品中抗原之蛋白免疫應(yīng)答的抗原肽更為可能。在一個優(yōu)選實施方案中，要消化的蛋白制品等分成兩份單獨的反應(yīng)液，并用兩種不同的蛋白分解酶從蛋白制品中的蛋白生成兩組不同的肽。根據(jù)蛋白、酶及反應(yīng)條件的不同，反應(yīng)液中可能仍含未消化的蛋白。在一優(yōu)選實施方案中，分別用胰酶和葡萄球菌肽酶I消化蛋白制品。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所用的蛋白分解酶呈現(xiàn)出與蛋白酶體中發(fā)現(xiàn)的蛋白分解活性類似的活性。蛋白酶體負責(zé)將細胞中錯誤折疊或損傷的胞漿或核蛋白進行溶酶體外的內(nèi)催化降解。蛋白酶體可將蛋白最終完全降解成單一氨基酸，也可產(chǎn)生最佳的I類主要組織相容復(fù)合物(MHC I)結(jié)合表位，也可產(chǎn)生更長肽前體，該前體可能在細胞的其他地方進一步修剪成細胞毒T細胞表位。蛋白酶體偏向于切割堿性、酸性及兩性氨基酸的羧基端(COOH)。存在于蛋白酶體中的已知三種蛋白分解酶活性為糜蛋白酶樣活性、胰蛋白酶活性和肽-谷氨酰胺-肽水解活性(Uebel和Tampe，1999，Curr.Opin.Immunol.，112203-208)。這樣，具有如此活性及特異性的酶可以單獨使用或聯(lián)合使用來消化蛋白制品。在一個優(yōu)選實施方案中，使用了胰蛋白酶、糜蛋白酶和/或肽-谷氨酰胺-肽水解酶。
所得肽消化液包括抗原肽、非抗原肽及單一氨基酸殘基。反應(yīng)液也可能包含未消化或未完全消化的抗原蛋白。對本發(fā)明的分解性酶消化液進行監(jiān)測以便產(chǎn)生長度在理想范圍內(nèi)的肽。在一個優(yōu)選實施方案中，所產(chǎn)生的肽約為7個到20個氨基酸殘基。大部分被I類及II類MHC呈遞至T細胞的抗原肽在此范圍內(nèi)。在各種實施方案中，該組肽包括長度在6～21、8～19、10～20或至少7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、45或50個氨基酸殘基的肽。在優(yōu)選實施方案中，抗原肽含有7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸殘基。為監(jiān)測蛋白消化的進度，可進行檢驗反應(yīng)，即從反應(yīng)液中取出蛋白消化液的一小份并通過tricine-聚丙烯酰胺凝膠電泳(“tricine-PAGE”)、高效液相色譜(“HPLC”)或質(zhì)譜、或其他任何本領(lǐng)域內(nèi)已知方法測定肽鏈長度來監(jiān)測消化的進度。利用這樣的檢驗反應(yīng)可以決定在特定條件下什么時候可以產(chǎn)生特定長度范圍的肽鏈片段。其他可控制的反應(yīng)變量包括反應(yīng)中蛋白的量、溫度、孵育持續(xù)時間及輔助因子存在與否，等等。
一旦從一種抗原細胞生成特定長度范圍之肽鏈片段的合適條件得以建立，酶反應(yīng)條件可以可加以復(fù)制以產(chǎn)生可匯合的抗原肽。在肽鏈與HSPs或α2M形成復(fù)合物前宜終止酶消化反應(yīng)。在本發(fā)明的一個實施方案中，可用抑制劑終止酶消化。依據(jù)用于蛋白消化的酶，可用于本發(fā)明的酶抑制劑包括但不局限于PMSF、苯丁抑制素、氨肽酶抑制劑、亮抑酶肽、半胱氨酸蛋白酶抑制劑。大部分蛋白酶的抑制劑在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。此外，另一種終止酶消化的方法是用物理方法將酶從反應(yīng)液去除?？墒顾x酶吸附到固相上，如樹脂或易于通過本領(lǐng)域內(nèi)離心或過濾之類眾所周知的方法除去的物質(zhì)，達到清除該酶的目的。蛋白制品可與固相接觸或流過固相一段時間。這種固定酶可通過商業(yè)途徑購買，或利用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的固定酶的方法生成。
酶消化結(jié)束時，可任選地將這些肽與制品中的低分子物質(zhì)如二肽或單一氨基酸殘基分離開來。例如，可通過離心使肽通過諸如Centriprep-3之類的膜而達到分離目的。任選地，利用其生化和/或生物物理性質(zhì)，如長度、電荷或其組合來分離肽?？捎帽绢I(lǐng)域內(nèi)任何已知技術(shù)來實施分離，從而產(chǎn)生包含至少50、100、500、1000、5,000、10,000、20,000、50,000或100,000種不同肽的消化了的蛋白制品。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，存在于抗原細胞的內(nèi)源肽可單獨用于本發(fā)明中，也可與胞漿蛋白或膜來源蛋白進行分解消化后產(chǎn)生的肽聯(lián)合使用。存在于抗原細胞的內(nèi)源肽包括在體內(nèi)與HSP和/或I類和II類MHC分子形成復(fù)合物的肽。依照本發(fā)明，從抗原細胞直接分離的肽可與HSPs和/或α2M形成復(fù)合物。
在具體的實施方案中，分離過程中使用胞漿蛋白或膜來源蛋白。在另一個實施方案中，分離過程聯(lián)合使用胞漿蛋白和膜來源蛋白。在優(yōu)選實施方案中，分離過程所用的蛋白制品沒有經(jīng)過選擇性地去除或保留抗原細胞、胞漿或膜中任意一種或幾種特定蛋白的方法處理?？乖目芍苯訌募毎牡鞍字破分蟹蛛x而不預(yù)先將抗原肽和HSP或MHC分子的復(fù)合物分離出來。優(yōu)選的蛋白制品包括包含至少20、50、100、500、1000、5,000、10,000或20,000種不同蛋白，或包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％存在于抗原細胞或病毒顆?；蚩乖毎M分之不同蛋白。
在各種實施方案中，該方法包括將蛋白制品用ATP、鹽酸胍處理，和/或?qū)⒌鞍字破繁┞队谒嵝詶l件下，以便可以將蛋白制品中與蛋白相關(guān)的抗原肽如HSPs和I類及II類MHC分子提取出來?？捎枚喾N不同的酸，包括但不局限于三氟乙酸。將肽從HSP-肽復(fù)合物中分離出來的方法在本領(lǐng)域中已是眾所周知，如Menoret等，1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.，262(3)813-8，將其整體在此引入作為參考。也可應(yīng)用諸如Marston和Hartley所述(1990，Meth.Enzymol.，182264-276)之類的本領(lǐng)域內(nèi)已知方法來解離蛋白聚積體。
具體地說，分離過程包括將抗原細胞的蛋白制品與ATP接觸。例如于室溫接觸1小時，和/或用三氟乙酸(TFA)如0.1％TFA處理抗原細胞的蛋白制品。處理優(yōu)選包括在0.1％TFA中對蛋白制品進行超聲。在一個最優(yōu)選實施方案中，蛋白制品先暴露于ATP中，然后在0.1％TFA中超聲。本發(fā)明可在細胞裂解和分離前使用各種蛋白酶抑制劑以防止或減少與HSPs或α2M無內(nèi)源性相關(guān)的細胞蛋白切割。例如，可使用14種蛋白酶抑制劑的混合物2mM的苯甲磺酰氟(PMSF)、1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)、1mM的乙二醇雙(P-氨乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)(均購自Sigma，Louis，MO)及20mg/ml的抗蛋白酶、5mg/ml的苯丁抑制素、20ptg/nil的Chemostatin、20Jig/ml的E64、1ttg/ml的亮抑酶肽、1gg/ml的胃蛋白酶抑制素、40Ag/ml的Pefabloc及10tkg/ml的脫輔蛋白(以上全購自Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。來源于蛋白制品的肽包括至少7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、45或50個氨基酸殘基長度的抗原肽及非抗原肽。分離過程結(jié)束時，優(yōu)選在與HSP或α2M形成復(fù)合物之前將肽從制品中的蛋白分開而加以回收。例如，肽的回收方法包括通過離心使肽通過諸如Centriprep-3之類的膜、真空干燥、反相層析如在BioCad20微分HPLCPoros RH2柱(Persepetive Biosystems，Cambridge，MA)進行分離、在水中用0.1％TFA平衡及用乙腈提取。相應(yīng)地，內(nèi)源性存在于抗原細胞中及從蛋白制品直接分離的抗原肽可與HSPs和/或α2M形成復(fù)合物。此外，包含內(nèi)源性存在于抗原細胞的肽及經(jīng)胞漿和膜來源蛋白消化所得肽的一組混合肽也可與HSPs和/或α2M形成復(fù)合物。
4.3、HSPs和α2M的制備依據(jù)本發(fā)明，來源于抗原細胞的抗原肽與HSPs和/或α2M形成復(fù)合物。本文描述了可用于分離和制備HSPs及α2M的示范性方法。
在本發(fā)明實踐中有用的熱休克蛋白，本文中亦可稱為應(yīng)激蛋白，可以選自滿足下列標(biāo)準(zhǔn)的任何蛋白。當(dāng)細胞暴露于應(yīng)激性刺激劑時該蛋白在細胞內(nèi)的濃度上升，該蛋白能與其他蛋白或肽結(jié)合，在三磷酸腺苷存在的條件下或酸性條件下可釋放所結(jié)合的蛋白或肽；或其與有上述性質(zhì)的細胞蛋白的同源性至少為35％。
熱休克蛋白(HSPs)是最先得以鑒定的應(yīng)激蛋白。正如其名稱所示，HSPs由對熱休克應(yīng)答的細胞所合成。以家族成員的分子量為基礎(chǔ)，至今已鑒定出五大類HSPs。這五大類命名為sHSPs(小熱休克蛋白)、HSP60、HSP70、HSP90、HSP100，其中數(shù)字表示HSPs近似的千道爾頓分子量。除了主要的HSP家族外，一種駐留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白，稱為鈣網(wǎng)蛋白，是另一種熱休克蛋白，當(dāng)它形成復(fù)合物形式的抗原分子時可引發(fā)免疫應(yīng)答(Basu及Srivastava，1999，J.Exp.Med.，189797-202)。其他可在本發(fā)明使用的應(yīng)激蛋白包括但不局限于grp78(或BiP)、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)、HSP 110及grp170(Lin等，1993，Mol.Biol.Cell，41109-1119；Wang等，2001，J.Immunol.，165490-497)。隨后發(fā)現(xiàn)HSP家族中的許多成員可在包括營養(yǎng)剝奪、代謝紊亂、氧自由基、缺氧和細胞內(nèi)病原體感染在內(nèi)的其他應(yīng)激性刺激反應(yīng)中誘導(dǎo)產(chǎn)生(見Welch，1993.5，ScientificAmerican，56-64；Young，1990，Annu.Rev.Immunol.，8401-420；Craig，1993，Science，2601902-1903；Gething等，1992，Nature 35533-45；Lindquist等，1988，Annu.Rev.Genetics 22631-677)，將其內(nèi)容在此引入作為參考?？梢灶A(yù)期屬于這些家族的所有HSPs/應(yīng)激蛋白可在本發(fā)明實踐中使用。
主要HSPs在應(yīng)激細胞內(nèi)蓄積的水平很高，但在非應(yīng)激細胞內(nèi)的蓄積水平為低到中等。舉例來說，正常溫度下強誘導(dǎo)性的哺乳動物HSP70幾乎檢測不到，但在熱休克時則成為合成最為活躍的蛋白之一(Welch等，1985，J.Cell.Biol.，1011198-1211)。相比之下，正常溫度下大部分，但非全部哺乳動物的細胞內(nèi)存在豐富的HSP90及HSP60蛋白，且可進一步被熱刺激所誘導(dǎo)(Lai等，1984，Mol.Cell.Biol.，42802-10；van Bergen en henegouwen等，1987，Genes Dev.，1525-31)。
熱休克蛋白屬于現(xiàn)有最保守的蛋白。例如，DnaK為來自大腸桿菌的HSP70，其氨基酸序列約50％與來自脫皮(excoriates)的HSP70蛋白相同(Bardwell等，1984，Proc Natl.Acad.Sci.，81848-852)。HSP60及HSP90家族也顯示類似的家族內(nèi)高度保守性(Hickey等，1989，Mol.Cell.Biol.，92615-2626；Jindal，1989，Mol.Cell.Biol.，92279-2283)。此外，發(fā)現(xiàn)HSP60、HSP70及HSP90家族由與應(yīng)激蛋白序列相關(guān)但表達水平不因應(yīng)激而改變的蛋白組成，例如其氨基酸有35％以上是完全相同的。因此，本文預(yù)期的熱休克蛋白或應(yīng)激蛋白定義包括氨基酸至少有35％與這三大家族中細胞內(nèi)表達水平在對應(yīng)激性刺激物應(yīng)答時升高之成員相同的其他蛋白、突變蛋白、類似物及其變異體，優(yōu)選有55％至75％氨基酸相同者，最優(yōu)選有75％至85％氨基酸相同者。
在一個實施方案中，HSP-抗原肽復(fù)合物中的HSP部分需要從細胞純化，下文第4.3.～4.3.3部分所描述的示范性純化方法可用于純化HSP-抗原肽復(fù)合物，然后在ATP存在的條件下或酸性條件下使HSPs從內(nèi)源性HSP-抗原肽復(fù)合物分開，隨后在體外與一組抗原肽形成復(fù)合物。見Pen等，1997，J.Immunol.Methods.，20413-21；Li及Srivastava，1993，EMBO J.，123143-3151；將其整體在此引入作為參考。盡管所述的是用于腫瘤細胞，本文所述的方案可用于將HSPs從任何受感染細胞及真核細胞分離出來，如細胞內(nèi)病原體感染的組織、分離細胞或永生細胞，及腫瘤細胞或腫瘤細胞系。
4.3.1、HSP70-肽復(fù)合物的制備及純化HSP70-肽復(fù)合物的純化以前已有描述，例如可見Udono等，1993，J.Exp.Med.，1781391-1396。下文以實施例的方式描述了一種可以使用的方法，但不局限于此。
開始，將腫瘤細胞懸浮于3倍體積的1×裂解緩沖液中，于冰上孵育20分鐘；其中裂解緩沖液包含pH7.5的30mM碳酸氫鈉、1mMPMSF。然后，將沉淀置于冰上超聲，直到鏡檢超過99％的細胞裂解為止。作為超聲的替代選擇，可在杜恩斯勻漿器中用機械切割的方法將細胞勻漿將細胞裂解，直到超過95％的細胞裂解為止。
然后將細胞裂解液于1,000g離心10分鐘以除去未裂解的細胞、細胞核及其他細胞碎片。所得上清液于100,000g離心90分鐘，收集上清液與已用含2mM Ca2+及2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡的Con A瓊脂糖凝膠混合。當(dāng)細胞以機械切割裂解時，在與Con A瓊脂糖凝膠混合前用等體積2×裂解緩沖液稀釋。將上清液于4℃和Con A瓊脂糖凝膠結(jié)合2至3小時。收集不能結(jié)合的物質(zhì)，在pH為7.5、含20mM Tris-乙酸、0.1mM EDTA、10mM NaCl及1mM PMSF的緩沖液中透析36小時(三次，每次100倍體積)。透析液以17,000rpm(Sorvall SS34離心機)的速度離心20分鐘。收集上清液，加到已用pH為7.5、含20mM Tris-乙酸、20mM NaCl、0.1mM EDTA及15mM 2-巰基乙醇的緩沖液平衡的Mono Q FPLC層析柱上。該層析柱以20mM至500mM的NaCl進行濃度梯度洗脫，洗脫的組分通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，用適當(dāng)?shù)目笻SP70抗體(如來自N27F3-4克隆的抗體，產(chǎn)自StressGen)進行免疫印跡加以鑒定。
匯集對抗HSP70抗體具有強免疫應(yīng)答性的組分，用硫酸銨沉淀HSP70-肽復(fù)合物，具體地說是用50％～70％的硫酸銨。以17,000rpm(Sorvall SS34離心機)離心，收集沉淀并用70％硫酸銨洗滌。溶解洗滌后的沉淀，并于SephadexRG24層析柱(Pharmacia)上進行凝膠過濾以除去殘留的硫酸銨。如有必要，由此獲得的HSP70制品可再用上述的Mono Q FPLC層析柱純化。
利用該方法，HSP70-肽復(fù)合物可純化至明顯的均質(zhì)性。典型地說，1g細胞/組織可提純出1mg HSP70-肽復(fù)合物。
改進的HSP70純化方法包括將細胞蛋白與附于固體底物的ATP或其不可水解類似物接觸，以便裂解液中的HSP70可以與ATP或其不可水解類似物結(jié)合，并提取所結(jié)合的HSP70。優(yōu)選的方法使用ATP附于固體基底(如ATP-瓊脂糖)的柱層析。所得HSP70制品純度更高，不含污染肽。HSP70的收率也顯著提高，約大于10倍。
此外，用ADP不可水解類似物代替ATP的層析方法來純化HSP70-肽復(fù)合物。舉例來說，但不限于此，按下述方法通過ATP-瓊脂糖層析純化不含肽的HSP70Meth A肉瘤細胞(500萬個細胞)在低滲緩沖液中勻漿，裂解液在4℃于100,000g離心90分鐘。上清液加至ATP-瓊脂糖柱。該柱在緩沖液中洗滌，并用5倍于柱容積的3mM ATP洗脫。在總數(shù)為15級份的洗脫液中，HSP70在第2至第10級級分中得以洗脫。所洗脫的級分通過SDS-PAGE分析。HSP70可用本方法純化至明顯的均質(zhì)性。
4.3.2、HSP90-肽復(fù)合物的制備及純化下文以實施例的方式描述了一種可以使用的方法，但不局限于此。
首先將腫瘤細胞懸浮于3倍體積的1×裂解緩沖液中；其中裂解緩沖液包含30mM碳酸氫鈉和1mM PMSF，pH7.5。然后，將沉淀置于冰上超聲，直到鏡檢超過99％的細胞裂解為止。作為超聲的替代選擇，可在杜恩斯勻漿器中用機械切割的方法將細胞勻漿，直到超過95％的細胞裂解為止。
然后將細胞裂解液于1,000g離心10分鐘以除去未裂解的細胞、細胞核及其他細胞碎片。所得上清液于100,000g離心90分鐘，收集上清液與已用含2mM Ca2+及2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡的Con A瓊脂糖凝膠混合。當(dāng)細胞以機械切割裂解時，在與Con A瓊脂糖凝膠混合前用等體積2×裂解緩沖液稀釋。將上清于4℃和ConA瓊脂糖凝膠結(jié)合2至3小時。收集不能結(jié)合的物質(zhì)在pH為7.5、含20mM Tris-乙酸、0.1mM EDTA、10mM NaCl及1mM PMSF的緩沖液中透析36小時(三次，每次100倍體積)。透析液以17,000rpm(Sorvall SS34離心機)的速度離心20分鐘。收集上清液，加到已用pH為7.5、含20mM Tris-乙酸、20mM NaCl、0.1mM EDTA及15mM2-巰基乙醇的緩沖液平衡的Mono Q FPLC層析柱上。該層析柱用20mM至500mM的NaCl進行鹽濃度梯度洗脫。
洗脫的級分用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，用適當(dāng)?shù)目笻SP70抗體，如3G3(Affinty Bioreagents)對含HSP90-肽復(fù)合物進行免疫印跡加以鑒定。利用該方法，HSP90-肽復(fù)合物可純化至明顯的均質(zhì)性。典型地說，1g細胞/組織可提純出150μg～200μg HSP70-肽復(fù)合物。
4.3.3、GP96-肽復(fù)合物的制備及純化下文以實施例的方式描述了一種可以使用的方法，但不局限于此。
首先將腫瘤塊懸浮于3倍體積的1×裂解緩沖液中，置冰上孵育20分鐘使細胞脹大；其中裂解緩沖液包含的30mM碳酸氫鈉和1mMPMSF，pH7.5。然后，將腫瘤塊置于杜恩斯勻漿器(依據(jù)各型號不同勻漿器合適的清除率各不相同)中勻漿直到超過95％的細胞裂解為止。
然后將細胞裂解液于1,000g離心10分鐘以除去未裂解的細胞、細胞核及其他細胞碎片。所得上清液于100,000g離心90分鐘。gp96-肽復(fù)合物可從100,000g離心后的沉淀中純化，也可從離心上清液中純化。
當(dāng)從上清液純化時，上清液用等體積2×裂解緩沖液稀釋。將上清液于4℃和Con A瓊脂糖凝膠結(jié)合2至3小時。將混懸液加到層析柱上，用1×裂解緩沖液洗滌，直到OD280降至基線。將1/3柱床體積的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)溶于含2mM Ca2+及2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖液中，洗滌層析柱。然后用一片石蠟?zāi)し庵?，?7℃孵育15分鐘。將柱涼至室溫，從柱底部移去石蠟?zāi)?。?倍柱容積的α-MM緩沖液加至層析柱并洗脫，洗脫液通過SDS-PAGE分析。典型地說，所得物質(zhì)的純度約為60％～95％，但純度隨細胞類型及所用組織裂解液的不同而不同。然后將樣品上樣到已用含5mM磷酸鈉、pH7的緩沖液平衡的Mono Q FPLC層析柱(Pharmacia)。用0～1M的NaCl濃度梯度將蛋白從層析柱洗脫下來，gp96級分于NaCl濃度為440mM～550mM時洗脫。
但是可通過兩個額外的步驟對此法加以改進，以便始終產(chǎn)生明顯均一的gp96-肽復(fù)合物?？墒褂萌我庖徊交騼刹酵瑫r使用。一個可選擇的步驟包括在Con A純化步驟前進行硫酸銨沉淀，另一個可選擇的步驟包括在Con A步驟之后、Mono Q FPLC步驟之前進行DEAE-瓊脂糖凝膠純化。
如下文以實施例方式所述的第一步可選擇步驟中，往100,000g離心步驟所獲得上清液中加入硫酸銨至終濃度為50％。裝溶液的燒杯置于冰水浴槽內(nèi)，硫酸銨需緩慢加入，同時輕輕攪拌溶液。溶液于4℃攪伴約0.5～12小時，然后以6000rpm(Sorvall SS34離心機)離心。取上清，加入硫酸銨溶液使硫酸銨飽和度達到70％，以6000rpm(Sorvall SS34離心機)離心。取沉淀，懸于含70％硫酸銨的PBS洗滌?；旌衔镆?000rpm(Sorvall SS34離心機)離心，沉淀溶于含2mMCa2+及2mM Mg2+的PBS中。以15,00rpm(Sorvall SS34離心機)稍離心除去未溶解的物質(zhì)。所得溶液與Con A瓊脂糖凝膠混合，以下步驟與前面方法相同。
如下文以實施例方式所述的第二步可選擇步驟中，將從Con A層析柱洗脫下來的級分中含有g(shù)p96的級分匯集，將該緩沖液用透析方法與pH為7的、含5mM磷酸鈉緩沖液和300mM NaCl的緩沖液進行交換，優(yōu)選在Sephadex G25層析柱上進行緩沖液交換。緩沖液交換后，將溶液與預(yù)先用pH為7的、5mM磷酸鈉緩沖液、300mM NaCl平衡的DEAE-瓊脂糖凝膠混合。蛋白溶液及磁珠輕輕地混合1小時，裝入層析柱。用pH為7的5mM磷酸鈉緩沖液、700mM NaCl洗柱，到280nm處的吸光度回落至基線為止。然后用5倍容積的pH為7的5mM磷酸鈉緩沖液、700mM NaCl將所結(jié)合的蛋白洗脫下來。匯集含蛋白的級分，用pH為7的5mM磷酸鈉緩沖液稀釋，使鹽濃度降至175mM。所得物質(zhì)上樣到預(yù)先用pH為7的5mM磷酸鈉緩沖液平衡的Mono Q FPLC層析柱(Pharmacia)，用前述方法將結(jié)合至Mono QFPLC層析柱(Pharmacia)的蛋白洗脫下來。
然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可能利用常規(guī)的實驗來評估將第二個可選步驟引入純化方案的效益，這是可以理解的。此外，加入每一個可選步驟所帶來的效益依起始材料的不同而不同，這也是可以理解的。
gp96組分從100,000g離心沉淀分離后，將沉淀懸于含1％去氧膽酸鈉或1％oxtyl吡喃葡萄糖苷(但不含Ca2+及Mg2+)的5倍體積PBS中，置冰上孵育1小時。懸液于20,000g離心30分鐘，所得上清液用PBS(也不含Ca2+及Mg2+)透析交換數(shù)次以除去變性劑。透析液于100,000g離心90分鐘，收集上清液，加入鈣離子或鎂離子使其終濃度分別為2mM。根據(jù)從100,000g離心上清液分離gp96-肽復(fù)合物的未改進方法或改進方法來純化樣品，方法見前文。
利用本方法，gp96-肽復(fù)合物可純化至明顯的均質(zhì)性。典型地說，1g細胞/組織可提純出10μg～20μg gp96。
4.3.4、α2M的制備及純化α2-巨球蛋白可通過商業(yè)途徑購買或從人類血液中提純、制備?？衫孟挛囊詫嵤├绞矫枋龅?、不具有限制性的實驗方案純化血液來源的α2M從受試者采集血液，讓其凝結(jié)成塊。以14,000g離心30分鐘以獲得血清。將血清上樣到已用pH為7.6的0.04M Tris緩沖液及0.3mmM NaCl平衡的凝膠過濾層析柱(Sephacryl S-300R)。血清量約為10ml時需用65ml的層析柱。收集3ml為一級分，對各級分用α2M特異性抗體進行點印跡來檢驗α2M的存在與否。匯集α2M陽性的級分，上樣到PD10層析柱以便將緩沖液與含PMSF的、PH為7.5的0.01M磷酸鈉緩沖液進行交換。然后將匯集的級分上樣到已用磷酸鹽緩沖液平衡的Con A層析柱(10ml)。洗柱，用5％甲基甘露糖吡喃糖苷進行洗脫。洗脫液流過PD10層析柱以便將緩沖液與醋酸鈉緩沖液(0.05mM；pH6.0)進行交換。將DEAE層析柱用醋酸緩沖液平衡，然后將樣品上樣到該層析柱。洗柱，用0.13M的醋酸鈉將蛋白洗脫。匯集含α2M的組分。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，用本方法可將α2M純化至明顯的均質(zhì)性。
4.3.5、熱休克蛋白及α2M的重組表達在本發(fā)明的一些實施方案中，可從高水平表達HSPs及α2M的細胞中制備HSPs及α2M，這些細胞是通過重組方法而得到的。許多HSPs及α2M的氨基酸序列和核苷酸序列通?？蓮男蛄袔飓@得，如GenBank?？墒褂糜嬎銠C程序，如Entrez等來瀏覽數(shù)據(jù)庫，并通過登記號來檢索任意感興趣的氨基酸序列及核苷酸序列。也可利用諸如FASTA及BLAST之類的程序搜索該數(shù)據(jù)庫以鑒定及查詢有著不同程度相似性的序列，這些程序以序列對比得分及統(tǒng)計將相似的序列分級。這類可用于本發(fā)明的組合物、方法和HSP-肽復(fù)合物制備的HSPs核苷酸序列的非限制性實例如下人HSP70，GenBank登記號No.M24743，Hunt等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，826455-6489；人HSP90，GenBank登記號No.X15183，Yamazaki等，Nucl.Acids Res.，177108；人gp96，GenBank登記號No.X15187，Maki等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，875658-5562；人BipGenBank登記號No.M19645；Ting等，1988，DNA，7275-286；人HSP27，GenBank登記號No.M24743；Hickey等，1986，Nucleic AcidsRes.144127-45；小鼠HSP70GenBank登記號No.M 35021，Hunt等，1990，Gene，87199-204；小鼠gp96，GenBank登記號No.M16370，Srivastava等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，853807-3811；及小鼠BiPGenBank登記號No.U16277，Haas等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，852250-2254。也可使用編碼HSPs的簡并序列。
本文中術(shù)語“α2M”包括α2M的其他多肽片段、類似物及變異體，它們與α2M至少有35％至55％，優(yōu)選55％至75％，最優(yōu)選有75％至85％氨基酸相同性，可與抗原肽形成復(fù)合物，抗原呈遞細胞可攝取該復(fù)合物并激發(fā)針對該抗原分子的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的α2M分子可通過商業(yè)途徑購買、從天然來源提純而得(Kurecki等，1979，Anal.Biochem.，99415-420)、化學(xué)合成或重組產(chǎn)生?？捎糜谥苽浔景l(fā)明α2M多肽的非限制性α2M核苷酸序列實例如下GenBank登記號Nos.M11313、P01023、AAA51551；Kan等，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.，822282-2286。也可使用編碼α2M的簡并序列。
一旦編碼所選HSPs或α2M的核苷酸序列得以鑒定，則可獲得該核苷酸序列或其片段，并將之克隆到用于重組表達的表達載體中。然后將表達載體引入宿主細胞使HSPs或α2M增殖。本文詳細描述了HSPs或α2M的重組生產(chǎn)方法。
可以利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)(例如參見《酶學(xué)方法》，1987，第154卷，Academic出版社；Sambrook等，1989，分子克隆-實驗手冊，第二版，Cold Spring Harbor出版社，New York，及Current protocolsin molecular biology，Ausubel等編，Greene Publishing Associates andWiley Inerscience，New York。將其整體在此引入作為參考。)，通過DNA擴增或直接從組織、細胞培養(yǎng)物或克隆的DNA(如DNA文庫)進行分子克隆而獲得所需DNA。除了編碼區(qū)處，來源于基因組DNA的克隆還可能包含調(diào)控區(qū)及內(nèi)含子DNA區(qū)；來源于cDNA的克隆則只含外顯子序列。不管采用何種來源，HSPs或α2M基因應(yīng)該克隆到一個用于基因增殖的合適載體中。
在一個優(yōu)選實施方案中，可利用從相關(guān)或內(nèi)源性HSPs或α2M已知序列設(shè)計的引物和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增技術(shù)從基因組或cDNA擴增得到DNA。在篩選前，用PCR擴增DNA克隆或基因組文庫或cDNA文庫中的所需序列。例如，可利用熱循環(huán)儀和Taq聚合酶(GeneAmp)實施PCR。通常通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來獲得感興趣的基因或基因片段。例如，利用編碼開放閱讀框的核苷酸序列兩側(cè)的PCR引物可以獲得任意目標(biāo)長度的、編碼HSPs或α2M的核苷酸序列。此外，如果存在合適的切割位點，可用限制性內(nèi)切酶在HSPs或α2M基因序列合適的位點切割使編碼HSPs或α2M的DNA片段釋放出來。如果適宜的限制性位點不存在，可利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的定點突變和/或DNA擴增方法在合適的位置產(chǎn)生這樣的位點(例如，可見Shankarappa等，1992，PCR Method Appl.，1277-278)。然后分離編碼HSPs或α2M的DNA片段，將其接入合適的表達載體，小心操作以確保合適的翻譯閱讀框得以保持。
在另一個實施方案中，為了從基因組DNA進行HSPs或α2M基因的分子克隆，從基因組文庫產(chǎn)生DNA片段。既然一些編碼相關(guān)HSPs或α2M的序列可以獲得并可以純化、標(biāo)記，可通過與標(biāo)記探針進行核酸雜交來篩選基因組DNA文庫中所克隆的DNA片段(Benton及Davis，1977，Science，196180；Grunstein及Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，723961)。與探針具有基本同源性的DNA片段將發(fā)生雜交。也可用限制性酶消化，及將片段大小與依據(jù)已知限制性酶切圖譜預(yù)測之片段相比，來鑒定合適的片段。
HSPs或α2M基因組的替代性分離方法包括但不局限于從已知序列化學(xué)合成基因序列本身，或合成編碼HSPs或α2M的mRNA所對應(yīng)的cDNA。例如，用于HSPs或α2M cDNA基因克隆的RNA可以從表達HSPs或α2M的細胞分離。利用本領(lǐng)域中已知方法構(gòu)建cDNA文庫并用例如已公布的基因組DNA文庫篩選方法進行篩選。如果針對該HSPs或α2M的抗體可獲得，則將標(biāo)記抗體與合成HSPs或α2M的克隆相結(jié)合而鑒定HSPs或α2M。
下面以實施例方式但不加限制地描述了其他克隆編碼HSPs或α2M的核苷酸序列的具體實施方案在一個具體的實施方案中，將包含編碼HSPs或α2M核苷酸序列的探針在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的各種嚴(yán)格條件(包括那些種屬交叉雜交的情況)下進行雜交而鑒定和獲得編碼HSPs或α2M的核苷酸序列。
可用本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的突變技術(shù)修飾DNA序列中的一個核苷酸，以在所表達的肽序列中產(chǎn)生氨基酸替換，或生成/刪除限制性位點以方便進一步的操作。這類技術(shù)包括但不局限于化學(xué)誘變、體外定點誘變(Hutchinson等，1978，J.Biol.Chem.，2536551)、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變(Smith，1985，Ann.REv.Genet.，19423-463；Hill等，1987，Methods Enzymol.，155558-568)、基于PCR的重疊延伸(Ho等，1989，Gene，7751-59)、基于PCR的兆引物突變(Sarkar等，1990，Biotechniques，8404-407)，等等。可用雙鏈雙脫氧核苷酸DNA測序法確認修飾成功與否。
在一些實施方案中，使用編碼非分泌型HSP的分泌形式的核酸來實踐本發(fā)明中的方法?？梢郧谐鼸R駐留信號——KDEL的編碼序列來構(gòu)建這種核酸?？蛇x擇的是，用分子標(biāo)記代替編碼KDEL的序列以促進HSP的識別和純化，如鼠IgG1的Fc部分。在另一個實施方案中，在天然分泌的HSPs或α2M中加入分子標(biāo)記。No.WO99/42121的PCT出版物說明gp96的ER駐留信號缺失導(dǎo)致gp96-Ig肽復(fù)合物從轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞中分泌，KDEL缺失的gp96與鼠IgG1的融合促進其通過ELISA及FACS分析檢測，利用蛋白A輔助的親合層析純度也得以改進。
4.3.5.1、表達系統(tǒng)編碼HSPs或α2M的核苷酸序列可以插入表達載體，在重組細胞中得以增殖和表達。本文中表達構(gòu)建體指合適的宿主細胞中與一種或幾種調(diào)控區(qū)操縱性相關(guān)、編碼HSPs或α2M的一段核苷酸序列。
“操縱性相關(guān)”指調(diào)控區(qū)和需表達的HSPs或α2M多肽序列以這樣一種相關(guān)的方式相連并定位，以保證持續(xù)轉(zhuǎn)錄并最終翻譯該HSPs或α2M序列。用于HSPs或α2M表達的表達載體的種類包括但不局限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、噬菌?；蚋牧疾《?。實例包括細菌噬菌體如λ-衍生物，質(zhì)粒如pBR322或pUC質(zhì)粒衍生物，或Bluescript載體(Stratagene)。典型地說，這樣的載體包括一個使載體在宿主細胞中繁殖的功能性復(fù)制起點、一個或多個用于插入HSPs或α2M基因序列的限制性內(nèi)切酶位點及一個或多個選擇標(biāo)記。
為在哺乳動物宿主細胞中表達HSPs或α2M，可使用各種調(diào)控區(qū)，例如SV40早啟動子及晚啟動子、巨細胞病毒(CMV)即早啟動子和勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列(RSV-LTR)啟動子?？捎糜诓溉閯游锏目烧T導(dǎo)啟動子包括但不局限于金屬硫蛋白II基因、小鼠乳腺腫瘤病毒糖皮質(zhì)激素基因反應(yīng)性長末端重復(fù)序列(MMTV-LTR)、β-干擾素基因及HSP70基因相關(guān)的啟動子(Williams等，1989，CancerRes.，492735-42；Taylor等，1990，Mol.Cell.Biol.，10165-75)。在表達載體中包含合適的轉(zhuǎn)錄增強子可提高HSPs或α2M在宿主細胞中的表達效率，如在SV40病毒、B型肝炎病毒、巨細胞病毒、免疫球蛋白基因、金屬硫蛋白及β肌動蛋白中發(fā)現(xiàn)的增強子(見Bittner等，1987，Methods in Enzymol.，153516-544；Gorman，1990，Curr.Op.in Biotechnol.，136-47)。
表達載體也可包含使載體在不止一種宿主細胞中維持和復(fù)制的序列，或?qū)⑤d體整合入宿主染色體的序列。這樣的序列可包括但不局限于復(fù)制起點、自我復(fù)制序列(ARS)、著絲點序列及端粒DNA。使用可在至少兩種宿主細胞內(nèi)復(fù)制與維持的穿梭載體也可能是一大優(yōu)勢。
另外，表達載體可能包含用于包含編碼HSPs或α2M的DNA的宿主細胞初步分離或鑒定的可選擇或篩選標(biāo)記基因。為了長期、高產(chǎn)率生產(chǎn)HSPs或α2M，優(yōu)選將這些蛋白在哺乳動物細胞穩(wěn)定表達。大量可用于哺乳動物細胞的選擇系統(tǒng)包括但不局限于皰疹單純病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell，11223)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalski及Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，482026)和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980，Cell，11223)；這些基因可分別用于tk、hgprt或aprt細胞。也可根據(jù)下列對抗代謝藥的耐藥性進行選擇，如對氨甲蝶呤產(chǎn)生耐藥性的二氫葉酸還原酶(dhfr)(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.U.S.A.，773567；O’hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.，781527)、對霉酚酸產(chǎn)生耐藥性的gpt(Mulligan及Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，782072)、對氨基糖甙G-418產(chǎn)生耐藥性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.，1501)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)、對潮霉素產(chǎn)生耐藥性(Santerre等，1984，Gene，30147)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hyg)。還可使用其他可選擇的標(biāo)記，例如但不限于組氨醇及ZeocinTM。
包含編碼HSP或α2M的序列、與調(diào)控區(qū)操縱性相關(guān)的表達構(gòu)建體可直接導(dǎo)入用于表達及生產(chǎn)本發(fā)明HSPs或α2M復(fù)合物的合適細胞中，而不需進一步克隆(例如可見No.5,580,859號美國專利)。表達構(gòu)建體也可包含促進編碼序列整合入宿主細胞基因組的DNA序列，例如通過同源重組而整合。在此實例中，不必使用包含適合于合適宿主細胞的復(fù)制啟動起點的表達載體以在宿主細胞中增殖和表達HSP或α2M分子。
可利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種技術(shù)將包含所克隆的編碼HSP或α2M序列的表達構(gòu)建體導(dǎo)入哺乳動物宿主細胞，這些方法包括但不局限于磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，1977，Cell，11223-232)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Schaefer-Ridder等，1982，Science，215166-168)、電穿孔(Wolff等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.，843344)及微注射法(Cappechi，1980，Cell，22479-488)。
本文所述的任何克隆載體或表達載體可利用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法從已知的DNA序列合成。調(diào)控區(qū)及增強子元件可從各種來源獲得，可以是天然的也可以是合成的。一些載體及宿主細胞可通過商業(yè)途徑獲得。Current Protocols in Molecular Biology第二版中附錄5中描述了可使用載體的非限制性實例，該書由Ausubel等于1988年編著，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience出版，將其整體在此引入作為參考。這些實例也可在商業(yè)供應(yīng)商的目錄內(nèi)找到，如ClontechLaboratories、Stratagen Inc.及Invitrogen Inc.。
此外，哺乳動物細胞也可利用一些基于病毒的表達系統(tǒng)來重組表達HSPs或α2M。使用DNA病毒骨架的載體來自于猿病毒40(SV40)(Hamer等，1979，Cell，17725)、腺病毒(Van Doren等，1988，J.Virol.，621963)及牛乳頭狀瘤病毒(Zinn等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.，794879)。在腺病毒作為表達載體的情況下，可將供體DNA序列連接入腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制區(qū)如晚啟動子和三葉形前導(dǎo)序列。然后用體外或體內(nèi)重組的方法將嵌合基因插入腺病毒基因組。插入到病毒基因組非必需區(qū)(如E1或E3區(qū))時得到可存活的重組病毒，并能在感染細胞中表達異源產(chǎn)物(例如見Logan及Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，813655-3659)。
牛乳頭狀瘤病毒(BPV)可感染包括人類的許多高級脊椎動物，它以附加體的形式進行DNA復(fù)制。已發(fā)現(xiàn)許多穿梭載體用于重組基因表達，其以穩(wěn)定的多拷貝(每個細胞有20～300拷貝)染色體外元件在哺乳動物細胞內(nèi)存在。典型地說，這些載體包含一段BPV DNA(整相基因組或69％轉(zhuǎn)化片段)、具廣譜宿主的啟動子、聚腺苷酸化信號、剪接信號、選擇性標(biāo)記及可使載體在大腸桿菌內(nèi)繁殖的“無毒”質(zhì)粒序列。在細菌中構(gòu)建及擴增后，表達性基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的哺乳動物細胞，如利用磷酸鈣共轉(zhuǎn)化或電穿孔技術(shù)。對于那些不顯示轉(zhuǎn)化表型的宿主細胞而言，可利用顯性選擇標(biāo)記如組氨醇及G418耐藥性來選擇轉(zhuǎn)化體。例如，諸如可使用pBCMGSNeo及pBCMGHis之類的BPV載體來表達HSPs或α2M(Karasuyama等，Eur.J.Immunol.，1897-104；Ohe等，Human Gene Therapy，6325-33)，將其轉(zhuǎn)化多種細胞實現(xiàn)HSPs或α2M的表達。
此外，在使用人宿主細胞時可使用牛痘的7.5K啟動子(例如，可見Mackett等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，797415-7419；Mackett等，1984，J.Virol.，49857-864；Panicali等，1982，Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.，794927-4931)，也可使用基于EB病毒(EBV)起點(OriP)及EBV核抗原1(EBNA-1，一種反式作用復(fù)制因子)的載體。這樣的載體可使用廣泛的人宿主細胞，如EBO-pCD(Spickofsky等，1990，DNA Prot.Eng.Tech.，214-18)、pDR2及λDR2(可從Clontech Laboratories獲得)。
也可用基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達系統(tǒng)來達到重組HSP或α2M表達的目的。與轉(zhuǎn)化相比，逆轉(zhuǎn)錄病毒可有效感染并將基因轉(zhuǎn)移入廣泛的細胞類型，舉例來說，包括原代造血細胞。在諸如莫洛尼氏鼠白血病毒之類的逆轉(zhuǎn)錄病毒中，大部分病毒基因序列可以去除并取代為編碼HSP或α2M的序列，所喪失的病毒功能可以反式(in trans)提供。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感染宿主范圍也可通過選擇用于包裝的包膜來控制。
例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以包括5’長末端重復(fù)序列(LTR)、3’LTR、包裝信號、細菌復(fù)制起點及選擇標(biāo)記。ND-相關(guān)的抗原肽DNA插入5’LTR和3’LTR間的位置，以便自5’LTR的轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄所克隆的基因。5’LTR按順序含有一個包括但不限于LTR啟動子的啟動子、R區(qū)、U5區(qū)及引物結(jié)合位點。這些LTR元件的核苷酸序列在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。表達載體也可包含異源啟動子及多個藥物選擇標(biāo)記以利于感染細胞的選擇(見McLauchlin等，1990，Nucleic Acid Res.183587-3596；Choulika等，1996，J.Virol.，701792-1798；Boesen等，1994，Biotherapy 6291-302；Salmons和Gunzberg，1993，Human GeneTherapy，4129-141；及Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.inGenetics and Devel.，3110-114)。
重組細胞可在標(biāo)準(zhǔn)的溫度、孵育時間、光密度及培養(yǎng)基條件下進行培養(yǎng)。此外，細胞也可在仿效內(nèi)源性表達HSP的細胞所需的營養(yǎng)及生理需求條件下培養(yǎng)。改進的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基可用于增強HSP-肽復(fù)合物的產(chǎn)生。例如，重組細胞可在促進誘導(dǎo)性HSP表達的條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明的α2-巨球蛋白及HSP多肽可以融合蛋白的形式表達，以利于其從所表達的細胞中回收和純化。例如，HSP或α2M多肽可包含信號序列前導(dǎo)肽以引導(dǎo)其轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，從而分泌入培養(yǎng)基中。另外，HSP或α2M多肽可包含親和標(biāo)記，例如與HSP或α2M多肽中不參與和抗原肽結(jié)合的任何部分如羧基端相融合的親和標(biāo)記。該親和標(biāo)記可通過結(jié)合親和伴侶分子而促進蛋白的純化。
產(chǎn)生這類融合蛋白的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。導(dǎo)致融合蛋白產(chǎn)生的操作可在基因或蛋白水平上發(fā)生，優(yōu)選于基因水平上發(fā)生。例如，可利用本領(lǐng)域大量已知重組DNA方法中的任意方法對克隆的HSP或α2M多肽編碼區(qū)進行改造(Sambrook等，1990，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York；Ausubel等，Current protocols in Molecular Biology第8章，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NewYork)。將替換、缺失、插入或其任意組合引入或組合以達到最終的編碼HSP或α2M多肽的核苷酸序列，下文的討論將會使這一點變得直觀。
在各個實施方案中，包含HSP或α2M多肽的融合蛋白可以用重組DNA技術(shù)來制備。例如，編碼HSP或α2M多肽的重組基因的構(gòu)建包括將位于合適開放閱讀框內(nèi)的HSP或α2M多肽片段插入含親和標(biāo)記的載體中，使HSP或α2M多肽以肽-標(biāo)記融合蛋白的方式表達?？杀惶禺愋越Y(jié)合伴侶所識別的親和標(biāo)記可用于HSP或α2M多肽的親和層析純化。
在一個優(yōu)選實施方案中，親和標(biāo)記氨基端融合入HSP或α2M的羧基端。羧基端融合的精確位點并不關(guān)鍵。最佳位點可通過常規(guī)實驗確定。
可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種親和標(biāo)記，例如免疫球蛋白保留區(qū)、多聚組氨酸序列(Petty，1996，Current Protocols in Molecular Biology中的Metal-chelate affinity chromatography，第2卷，Ausubel等編著，Greene Publish.Assoc. & Wiley Interscience)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST；Smith，1993，Methods Mol.Cell Bio.，4220-229)、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(Guan等，1987，Gene，6721-30)及各種纖維素結(jié)合域(No.5,496,935、No.5,202,247、No.5,137,819號美國專利；Tomme等，1994，Protein Eng.，7117-123)，等等。其他親和標(biāo)記可賦予HSP或α2M多肽熒光特征，如綠色熒光蛋白部分等等。其他可能的親和標(biāo)記為可購得相應(yīng)單克隆抗體的短氨基酸序列，如下列這些眾所周知的實例FLAG表位、408～439位氨基酸的myc表位、流感病毒血凝素(HA)表位，但不局限于此。其他親和標(biāo)記可用特異性結(jié)合伴侶識別，和固定于固體支持物上的結(jié)合伴侶的親和結(jié)合促進其分離。一些親和標(biāo)記可賦予HSP或α2M多肽全新的結(jié)構(gòu)特性，如形成多聚體的能力。HSP或α2M多肽與所結(jié)合的肽形成二聚體，可提高抗原呈遞過程中HSP或α2M多肽與其伴侶相互作用的親和力。這些親和標(biāo)記通常來源于正常時以同聚體存在的蛋白。諸如CD8細胞外結(jié)構(gòu)域(Shiue等，1988，J.Exp.Med.，1681993-2005)、CD28細胞外結(jié)構(gòu)域(Lee等，1990，J.Immunol.，145344-352)、免疫球蛋白分子中含絞鏈二硫鍵部分的親和標(biāo)記可導(dǎo)致多聚體的形成。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可用許多方法獲取前面提及的親和標(biāo)記的編碼區(qū)，包括但不限于DNA克隆、DNA擴增及合成方法。通過商業(yè)途徑可獲得一些親和標(biāo)記及其檢測、分離的試劑。
優(yōu)選的親和標(biāo)記為免疫球蛋白分子的非可變部分。典型地說，該部分包含至少一個功能性可操作的免疫球蛋白重鏈不變區(qū)的CH2及CH3域。也可用不變區(qū)Fc部分、緊接重鏈或輕鏈CH1區(qū)氨基端之后的區(qū)域來制備融合體?？蓮腎gG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM獲得以免疫球蛋白為基礎(chǔ)的合適親和標(biāo)記，但優(yōu)選IgG1。當(dāng)計劃將HSP或α2M多肽在人體內(nèi)使用時，優(yōu)選人免疫球蛋白。許多編碼免疫球蛋白輕鏈或重鏈不變區(qū)的DNA是已知的，或可從cDNA文庫獲得。例如，可見Adams等，Biochemistry，1980，192711-2719；Gough等，Biochemistry，1980，192702-2710；Dolby等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，776027-6031；Rice等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，797862-7865；Falkner等，1982，Nature，298286-288；和Morrison等，1984，Ann.Rev.Immunol，2239-256。因為許多免疫學(xué)試劑及標(biāo)記系統(tǒng)可用于檢測免疫球蛋白，所以用本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種免疫學(xué)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸收測定、免疫共沉淀、熒光激活的細胞分選(FACS)等，可以很容易地檢測HSP或α2M多肽-Ig融合蛋白并加以定量。類似地，如果親和標(biāo)記是易獲得抗體的表位，這些試劑也可在上述提及的對含親和標(biāo)記的HSP或α2M多肽進行檢測、定量及分離的技術(shù)中使用。在許多實例中，不需要研發(fā)針對HSP或α2M多肽的特異性抗體。
一個優(yōu)選的實施方案是將HSP或α2M多肽與人免疫球蛋白G-1(IgG-1，見Bowen等，1996，J.Immunol.，156442-49)的鉸鏈區(qū)、CH2及CH3域形成融合蛋白。該鉸鏈區(qū)含有三個半胱氨酸殘基，其在正常情況下與Ig分子中其他半胱酸形成二硫鍵。由于三者中任何一個都不是肽的標(biāo)記功能所必需的，因而可選擇性地用其他氨基酸殘基替換其中的一個或多個半胱氨酸殘基，如用絲氨酸代替。
可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種前導(dǎo)序列使細胞及哺乳動物細胞有效分泌HSP或α2M多肽(von Heijne，1985，J.Mol.Biol.，18499-105)。前導(dǎo)序列的選擇基于計劃所用的宿主細胞，可包括細菌、酵母、病毒、動物及哺乳動物的序列。用于哺乳動物的優(yōu)選前導(dǎo)肽可從小鼠免疫球蛋白κ鏈獲得(Bernard等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.，785812-5816)。用于在細菌細胞靶向HSP或α2M多肽表達的優(yōu)選前導(dǎo)序列包括但不局限于大腸桿菌蛋白OmpA(Hobom等，1995，Dev.Bio.Stand.，84255-262)、Pho A(Oka等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci，827212-16)、OmpT(Johnson等，1996，Protein Expression 7104-113)、Lamb和OmpF(Hoffman及Wright，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，825107-5111)、β-內(nèi)酰胺酶(Kadonaga等，1984，J.Biol.Chem.，2592149-54)、腸毒素(Morioka-Fujimoto等，1991，J.Biol.Chem.，266-1728-32)、金黃色葡萄球菌蛋白A(Abrahmsen等，1986，NucleicAcids Res.，147487-7500)、B.subtilis內(nèi)切葡聚糖酶(Lo等，Appl.Environ.Microbiol.，542287-2292)的前導(dǎo)肽，以及人工合成信號序列(MacIntyre等，Mol.Gen.Genet.，221446-74；Kaiser等，1987，Science，235312-317)。
編碼所需親和標(biāo)記或前導(dǎo)肽的DNA序列，只要易于從文庫獲得、人工合成或從商業(yè)供應(yīng)商獲得，均適宜在本發(fā)明實踐中使用。這些方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。
4.4蛋白及肽與HSP或α2M復(fù)合本文所描述的是用于在體外將HSP或α2M與一組蛋白和/或肽形成復(fù)合物的示范性方法，其中這些蛋白和/或肽從抗原細胞或其組分、病毒顆粒制備。該組蛋白和/或肽來自于如第4.2.1部分所述的抗原細胞蛋白制品。在上些實施方案中，這些肽是抗原細胞或其組分、病毒顆粒的蛋白制品消化產(chǎn)物。復(fù)合反應(yīng)的結(jié)果可以是在HSP和抗原細胞或病毒顆粒的蛋白或肽之間形成共價鍵。復(fù)合反應(yīng)的結(jié)果可以是在α2M和抗原細胞或病毒顆粒的蛋白或肽之間形成共價鍵。復(fù)合反應(yīng)的結(jié)果也可以是在HSP和蛋白和/或肽之間，或在α2M和蛋白和/或肽之間形成非共價鍵。
在復(fù)合反應(yīng)前可用ATP預(yù)處理HSPs或?qū)⑵浔┞队谒嵝詶l件下，以去除以非共價方式與目標(biāo)HSP相連的所有肽。當(dāng)使用ATP處理時，加入apyranase以去除制品中過量的ATP，見Levy等，1991，Cell，67265-274。當(dāng)用酸性條件處理時，加入pH調(diào)節(jié)劑使緩沖液的pH重新調(diào)到中性。下面討論了一個使一組肽(平均長度為7～20個氨基酸)與HSP或α2M形成非共價鍵復(fù)合物的優(yōu)選實驗方案將該組肽(1)與預(yù)處理過的HSP(9μg)混合，使其摩爾比大約為5個肽(或蛋白)1個HSP。混合物置于合適的連接緩沖液中，如含有20mmM磷酸鈉、350mmM NaCl、3mmM MgCl2及1mmM苯甲磺酰氟(PMSF)，pH7.2的緩沖液，于4℃～45℃孵育15分鐘至3小時。將制品置Centricon 10收集器(Millipore)離心以去除所有未結(jié)合的肽。用高效液相色譜(HPLC)或質(zhì)譜(MS)檢測蛋白/肽與HSPs之間的非共價結(jié)合。
在本發(fā)明的一個替換實施方案中，優(yōu)選使HSP與蛋白/肽形成非共價復(fù)合物。5～10μg純化的HSP70與等量蛋白/肽在緩沖液中于37℃孵育1小時，該緩沖液含20mmM磷酸鈉、0.5M NaCl、3mmM MgCl2及1mmM ADP，pH7.5，體積為100ml。如有必要可用Centricon 10收集器(Millipore)將孵育混合物離心一次或多次以去除所有未結(jié)合的肽。
在本發(fā)明的另一個替換實施方案中，優(yōu)選使gp96或HSP90與蛋白/肽形成非共價復(fù)合物。5～10μg純化的gp96或HSP90與等量蛋白/肽在緩沖液中于60℃～65℃孵育5～20分鐘，該緩沖液含20mmM磷酸鈉、0.5M NaCl、3mmM MgCl2及1mmM ADP，pH7.5，體積為100ml。使孵育混合物涼至室溫，如有必要可用Centricon 10收集器(Millipore)將孵育混合物離心一次或多次以去除所有未結(jié)合的肽。
抗原蛋白和/或抗原肽形成復(fù)合物后，可用下述的混合淋巴細胞靶細胞試驗(mixed lymphocyte target cell assay，MLTC)檢測免疫原性HSP復(fù)合物或α2M復(fù)合物。一旦分離出HSP-肽復(fù)合物及HSP-蛋白復(fù)合物并加以稀釋，即可用下文所討論的優(yōu)選施用方案及賦形劑在動物模型中任選地鑒定這些復(fù)合物。
作為制備HSPs和蛋白/肽非共價復(fù)合物的替代選擇，一組蛋白/肽可以共價方式和HSPs相結(jié)合。
在一個實施方案中，HSPs通過化學(xué)交聯(lián)以共價方式偶聯(lián)至蛋白制品中的蛋白和/或肽上?；瘜W(xué)交聯(lián)方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。例如，在一個優(yōu)選實施方案中使用了戊二醛交聯(lián)法。戊二醛交聯(lián)法已用于在肽和HSPs之間形成共價復(fù)合物(見Barrios等，1992，Eur.J.Immunol.，221365-1372)。優(yōu)選的方案是將1～2mg HSP-肽復(fù)合物在0.002％戊二醛存在的條件下交聯(lián)2小時。在磷酸緩沖鹽(PBS)中透析過夜以除去戊二醛(Lussow等，199 1，Eur.J.Immunol.，212297-2302)。此外，也可在本領(lǐng)域內(nèi)已知條件下用紫外(UV)交聯(lián)方法將HSP與一組蛋白/肽交聯(lián)起來。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將蛋白制品中的一組蛋白和/或肽與α2M以50∶1的摩爾比于50℃孵育10分鐘，然后在25℃孵育30分鐘，從而兩者形成非共價復(fù)合物?？捎么笮∨抛柽^濾除去游離的(未形成復(fù)合物的)肽。優(yōu)選用閃爍掃描計數(shù)器測定復(fù)合物，以確定以每摩爾HSP或α2M結(jié)合了等量的蛋白/肽(約為肽起始量的0.1％)。細節(jié)見Binder，2001，J.Immunol.，166(8)4968-72，在此將其完整引入作為參考。為了減小這些反應(yīng)體系中α2M與蛋白及肽形成共價復(fù)合物的傾向，需要在復(fù)合反應(yīng)前抑制或除去蛋白酶活性?？捎玫鞍酌敢种苿┌凑盏?.2.1部分所述方法達到這一目的?？赡苓€需要在反應(yīng)液中加入還原劑(如2-巰基乙醇)以中和存在于蛋白制品中的親核化合物，因為這些親核化合物可能會激活α2M而發(fā)生共價相連。
在另一個實施方案中，用PCT出版物WO94/14976和WO99/50303中所述肽與α2M形成復(fù)合物的方法，將一組蛋白制品中的抗原蛋白和/或抗原肽與α2M以共價方式形成復(fù)合物，在此將該PCT出版物完整引入作為參考。例如，使用加熱方法，可在親核反轉(zhuǎn)過程中用氨或甲胺(或其他小分子胺親核體如乙胺)將抗原蛋白和/或抗原肽連接到α2M上(Grn及Pizzo，1998，Biochemistry，376009-6014)。使用能夠使α2M偶然捕獲肽的條件來制備本發(fā)明的α2M復(fù)合物。也可用雙功能交聯(lián)劑實現(xiàn)一組抗原蛋白/肽與α2M的共價連接。這類交聯(lián)劑及其使用方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是眾所周知。優(yōu)選在復(fù)合物形成后將交聯(lián)劑滅活或除去。
在另一個實施方案中，利用上文所述同樣方法，一組蛋白/肽可與HSP和α2M的混合物在同一反應(yīng)中形成混合物。
在施用于受試者前，來源于單一共價和/或非共價復(fù)合反應(yīng)體系的HSP與抗原蛋白和/或肽的復(fù)合物可任意組合形成組合物。在施用于受試者前，來源于單一共價和/或非共價復(fù)合反應(yīng)體系的α2M與抗原蛋白和/或肽的復(fù)合物可任意組合形成組合物。
4.5癌癥及感染性疾病的預(yù)防和治療依據(jù)本發(fā)明，將包含抗原肽與HSP和/或α2M所形成復(fù)合物的本發(fā)明組合物施用于患有癌癥或感染性疾病的受試者，其中抗原肽由抗原細胞或病毒顆粒的胞漿和/或膜來源蛋白消化而來。在一個實施方案中，“治療”指癌癥或感染性疾病得到緩解，或至少其中的一個可辨認癥狀得到緩解。在另一個實施方案中，“治療”指至少一個與癌癥或感染性疾病相關(guān)的可測定身體參數(shù)得到緩解，受試者不一定可辨別。在另一個實施方案中，“治療”指癌癥或感染性疾病的惡化得到抑制，可以是體格性的，如可辨別癥狀的穩(wěn)定，也可以是生理學(xué)上的，如身體參數(shù)，也可以是兩者均得到緩解。
在一些特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物作為這類癌癥或感染性疾病的預(yù)防性措施施用于受試者。本文中“預(yù)防”指降低患某種特定癌癥或感染性疾病的危險性。在實施方案的一種模式里，本發(fā)明的組合物作為這類癌癥或感染性疾病的預(yù)防性措施施用于具有癌癥遺傳易感性的受試者。在實施方案的另一種模式里，本發(fā)明的組合物作為這類癌癥或感染性疾病的預(yù)防性措施施用于直接暴露于致癌劑或感染性疾病病原的受試者，致癌劑包括但不局限于化學(xué)試劑和/或輻射。
在本發(fā)明的治療性及預(yù)防性方法中優(yōu)選人類受試者。
用本發(fā)明的方法所制備的組合物包含熱休克蛋白和一組抗原肽的復(fù)合物，和/或α2-巨球蛋白和一組抗原肽的復(fù)合物。組合物似乎在所治療癌癥患者的腫瘤部位誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，最終可導(dǎo)致其腫瘤負荷消退。用本發(fā)明的方法所制備的組合物可增強受試者的免疫活性并激發(fā)針對感染性病原或前瘤細胞及瘤細胞的特異性免疫應(yīng)答。這些組合物具有預(yù)防感染性疾病發(fā)生、進展及抑制腫瘤細胞生長惡化的能力。
本發(fā)明中治療方案及含胞漿及膜來源蛋白的藥物組合物可與另外的免疫應(yīng)答增強劑或生理反應(yīng)調(diào)節(jié)劑聯(lián)用，包括IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、TNF等細胞因子或其他影響免疫細胞的細胞因子，以及熱休克蛋白和抗原分子的復(fù)合物，但不局限于這些。另外，本發(fā)明的復(fù)合物也可與佐劑同時使用，或在優(yōu)選實施方案中單獨使用。
4.5.1、目標(biāo)感染性疾病可用本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的感染性疾病由感染性病原所致，病原包括但不限于病毒、細菌、真菌、原生動物和寄生蟲。本發(fā)明并不局限于治療或預(yù)防由細胞內(nèi)病原體所致的感染性疾病。
可用本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的病毒性疾病包括不局限于由甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、I型單純皰疹(HSV-I)、II型單純皰疹(HSV-II)、牛疫、鼻病毒、?？刹《?、輪狀病毒、呼吸道合胞體病毒、乳頭狀瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒、巨細胞病毒、echinovirus、蟲媒病毒、huntavirus、柯薩奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病、I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)及II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)所致的疾病。
可用本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的細菌性疾病由細胞所致，包括但不局限于生命周期具有細胞內(nèi)時期的細菌、分支桿菌、立克次體、支原體及軍團菌。
可用本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的原生動物性疾病由原生動物所致，包括但不局限于利什曼原蟲、kokzidioa及錐蟲。
可用本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的寄生蟲疾病由寄生蟲所致，包括但不局限于衣原體和立克次體。
4.5.2、目標(biāo)癌癥可用本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的癌癥種類包括但不局限于人惡性肉瘤及癌癥，例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊素瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、內(nèi)胚竇瘤、Wilms瘤、子宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜細胞瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤；和白血病，例如急性淋巴細胞白血病和急性髓細胞白血病(原粒細胞、早幼粒細胞、骨髓單核細胞、單核細胞和紅白血病)、慢性白血病(慢性粒細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病)；以及真性紅細胞增多癥、淋巴瘤(何杰金氏病和非何杰金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥、重鏈病。
在一具體的實施方案中，癌癥是可轉(zhuǎn)移的。在另一具體的實施方案中，癌癥患者在施用HSP和/或α2M復(fù)合物或HSP和/或α2M致敏的APC之前因進行抗癌治療(如放化治療)而免疫功能受到抑制。
有多種原因可以說明本發(fā)明提供的免疫治療用于治療癌癥非常理想。首先，如果病人的免疫功能受到抑制，麻醉手術(shù)及隨后的化療可能加重免疫抑制。在手術(shù)前期采取合理的免疫治療可預(yù)防或逆轉(zhuǎn)這種免疫抑制。這樣可使感染性并發(fā)癥發(fā)生更少并加速傷口愈合。其次，手術(shù)后腫瘤體積很小，此時免疫治療最有可能起效。第三個原因是，手術(shù)時腫瘤細胞可能逃逸入血液循環(huán)中，此時采取有效的免疫治療可清除這些細胞。
本發(fā)明提供的預(yù)防性及治療性方法致力于在術(shù)前或術(shù)后增強癌癥患者的免疫功能，并誘導(dǎo)針對癌細胞的腫瘤特異性免疫應(yīng)答，目標(biāo)是抑制癌癥，最終的臨床目標(biāo)是腫瘤的完全消退和根除。本發(fā)明的方法也可用于某種特定癌癥的高危險性個體，例如因家族史或環(huán)境危險因素所致的高危險性個體。
4.5.3、自身實施方案HSPs及α2M的免疫原性并非來自于HSPs或α2M本身，而是來自于與之結(jié)合的抗原肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，用作腫瘤疫苗的本發(fā)明組合物中的復(fù)合物是自身固有的復(fù)合物，因而越過了癌癥免疫治療中兩個最棘手的障礙。第一個障礙是與實驗動物的癌癥類似，人類癌癥的抗原性存在有多樣性。為了克服這一障礙，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，HSPs及α2M與抗原蛋白及抗原肽形成復(fù)合物，并將復(fù)合物用于治療蛋白或肽來源的同一受試者的癌癥。第二個障礙是，目前大部分癌癥免疫治療途徑均集中于確定癌細胞系中CTL識別的表位。這種方法需要細胞系及針對癌癥的CTLs的獲得。但這些試劑對于絕大部分人類癌癥都是無法獲得的。在本發(fā)明一個使用自身抗原肽的優(yōu)選實施方案中，癌癥的免疫治療不依賴于細胞系或CTLs的獲得，也不需要界定癌細胞的抗原表位。這些優(yōu)勢使結(jié)合有自身抗原肽的HSPs和/或α2M復(fù)合物成為有吸引力的癌免疫原。
在其他實施方案中，治療性或預(yù)防性復(fù)合物中的抗原肽可由來源于一個受試者的癌組織制備，施用于患同種癌癥的其他受試者。
4.6、過繼(adoptive)免疫治療過繼免疫治療指的是一種用于治療癌癥或感染性疾病的治療方法，這種方法將免疫細胞施用于宿主，目的是使細胞介導(dǎo)直接的或間接的針對腫瘤細胞和/或抗原組分的特異性免疫應(yīng)答，或是使腫瘤消退，或是治療感染性疾病，及類似的情況(例如可見于1999年11月16日公布的No.5,985,270號美國專利，在此將其完整引入作為參考)。
在一個實施方案中，使用與依照本文所述方法制備的抗原蛋白及肽結(jié)合的HSPs和/或α2M致敏用于過繼免疫治療的抗原呈遞細胞(APC)。復(fù)合物可由熱休克蛋白或α2-巨球蛋白與抗原蛋白復(fù)合而得，其中抗原蛋白來源于抗原細胞或病毒顆粒中存在的至少50％不同蛋白或至少100種不同蛋白，其中抗原細胞或病毒顆粒表達導(dǎo)致該感染性疾病的抗原決定簇。復(fù)合物也可這樣制備(a)將來源于該種癌細胞的蛋白制品用蛋白酶消化，或與ATP、鹽酸胍和/或酸接觸，產(chǎn)生一組抗原肽；(b)使該組抗原肽與熱休克蛋白或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
在另一個實施方案中，使用本發(fā)明方法體外制備的抗原肽與HSP和/或α2M復(fù)合物的治療可以與用本領(lǐng)域內(nèi)任何已知方法(例如見No.5,985,270號美國專利)制備的HSP和/或α2M復(fù)合物所致敏APC的過繼免疫治療聯(lián)用，其中抗原肽顯示出所需抗原性(如同類型癌或病原體的抗原性)。致敏的APC可單獨使用、與體外形成的HSP和/或α2M復(fù)合物聯(lián)用，或在HSP和/或α2M復(fù)合物施用前、后使用。特別地，使用致敏的APC預(yù)防和治療癌癥還包括將有效治療或預(yù)防量的含結(jié)合有抗原蛋白/肽的熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白復(fù)合物施用于受試者，其中復(fù)合物由前述方法制備。類似地，使用致敏的APC預(yù)防和治療感染性疾病還包括將有效治療或預(yù)防量的含結(jié)合有抗原蛋白/肽的熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白復(fù)合物施用于受試者。
另外，盡管優(yōu)選的施用方式是真皮內(nèi)施用，體外形成的抗原蛋白/肽和HSPs和/或α2M復(fù)合物的施用模式是可以改變的，如包括但不限于皮下、靜脈內(nèi)注射或肌肉內(nèi)施用。在另一具體的實施方案中，施用依照本發(fā)明制備的復(fù)合物致敏抗原呈遞細胞的過繼免疫治療可與施用用本領(lǐng)域內(nèi)任何已知方法(例如見No.5,750,119、No.5,837,251、No.5,961,979、No.5,935,576號美國專利，WO94/14976或WO99/50303號PCT出版物)制備的HSP和/或α2M復(fù)合物的治療聯(lián)用，其中抗原肽顯示出所需抗原性(如同類型癌或病原體的抗原性)。
4.6.1、抗原呈遞細胞的獲得優(yōu)選在體外從人外周血或骨髓的干細胞和祖細胞生產(chǎn)而獲得抗原呈遞細胞，包括但不限于巨噬細胞、樹突狀細胞及B細胞，詳見Inaba，K等，1992，J.Exp.Med.，1761693-1702。可用本領(lǐng)域內(nèi)各種已知方法的任何一種方法來獲得樹突狀細胞。作為實例而不是限制，可由Sallusto等，1994，J Exp.Med.，1791109-1118及Caux等，1992，Nature，360258-261中所述方法獲得樹突狀細胞，在此將其完整引入作為參考。在優(yōu)選的方面，使用從人血細胞獲得的樹突狀細胞。
可用本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種方法獲取APC。一方面可使用從人血細胞獲取的巨噬細胞。作為實例而不是限制，可按下列方法獲取巨噬細胞用Ficoll-Hypaque梯度離心方法從患者(優(yōu)選需治療的患者)的外周血分離單核細胞，并接種到預(yù)先用患者本人血清或其他AB+人血清包被的組織培養(yǎng)皿中。細胞于37℃孵育1小時，用吸管除去非貼壁細胞。對于皿中剩下的貼壁細胞，加入1mM溶于磷酸緩沖液中的冷(4℃)EDTA，室溫放置15分鐘。收集細胞，用RPMI緩沖液洗滌細胞，重懸于RPMI緩沖液中。于37℃與巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)一起孵育可增加巨噬細胞的數(shù)量。
4.6.2、用HSP-肽復(fù)合物或α2M-肽復(fù)合物致敏巨噬細胞及抗原呈遞細胞優(yōu)選在體外與HSP-肽復(fù)合物或α2M-肽復(fù)合物一起孵育來致敏APC。用HSP或α2M與抗原分子的復(fù)合物致敏APC的方法包括在體外與HSP-肽復(fù)合物或α2M-肽復(fù)合物于37℃孵育15分鐘至24小時。作為實例而不是限制，4×107個樹突狀細胞與gp96-肽復(fù)合物在1mlRMPI培養(yǎng)基中于37℃孵育15分鐘至24小時，其中每ml培養(yǎng)基含10μg gp96-肽復(fù)合物或每ml含100μg gp96-肽復(fù)合物。細胞洗滌三次，以適當(dāng)?shù)臐舛?如1×107/ml)重懸于生理溶媒中以注射入患者體內(nèi)，優(yōu)選無菌的生理溶媒。將要注入致敏樹突狀細胞的患者最好與最初分離樹突狀細胞的患者是同一人(自身實施方案)。
例如，致敏APC刺激抗原特異性、I類限制細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的能力可通過其刺激CTL釋放腫瘤壞死因子的能力及作為CTLs靶細胞的能力而加以監(jiān)測。
4.6.3、致敏APC的重新注入用傳統(tǒng)的臨床方法將致敏APCs重新注入患者身體組織，優(yōu)選真皮內(nèi)。優(yōu)先選用自體患者的系統(tǒng)實施活化細胞的重新注入。根據(jù)患者的情況，患者通常接受約106至1012個致敏樹突狀細胞。在一些治療方案中，患者可選擇性地添加適量生理反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，包括但不限于IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、TNF等細胞因子或細胞因子、生長因子。
4.7、藥物制劑及施用方法以有效治療或緩解細胞增殖紊亂或感染性疾病的劑量，將根據(jù)本發(fā)明中方法制備的結(jié)合HSPs和/或α2M的抗原肽復(fù)合物施用于患者。有效治療劑量指可使疾病癥狀緩解的足夠的復(fù)合物量。
4.7.1、有效劑量將包含有效量、具有免疫原性的一組抗原肽與HSP和/或α2M所形成復(fù)合物的本發(fā)明組合物施用于需要抗癌治療或抗感染治療的受試者，作為誘導(dǎo)針對該癌癥或感染性疾病的免疫應(yīng)答的一種方法?？捎眉毎囵B(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏械臉?biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法來測定這類復(fù)合物的毒性及療效，如測定LD50(使總體50％致死的劑量)及ED50(對總體50％有效的劑量)的方法。毒性與療效的劑量比為治療指數(shù)，可用LD50/ED50比值表示。優(yōu)選治療指數(shù)大的復(fù)合物。雖然可以使用顯示毒性副作用的復(fù)合物，但應(yīng)小心設(shè)計輸送系統(tǒng)，將這些復(fù)合物導(dǎo)向受感染的靶組織部位，以使未感染細胞的損傷最小化，從而減少副作用。
在一個實施方案中，從細胞培養(yǎng)物分析及動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于闡明人類使用的劑量范圍。復(fù)合物劑量優(yōu)選在包括ED50在內(nèi)的循環(huán)濃度范圍內(nèi)，毒性極低或沒有毒性。劑量可根據(jù)所用劑型和施用途徑在該范圍內(nèi)變動。對于在本發(fā)明的方法中所使用的任何復(fù)合物來說，開始時可用細胞培養(yǎng)物檢測其有效治療劑量。可在動物模型中計算劑量以便獲得包括由細胞培養(yǎng)物測定的IC50(即受試化合物可使癥狀抑制到半數(shù)最高抑制作用的濃度)在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍。這些信息可用于更精確地決定人類有用劑量。例如，可用高效液相色譜測定血漿中的濃度。
在另一個實施方案中，在人類患者中施用的hsp70-抗原分子復(fù)合物和/或gp96-抗原分子復(fù)合物用量約10μg至約600μg。本發(fā)明所提供人類患者使用的hsp90-抗原分子復(fù)合物的劑量約50μg至5000μg，優(yōu)選劑量為100μg。上述劑量優(yōu)選每周施用一次，持續(xù)4～6周，優(yōu)選每次施用時變換給藥部位或模式。這樣，舉例而不作限制，首次注射可在左臂皮下進行，第二次在右臂，第三次在左腹部，第四次在右腹部，第五次在左股，而第六次則在右股，等等。同一部位可在一次或多次注射間隙后重復(fù)。同樣，注射可分開進行。例如，將一半藥物在一個部位施用，另一半在同一天內(nèi)在另一部位施用。此外，按順序改變給藥模式，例如每周的注射可按真皮注射、肌肉注射、靜脈注射或腹腔注射的順序?qū)嵤?～6周后，優(yōu)選每兩周注射一次，持續(xù)一個月。以后可每月注射一次。后繼注射的間隔可根據(jù)患者對免疫治療的臨床進展及反應(yīng)加以調(diào)整。
在另一個實施方案中，在人類患者中施用的hsp70-抗原肽復(fù)合物和/或gp96-抗原肽復(fù)合物用量約0.1μg至約60μg。在另一具體的實施方案中，hsp70-抗原分子復(fù)合物和/或gp96-抗原分子復(fù)合物的有效量低于10μg，例如0.1μg～9μg；優(yōu)選的人用劑量與25g小鼠所用劑量基本相當(dāng)，如0.5μg～2.0μg。本發(fā)明所提供人類患者使用的hsp90-抗原分子復(fù)合物劑量約為5μg至500μg。在一個具體的實施方案中，hsp90-抗原分子復(fù)合物的有效量低于50μg，例如5μg～49μg；優(yōu)選劑量為5μg～40μg。優(yōu)選真皮或肌肉注射。例如，優(yōu)選每隔一天真皮注射，共5次。在一個優(yōu)選實施方案中，上述劑量每周一次，約持續(xù)4～6周，優(yōu)選每次施用時變換給藥部位或模式。在一個優(yōu)選的實例中，采用真皮注射方式，同時按順序變換施用部位。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了預(yù)防及治療受試者癌癥或感染性疾病的方法，該方法包括使用組合物刺激宿主個體免疫力，激發(fā)針對前瘤細胞和/或瘤細胞或感染細胞的特異性免疫應(yīng)答。
4.7.2、制劑及用法依據(jù)本發(fā)明，所用藥物組合物可利用一種或幾種生理上可接受的載體或賦形劑以常規(guī)方法制成。
因此，復(fù)合物及其生理學(xué)上可接受的鹽及溶劑可制成以吸入或吹入(通過口或鼻)或口服、口腔、腸道外或直腸給藥方式施用的劑型。
對于口服，藥物組合物可采用片劑或膠囊的形式，片劑或膠囊可利用藥用賦形劑如粘合劑(如預(yù)先凝膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)、填充劑(如乳糖、微晶纖維素、磷酸氫鈣)、潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅)、崩解劑(如馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)或潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)以常規(guī)方法制成。片劑可用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法進行包衣。例如，用于口服的液體制劑可采用溶液、糖漿或懸浮液等形式；或以干品存在，在使用前用水或其他合適的溶媒制成液體制劑。這些液體制劑可用藥用添加劑如懸浮劑(如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)、乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性溶媒(如杏仁油、油性脂類、乙醇或部分植物油)及防腐劑(如甲基-對羥基苯甲酸或丙基-對羥基苯甲酸或山梨酸)以常規(guī)方法制成。這些制劑還可包含合適的緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑及甜味劑。
口服制劑可適當(dāng)?shù)刂瞥苫钚詮?fù)合物控釋劑型。
對于口腔施用，組合物可以是以常規(guī)方法制成的片劑或錠劑。
對于吸入給藥，依據(jù)本發(fā)明所用復(fù)合物可方便地以噴霧劑形式釋放，該噴霧劑可用合適當(dāng)?shù)耐七M劑如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體制成氣溶膠包裝或噴霧器。在加壓氣體情況下，通過提供一個閥門釋放計量器所定的量來確定劑量單位。吸入劑或吹入劑中所用的膠囊及囊芯(如明膠的)可制成含復(fù)合物及恰當(dāng)粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉等粉末混合物的制劑。
復(fù)合物可制成注射制劑，經(jīng)腸道外施用，如團丸式注射或連續(xù)輸液。注射制劑可以單劑量形式存在，如安瓿內(nèi)；或多劑量形式存在于添加防腐劑的容器中。組合物可以是諸如懸浮液、溶液或油性或水性載體中的乳劑，同時可含諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑之類的成形劑。此外，活性成分可以是粉末狀，在使用前用合適的溶媒如無菌、無致熱原的水制成液體制劑。
復(fù)合物也可制成諸如栓劑、滯留灌腸劑之類的直腸施用制劑，如該制劑可含常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂或其他甘油酯。
除了前面所述的劑型，復(fù)合物也可制成長效制劑。這類長效劑型可通過植入法(例如埋入皮下或肌肉內(nèi))或肌肉內(nèi)注射施用。因此，復(fù)合物可與合適的多聚材料或疏水材料(如可用油的乳劑)或離子交換樹脂或少量可溶性衍生物，如少量可溶性鹽制成制劑。
如果需要，組合物可以存在與一個包裝中，或者存在于包含一個或多個含活性成分的單位劑量形式的分配器中。例如該包裝可包括金屬或塑料箔，如泡沫塑料包裝。包裝或分配器可附有使用說明。
4.7.3、試劑盒本發(fā)明還提供了實施本發(fā)明方法和/或治療方案的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒的一個或多個容器內(nèi)包括含抗原蛋白及抗原肽的蛋白制品，其中抗原蛋白及抗原肽用于結(jié)合第二個容器所提供的HSPs和/或α2M。在另一個實施方案中，試劑盒的一個或多個容器中包括含抗原肽的消化肽，其中抗原肽用于結(jié)合第二個容器所提供的HSPs和/或α2M。此外，一個或多個容器提供蛋白和/或肽，用于和來自特定患者的HSPs和/或α2M形成復(fù)合物。可選的是，第二個容器中還提供了與蛋白及肽形成復(fù)合物的純HSP。
在另一個實施方案中，試劑盒包括裝于一個或多個容器內(nèi)的、治療性或預(yù)防性有效量的、與HSPs和/或α2M復(fù)合在一起的蛋白/肽，優(yōu)選純化的、藥學(xué)上可接受的形式。試劑盒還可選擇性地包括裝于第二容器內(nèi)的的致敏APCs，優(yōu)選裝有純化的致敏APCs。
在本發(fā)明試劑盒容器內(nèi)的HSP或α2M復(fù)合物可以是藥學(xué)上可接受的形式，如與無菌鹽水、葡萄糖溶液或緩沖溶液組合，或與其他藥學(xué)上可接受的無菌流體組合。此外，HSP或α2M復(fù)合物可以凍干或干燥；在本實施例中，試劑盒還可選擇性地包括裝于容器內(nèi)的藥用溶液(如鹽水、葡萄糖溶液等等)，優(yōu)選無菌原者，以便將含有HSPs及α2M的復(fù)合物或含有α2M及HSP的復(fù)合物重構(gòu)成可用于注射的溶液。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒還包括一個用于注射HSP及α2M復(fù)合物的針頭或注射器，優(yōu)選無菌形式包裝者，和/或包裝好的酒精墊?？蛇x擇性地包括臨床醫(yī)生或患者使用的α2M-肽復(fù)合物及HSP-肽復(fù)合物施用說明。
4.8、HSP及α2M復(fù)合物的免疫原性測定本發(fā)明的HSP-蛋白復(fù)合物、HSP-肽復(fù)合物、α2M-蛋白復(fù)合物及α2M-肽復(fù)合物可用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任意方法測定其免疫原性?？梢允褂孟挛囊詫嵗皇窍拗频姆绞矫枋龅囊环N測定方法。在一個優(yōu)選實施方案中，使用ELISPOT測定法(見下文第4.9.4部分)。
4.8.1、MLTC測定法簡單地說，小鼠用任何常規(guī)給藥途徑注射一定量的HSP復(fù)合物和/或α2M復(fù)合物。對小鼠注射和正常組織的蛋白和/或肽相復(fù)合的HSP，作為陰性對照。已知含有特異性抗原的細胞可作為測定中的陽性對照，如腫瘤細胞或受感染性疾病致病因子感染的細胞。小鼠注射兩次，間隔7～10天。距最后一次注射10天后，取脾臟，分離淋巴細胞。隨后通過加入表達感興趣抗原的死細胞，再次對所分離的淋巴細胞進行體外刺激。
例如，對培養(yǎng)在3ml含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中的8×106個免疫脾細胞來說，用4×104個絲裂霉素C處理或γ射線(5～10,000拉德)照射過、含有感興趣抗原的細胞(或用合適基因轉(zhuǎn)化的細胞，根據(jù)具體情況而定)加以刺激。在一些情況下，可將33％次級混合淋巴細胞培養(yǎng)上清液加到培養(yǎng)基中，作為T細胞生長因子的來源(見Glasebrook等1980，J.Exp.Med.，151876)。為測定免疫后的原發(fā)性細胞毒T細胞反應(yīng)，脾細胞的培養(yǎng)不加刺激物。在一些實驗里，還可用抗原性截然不同的細胞對免疫小鼠的脾細胞進行再次刺激，以測定細胞毒T細胞反應(yīng)的特異性。
6天后，用4小時51Cr-釋放分析法測定細胞培養(yǎng)物的細胞毒性(見Palladino等，1987，Cancer Res.，475074-5079及Blachere等，1993，J.Immunotherapy，14352-356)。測定時，以效應(yīng)細胞∶靶細胞(E∶T)比值不同的比率(通常1∶1至40∶1)，將混合淋巴細胞培養(yǎng)物加入靶細胞懸浮液。將1×106個靶細胞在含20mCi51Cr/ml的培養(yǎng)基中于37℃孵育1小時預(yù)先加以標(biāo)記。標(biāo)記后細胞洗滌三次。每一測定點(E∶T比值)重復(fù)三次，同時包含合適的對照組以衡量自發(fā)性51Cr釋放(不加淋巴細胞測定)及100％釋放(用去垢劑將細胞裂解)。細胞混合物孵育4小時后，以200g離心5分鐘以沉淀細胞。用γ計數(shù)器對釋放入上清液的51Cr量進行測定。測試樣品cpm減去自發(fā)性釋放cpm所得值除以總釋放cpm減去自發(fā)性釋放cpm所得值，衡量百分率細胞毒。
為了阻斷I類MHC分子級聯(lián)反應(yīng)，將來源于K-44雜交瘤細胞(一種抗I類MHC雜交瘤)的濃縮雜交瘤上清液加到受試樣品中，終濃度為12.5％。
4.8.2、CD4+T細胞增殖測定原代T細胞取自脾、新鮮血液或CSF，并基本上按Kruse及Sebald，1992，EMBO J.，113237-3244所述，用FICOLL-PAQUE PLUS(Pharmacia，Upsalla，Sweden)離心加以純化。外周血單核細胞與表達抗原分子的細胞裂解液共孵育7～10天。測定前24～48小時，可選擇性地在培養(yǎng)物中加入抗原呈遞細胞以便對裂解液中的抗原進行加工和呈遞。然后離心收集細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基(BibcoBRL，Gaithersburg，Md.)洗滌。將活化T細胞以5×104/孔的密度接種入96孔板中，于37℃孵育72小時，其中細胞懸于含10％胎牛血清、10mMHEPES、2mM PH7.5 L-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素G及100μg/ml硫酸鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。加入1μCi/孔的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(Dupont NEN，Boston，Mass.)，6小時后收集細胞，在TOPCONT閃爍液計數(shù)器(Packard Instrument Co.，Meriden，Conn.)中測定放射活性4.8.3、抗體反應(yīng)測定在本發(fā)明的一個特定實施方案中，測定用復(fù)合物接種后所產(chǎn)生的抗體，以此確定HSP復(fù)合物或α2M復(fù)合物的免疫原性。在一個實施模式里，用0.75μg/ml純化的、用于疫苗的、存在于PBS中的、未復(fù)合有HSP或α2M的蛋白/肽以50μl/孔的量將微量滴定板(96孔免疫板II，Nunc)于4℃包被16小時，然后在20℃包被1小時。然后傾掉包被液，用PBS-T-BSA以每孔200μl的量(含0.05％(v/v)吐溫20及1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS)于20℃封閉1小時，PBS-T洗滌3次。加入50μl/孔來自于接種動物(如模型小鼠或人類患者)的血漿或CSF，20℃放置1小時，PBS-T洗滌3次。與50μl/孔的羊抗鼠或羊抗人免疫球蛋白于20℃孵育1小時，并(如上用PBS-T洗滌3次后)用50μl鄰苯二胺(OPD)-過氧化氫底物溶液，然后以量熱法測定抗肽的抗體活性。只要合適也可將免疫球蛋白與用PBS-T-BSA以1∶1500稀釋的辣根過氧化物酶(Amersham)連接。5分鐘后用150μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，用Kontron SLT-210光度計測定492nm處的吸光度(參比波長為620nm)。
4.8.4、細胞因子檢測試驗本發(fā)明中CD4+T細胞對HSP復(fù)合物或α2M復(fù)合物的增殖反應(yīng)可通過檢測和定量特異性細胞因子的水平而確定。例如在一個實施方案中，可用檢驗本發(fā)明復(fù)合物免疫原性的IFN-γ檢測試驗來測定細胞內(nèi)的細胞因子。在本發(fā)明的一個實施例中，對來源于HSP-肽復(fù)合物或α2M-肽復(fù)合物治療過的受試者的外周血液單核細胞用特定腫瘤的肽抗原或感染性疾病致病原的肽抗原刺激。然后用可以通過流式細胞檢測的T細胞特異性標(biāo)記抗體對細胞染色，例如FITC標(biāo)記的抗CD8抗體及PerCP標(biāo)記的抗CD4抗體。細胞洗滌后，固定，滲透，然后與染料標(biāo)記的抗體反應(yīng)，其中該抗體對人IFN-γ具有反應(yīng)性(PE-抗-IFN-γ)。用標(biāo)準(zhǔn)方法對樣品進行流式細胞分析。
此外，可用過濾免疫測定法、酶聯(lián)免疫印跡反應(yīng)(ELISPOT)檢測T細胞周圍的特異性細胞因子。例如在一個實施方案中，用純化的細胞因子特異性一級抗體，即抗-IFN-γ包被硝酸纖維素作背襯的微量滴定板，然后封閉，避免其他蛋白非特異結(jié)合產(chǎn)生的背景。將從HSP-肽復(fù)合物或α2M-肽復(fù)合物治療過的受試者獲得的、含分泌細胞因子的細胞的單核血細胞樣品于微量滴定板的孔中稀釋。加入標(biāo)記好的，如生物素標(biāo)記的二抗，即細胞因子抗體。然后通過目檢、鏡檢或電子檢測方法檢測抗體細胞因子的復(fù)合物，和酶偶聯(lián)的鏈霉抗生素蛋白-細胞因子分泌細胞將顯示為“點”。
4.8.5、四聚物檢測在另一個實施方案中，可用“四聚物染色”試驗(Altman等，1996，Science，27494-96)鑒定抗原特異性的T細胞。例如，在一個實施方案中，使含特異性肽抗原，如腫瘤特異抗原的MHC分子形成多聚體以制備可溶的肽四聚物，并使之與鏈霉抗生素蛋白形成復(fù)合物加以標(biāo)記。將MHC-肽抗原復(fù)合物與一組從HSP復(fù)合物或α2M復(fù)合物治療過的受試者獲得的T細胞混合。然后用生物素對表達感興趣抗原，即腫瘤特異抗原的T細胞加以染色。
4.9、癌癥預(yù)防及免疫治療期間的效果監(jiān)測可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法監(jiān)測HSP復(fù)合物或α2M復(fù)合物在腫瘤疾病的發(fā)展及惡化中的免疫治療效果，包括但不限于測量下列指標(biāo)a)作為細胞免疫的遲發(fā)型過敏性，b)細胞毒T淋巴細胞的體外活性；c)腫瘤特異抗原如癌胚抗原(CEA)的水平，；d)利用諸如計算機X射線斷層造影(CT)掃描之類的技術(shù)所觀察的腫瘤形態(tài)學(xué)改變；e)高危個體中特定癌癥的推定的(putative)危險生物標(biāo)記水平的變化；以及f)聲波圖譜的形態(tài)學(xué)改變。
下面各部分描述了可選擇的示范性方法。
4.9.1、遲發(fā)型過敏性皮膚試驗遲發(fā)型過敏性皮膚試驗在總體免疫力及對某種抗原的細胞免疫力方面占有重要位置。不對一組通用皮膚抗原產(chǎn)生反應(yīng)稱為無反應(yīng)性(Sato，T等，1995，Clin.Immunol.Pathol.，7435-43)。
適當(dāng)?shù)钠つw試驗技術(shù)需要將抗原于4℃無菌、避光儲存，使用前迅速重構(gòu)。用25號或27號規(guī)格的針頭確保將抗原經(jīng)真皮內(nèi)而不是皮下施用?？乖?jīng)真皮內(nèi)施用24及48小時后，用尺測量紅斑及硬結(jié)的最大范圍。通過使用更高濃度抗原，或者在有分歧的情況下重復(fù)中間試驗來確定對任何特定抗原或一組抗原的低活性。
4.9.2、細胞裂解T淋巴細胞的體外活性對于在3ml含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)的8×106個通過Ficoll-hypaque梯度離心技術(shù)分離的外周血來源T淋巴細胞來說，用4×104個絲裂霉素C處理的腫瘤細胞刺激。在一些實驗里，將33％二級混合淋巴細胞培養(yǎng)上清液或IL-2作為T細胞生長因子加入培養(yǎng)基中。
為了測量免疫后細胞裂解T淋巴細胞的初級反應(yīng)，T細胞培養(yǎng)時不加作為刺激物的腫瘤細胞。在其他試驗中，用抗原性截然不同的細胞重新刺激T細胞。6天后，用4小時51Cr-釋放法測定細胞培養(yǎng)物的細胞毒性。靶細胞的自發(fā)性51Cr釋放水平應(yīng)低于20％。對于抗I類MHC分子阻斷活性，在試驗品中加入W6/32雜交瘤10倍濃縮上清液，終濃度為12.5％(Heike M等，J.Immunotherapy，15165-174)。
4.9.3、腫瘤特異抗原的水平盡管有可能檢測所有腫瘤的獨特抗原，許多腫瘤顯示出與正常細胞相區(qū)別的抗原。單克隆抗體試劑可以實現(xiàn)抗原的分離和生化鑒定，對于區(qū)分非轉(zhuǎn)化細胞和轉(zhuǎn)化細胞的診斷及轉(zhuǎn)化細胞系的界定來說有著無法衡量的價值。鑒定最清楚的人類腫瘤相關(guān)抗原是癌胚抗原。這些抗原在胚胎發(fā)生過程表達，但在正常的成人組織中缺失或很難檢測到。典型抗原是癌胚抗原(CEA)，是一種在人胚腸的結(jié)腸癌細胞上發(fā)現(xiàn)的糖蛋白，但在正常成年結(jié)腸癌細胞未發(fā)現(xiàn)。既然CEA起源于結(jié)腸癌細胞，并在血清中發(fā)現(xiàn)，最初人們認為血清中該抗原的存在可用于篩選結(jié)腸癌患者。然而，患有其他腫瘤如胰腺癌及乳腺癌的患者血清CEA水平也升高。因此，對于預(yù)測腫瘤的進展及對治療的反應(yīng)來說，監(jiān)測治療中癌癥患者CEA水平的下降與升高已證明是有用的。
其他數(shù)種癌胚抗原在診斷和監(jiān)測人類腫瘤方面也是非常有用的，如α-胎兒蛋白，它是一種正常情況下由胚肝細胞及卵黃囊細胞分泌的α-球蛋白，可在肝癌及生發(fā)細胞腫瘤患者的血清中發(fā)現(xiàn)，并可作疾病狀態(tài)的一個指標(biāo)。
4.9.4、計算機x射線斷層造影(CT)掃描CT仍然是對癌癥精確分級的可選技術(shù)。在檢測癌癥轉(zhuǎn)移方面，已證明CT比其他任何成像方式更敏感、更特異。
4.9.5、推定的生物標(biāo)記的測定測定特定癌癥危險性的推定的生物標(biāo)記水平來監(jiān)測含胞漿來源及膜來源蛋白的組合物的效果。例如，用Brawer，M.K.等，1992，J.Urol.，147841-845，及Catalona，W.J.等，1993，JAMA，270948-958所述方法測定前列腺癌高危個體的血清中前列腺特異抗原(PSA)；或用Schneider，J.等，1982，Proc.Acad.Sci.ISA，793047-3051所述方法測定乳癌高危個體的雌二醇的16-α-羥基化。上述所引用文獻在此將其完整引入作為參考。
4.9.6、聲波圖譜聲波圖譜仍然是對癌癥精確分級的替代選擇技術(shù)。
5、實施例下面的試驗說明，a)來源于細胞組分的抗原肽，與b)HSP或α2-巨球蛋白(α2M)形成的復(fù)合物對于預(yù)防性地保護動物免受癌細胞生長是有效的。
5.1、材料與方法5.1.1、蛋白純化對于α2M的純化，來自于小鼠的血清用pH7.6的0.04M Tris及0.15M NaCl以1∶1比例稀釋，然后上樣到一個已用同樣緩沖液平衡和洗脫的65ml Sephacryl S300R(SIGMA)柱。用點印跡的方法測定α2M陽性級份，級分中的緩沖液用PD-10層析柱交換成pH7.5的0.01M的磷酸鈉緩沖液。含蛋白的級分上樣到刀豆蛋白A瓊脂糖凝膠層析柱上。所結(jié)合的蛋白用0.2M甲基甘露糖吡喃糖苷洗脫，并上樣至用0.05M醋酸鈉緩沖液平衡的DEAE層析柱上。將α2M洗脫，經(jīng)SDS-PAGE及0.13M醋酸鈉免疫印跡法分析證實其純度。
在一些試驗中，α2M購自SIGMA。
Gp96由第4.3.3部分所述方法獲得。
5.1.2、腫瘤排斥試驗用100μl體積的PBS完成所有的真皮內(nèi)接種。在一周內(nèi)分兩次進行接種。每次注射使用7μg α2M或1μg gp96，α2M或gp96以復(fù)合物形式使用或單獨使用?；钅[瘤細胞(100,000個)洗至不含培養(yǎng)基并懸浮于PBS中，于最后一次接種后真皮內(nèi)注射。對腫瘤進行二維測量。均值的一半作為腫瘤的半徑以計算腫瘤體積。用單分類變量方差分析(ANOVA)確定P值。
5.1.3、復(fù)合物的生成用杜恩斯勻漿器從肝Meth A細胞獲取裂解液，然后加以超速離心。用0.1％三氟乙酸及3mM ATP對100,000g離心上清液處理10小時，然后用10kDa的截流范圍的CENTRICON膜濾器(Millipore)離心。將小于10kDa的肽(稱為“MethA10”)與C18反相層析柱結(jié)合，用甲醇洗脫，真空干燥，并用適合于形成復(fù)合物的緩沖液重構(gòu)，進一步分離。在過量50摩爾MethA10存在的條件下，將Gp96、α2M或白蛋白(作為對照)加熱至50℃。含有所得復(fù)合物的反應(yīng)物室溫放置30分鐘，然后置冰上。用CENTRICON 50(Millipore)去除未形成復(fù)合物的游離肽。如此制得的復(fù)合物用來接種。
5.2、結(jié)果本試驗用Meth A腫瘤模型來說明gp96-肽復(fù)合物及α2M-肽復(fù)合物所激發(fā)的抗腫瘤免疫。該腫瘤的抗原I型MHC表位尚不清楚。MethA細胞裂解液用ATP、三氟乙酸(TFA)處理，收集小于10kDa的肽級分(MethA10)，按上述方法與α2M或gp96形成復(fù)合物。用與MethA10形成復(fù)合物或不形成復(fù)合物的α2M或gp96免疫BALB/c小鼠。同時用白蛋白-MethA10或PBS免疫小鼠作為陰性對照。免疫接種間隔一周，分兩次完成。距最后一次接種一周后，所有小鼠用100,000個活Meth A細胞攻擊。攻擊后每5天監(jiān)測腫瘤生長情況，總共20天。
表1
表1中的數(shù)據(jù)顯示用α2M-MethA10復(fù)合物免疫或gp96-MethA10復(fù)合物免疫對小鼠具顯著的保護作用(p值均小于0.05)，但單獨用α2M、gp96、白蛋白-MethA10或PBS免疫對小鼠則沒有保護作用。
5.3、討論本文所述的針對腫瘤的免疫試驗演示了一種全新的腫瘤免疫治療方法，其中包括自身肽及抗原肽在內(nèi)的一組腫瘤的總體細胞肽與HSP或α2M形成復(fù)合物。正如本文所示，這樣的復(fù)合物有效地刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性反應(yīng)。數(shù)據(jù)表明本方法在預(yù)防中的用途可擴展到治療已患疾病，治療和預(yù)防病原性感染。
這里引用的所有文獻均被完整引入作為參考及用于相同程度的所有目的，正如每一單獨出版物、專利或?qū)＠暾執(zhí)囟ǖ?、單獨地指出以將其完整引入作為參考那樣?br> 顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不背離本發(fā)明精神和范圍的條件下對本發(fā)明作出許多修改和變更。這里所述的具體實施方案僅以實例的方式提供，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的條款及權(quán)利要求所賦予的全部等同范圍的限制。
權(quán)利要求
1.一種制備熱休克蛋白與抗原蛋白復(fù)合物的方法，該方法包括將一組來源于抗原細胞或病毒顆粒的抗原蛋白與一種或幾種不同的熱休克蛋白在體外形成復(fù)合物，其中該組抗原蛋白分別包含抗原細胞或病毒顆粒，或存在于抗原細胞的細胞組分中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白。
2.一種制備熱休克蛋白與抗原肽復(fù)合物的方法，該方法包括將一組抗原肽與一種或幾種不同的熱休克蛋白在體外形成復(fù)合物，其中該組抗原肽的生成方法包括用一種或幾種蛋白酶消化蛋白制品，所述蛋白制品包含抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白。
3.一種制備熱休克蛋白與抗原肽復(fù)合物的方法，該方法包括將一組抗原肽與一種或幾種不同的熱休克蛋白在體外形成復(fù)合物，其中該組抗原肽的生成方法包括將包含抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的蛋白制品暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件中。
4.一種制備熱休克蛋白與抗原蛋白復(fù)合物的方法，該方法包括將蛋白制品與一種或幾種不同的熱休克蛋白在一定條件下進行體外接觸，使蛋白制品中的蛋白與所述熱休克蛋白形成復(fù)合物，其中蛋白制品包含抗原細胞或病毒顆粒，或存在于抗原細胞的細胞組分中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白。
5.一種制備熱休克蛋白與抗原肽復(fù)合物的方法，該方法包括下列步驟(a)用一種或幾種蛋白酶對包含抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的蛋白制品進行消化，以產(chǎn)生一組抗原肽；及(b)將該組抗原肽與一種或幾種不同的熱休克蛋白形成復(fù)合物。
6.一種制備α2-巨球蛋白與抗原蛋白復(fù)合物的方法，該方法包括將一組來源于抗原細胞或病毒顆粒的抗原蛋白與α2-巨球蛋白在體外形成復(fù)合物，其中該組抗原蛋白分別包含抗原細胞或病毒顆粒，或存在于抗原細胞的細胞組分中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白。
7.一種制備α2-巨球蛋白與抗原肽復(fù)合物的方法，該方法包括將一組抗原肽與α2-巨球蛋白在體外形成復(fù)合物，其中該組抗原肽的生成方法包括用一種或幾種蛋白酶消化蛋白制品，所述蛋白制品包含抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白。
8.一種制備α2-巨球蛋白與抗原肽復(fù)合物的方法，該方法包括將一組抗原肽與α2-巨球蛋白在體外形成復(fù)合物，其中該組抗原肽的生成方法包括將包含抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的蛋白制品暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件中。
9.一種制備α2-巨球蛋白與抗原蛋白復(fù)合物的方法，該方法包括將蛋白制品與α2-巨球蛋白在一定條件下進行體外復(fù)合，使蛋白制品中的蛋白與所述α2-巨球蛋白形成復(fù)合物，其中蛋白制品包含抗原細胞或病毒顆粒，或存在于抗原細胞的細胞組分中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白。
10.一種制備α2-巨球蛋白與抗原肽復(fù)合物的方法，該方法包括下列步驟(a)用一種或幾種蛋白酶對包含抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的蛋白制品進行消化，以產(chǎn)生一組抗原肽；及(b)將該組抗原肽與α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
11.權(quán)利要求1或5的方法，其中該組抗原蛋白包括胞漿蛋白。
12.權(quán)利要求2、3、7或8的方法，其中蛋白制品包括胞漿蛋白。
13.權(quán)利要求1或5的方法，其中該組抗原蛋白包括膜來源蛋白。
14.權(quán)利要求2、3、7或8的方法，其中蛋白制品包括膜來源蛋白。
15.權(quán)利要求1或5的方法，其中該組抗原蛋白是分離的。
16.權(quán)利要求2、3、7或8的方法，其中蛋白制品是分離的。
17.權(quán)利要求1、2、3、5、7或8的方法，其中該組抗原蛋白或蛋白制品包括癌細胞或其細胞組分中不同蛋白的至少50％或至少50種不同蛋白。
18.權(quán)利要求1、2、3、5、7或8的方法，其中該組抗原蛋白或蛋白制品包含細胞中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白，所述細胞顯示對感染性疾病致病原的抗原性。
19.權(quán)利要求1、2、3、5、7或8的方法，其中該組抗原蛋白或蛋白制品包含細胞中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白，所述細胞為用編碼感染性病原的抗原的核酸分子轉(zhuǎn)化的細胞以及表達該抗原的細胞。
20.權(quán)利要求1、2、3、5、7或8的方法，其中該組抗原蛋白或蛋白制品包括細胞中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白，所述細胞為用編碼腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的核酸分子轉(zhuǎn)化的細胞以及表達腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的細胞。
21.權(quán)利要求1、2、3、5、7或8的方法，其中該組抗原蛋白或蛋白制品包含人類細胞不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白。
22.權(quán)利要求2或7的方法，其中消化步驟在使該組抗原肽大小為7個氨基酸殘基至20個氨基酸殘基之間的條件下實施。
23.權(quán)利要求2或7的方法，其中蛋白酶選自胰酶、葡萄球菌肽酶I、糜蛋白酶、胃蛋白酶、組織蛋白酶G、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶。
24.權(quán)利要求2或7的方法，其中在所述消化步驟中使用蛋白酶混合物。
25.權(quán)利要求3或8的方法，其中蛋白制品暴露于ATP后于0.1％三氟乙酸中超聲處理。
26.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中熱休克蛋白是分離的。
27.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中熱休克蛋白選自HSP60、HSP70、HSP90、gp96、鈣網(wǎng)蛋白、grp78、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)、HSP110及grp170。
28.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述不同熱休克蛋白是選自HSP60、HSP70、HSP90、gp96、鈣網(wǎng)蛋白、grp78、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)、HSP110及grp170的不同熱休克蛋白的組合。
29.權(quán)利要求6、7或8的方法，其中α2-巨球蛋白是分離的。
30.權(quán)利要求5或10的方法，其中在單獨的反應(yīng)中用不同的蛋白酶重復(fù)(a)步驟，將不同消化體系產(chǎn)生的抗原肽在實施(b)步驟前組合。
31.權(quán)利要求4的方法，其中所述接觸包括用交聯(lián)劑處理蛋白制品及熱休克蛋白。
32.權(quán)利要求9的方法，其中所述接觸包括用交聯(lián)劑處理蛋白制品及α2-巨球蛋白。
33.權(quán)利要求5或10的方法，其中在實施(b)步驟前還包括將該組抗原肽分離的步驟。
34.權(quán)利要求2或7的方法，其還包括滅活蛋白酶或?qū)⒌鞍酌笍脑摻M抗原肽中分離的步驟。
35.權(quán)利要求1的方法，其還包括分離熱休克蛋白和該組抗原蛋白的復(fù)合物。
36.權(quán)利要求2或3的方法，其還包括分離熱休克蛋白和該組抗原肽的復(fù)合物。
37.權(quán)利要求6的方法，其還包括分離α2-巨球蛋白和該組抗原蛋白的復(fù)合物。
38.權(quán)利要求7或8的方法，其還包括分離α2-巨球蛋白和該組抗原肽的復(fù)合物。
39.一種在受試者中誘導(dǎo)針對第一抗原細胞或病毒顆粒的免疫應(yīng)答的方法，包括對該受試者施用包含免疫原性量的復(fù)合物的組合物，其中復(fù)合物包含與抗原蛋白復(fù)合的熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，復(fù)合物的生成方法包括將熱休克蛋白或α2-巨球蛋白與抗原蛋白形成復(fù)合物，所述抗原蛋白來源于第二抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白，所述第二抗原細胞或病毒顆粒表達至少一種與第一抗原細胞或病毒顆粒共同的抗原決定簇。
40.一種在受試者中誘導(dǎo)針對第一抗原細胞或病毒顆粒的免疫應(yīng)答的方法，包括對該受試者施用包含免疫原性量的復(fù)合物的組合物，其中復(fù)合物包含與抗原肽復(fù)合的熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，復(fù)合物的生成方法包括(a)用一種或幾種蛋白酶對包含表達至少一種與第一抗原細胞或病毒顆粒共同的抗原決定簇的第二抗原細胞、其細胞組分或第二病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的蛋白制品進行消化，產(chǎn)生一組抗原肽；及(b)將該組抗原肽與熱休克蛋白或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
41.一種在受試者中誘導(dǎo)針對第一抗原細胞或病毒顆粒的免疫應(yīng)答的方法，包括對該受試者施用包含免疫原性量的復(fù)合物的組合物，其中復(fù)合物包含與抗原肽復(fù)合的熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，其生成方法包括(a)將包含表達至少一種與第一抗原細胞或病毒顆粒共同的抗原決定簇的第二抗原細胞、其細胞組分或第二病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的蛋白制品暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件中，產(chǎn)生一組抗原肽；(b)將該組抗原肽回收；及(c)將該組抗原肽與熱休克蛋白或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
42.一種治療或預(yù)防一類癌癥的方法，該方法包括將包含熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白的復(fù)合物的組合物，以治療或預(yù)防有效量施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者，所述熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白與抗原蛋白形成復(fù)合物，所述復(fù)合物的生成方法包括將熱休克蛋白或α2-巨球蛋白與來源于該類癌癥細胞中不同蛋白的至少50％或至少50種不同蛋白的抗原蛋白形成復(fù)合物。
43.一種治療或預(yù)防一類癌癥的方法，該方法包括將包含熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白的復(fù)合物的組合物，以治療或預(yù)防有效量施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者，所述熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白與抗原肽形成復(fù)合物，其中復(fù)合物的生成方法包括(a)用一種或幾種蛋白酶消化包含存在于該類癌癥細胞中不同蛋白的至少50％或至少50種不同蛋白的蛋白制品，產(chǎn)生一組抗原肽；及(b)將該組抗原肽與熱休克蛋白或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
44.一種治療或預(yù)防一類癌癥的方法，該方法包括將包含熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白的復(fù)合物的組合物，以治療或預(yù)防有效量施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者，所述熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白與抗原肽形成復(fù)合物，其中復(fù)合物的生成方法包括(a)將包含存在于該類癌癥細胞中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的蛋白制品暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件中，產(chǎn)生一組抗原肽；(b)將該組抗原肽回收；及(c)將該組抗原肽與熱休克蛋白或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
45.一種治療或預(yù)防一類感染性疾病的方法，該方法包括將包含熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白的復(fù)合物的組合物，以治療或預(yù)防有效量施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者，所述熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白與抗原蛋白復(fù)合，其中復(fù)合物的生成方法包括將熱休克蛋白或α2-巨球蛋白與來源于表達感染性疾病致病原的抗原決定簇的抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的抗原蛋白形成復(fù)合物。
46.一種治療或預(yù)防一類感染性疾病的方法，該方法包括將含熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白的復(fù)合物的組合物，以治療或預(yù)防有效量施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者，所述熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白與抗原肽復(fù)合，其中復(fù)合物的生成方法包括用一種蛋白酶或多種不同蛋白酶消化蛋白制品，所述蛋白制品包含存在于表達該感染性疾病病原的抗原決定簇的抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白；將該組抗原肽與熱休克蛋白或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
47.一種治療或預(yù)防一類感染性疾病的方法，該方法包括將含熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白的復(fù)合物的組合物，以治療或預(yù)防有效量施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者，所述熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白與抗原肽復(fù)合，其中該復(fù)合物的生成方法包括(a)將包含存在于表達感染性疾病病原的抗原決定簇的抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的蛋白制品暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件中，產(chǎn)生一組抗原肽；(b)將該組抗原肽回收；及(c)將該組抗原肽與熱休克蛋白或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
48.權(quán)利要求39、40或41的方法，其中所述第一抗原細胞及第二抗原細胞是同一種細胞。
49.權(quán)利要求45、46或47的方法，其中抗原細胞用感染性疾病的致病原感染。
50.權(quán)利要求45、46或47的方法，其中抗原細胞用具有該致病原抗原性的致病原變異體感染。
51.權(quán)利要求42、43、44、45、46或47的方法，其中組合物還包括佐劑。
52.權(quán)利要求42、43、44、45、46或47的方法，其中所述施用以一周的間隔重復(fù)。
53.權(quán)利要求42、43、44、45、46或47的方法，其中所述施用在受試者的同一部位上重復(fù)。
54.權(quán)利要求42、43、44、45、46或47的方法，其中所述施用是真皮內(nèi)施用。
55.權(quán)利要求42、43、44、45、46或47的方法，其中所述施用是皮下施用。
56.一種治療或預(yù)防一類癌癥的方法，該方法包括將包含治療或預(yù)防有效量的抗原呈遞細胞的組合物施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者，其中該抗原呈遞細胞預(yù)先用復(fù)合物致敏，該復(fù)合物包含與抗原蛋白形成復(fù)合物的熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，其生成方法包括將熱休克蛋白或α2-巨球蛋白與來源于該類癌癥細胞的不同蛋白的至少50％，或至少50種不同蛋白的抗原蛋白形成復(fù)合物。
57.一種治療或預(yù)防一類癌癥的方法，該方法包括將包含治療或預(yù)防有效量的抗原呈遞細胞的組合物施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者，其中該抗原呈遞細胞預(yù)先用復(fù)合物致敏，該復(fù)合物包括與抗原肽形成復(fù)合物的熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，其生成方法包括用一種蛋白酶或多種不同蛋白酶消化包含存在于該類癌癥細胞中不同蛋白的至少50％或至少50種不同蛋白的蛋白制品，產(chǎn)生一組抗原肽；及將該組抗原肽與熱休克蛋白或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
58.一種治療或預(yù)防一類癌癥的方法，該方法包括將包含治療或預(yù)防有效量的抗原呈遞細胞的組合物施用于需要這種治療或預(yù)防的受試者，其中該抗原呈遞細胞預(yù)先用復(fù)合物致敏，該復(fù)合物包括與抗原肽形成復(fù)合物的熱休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，其生成方法包括(a)將包含存在于該類癌癥細胞中不同蛋白的至少50％或至少50種不同蛋白的蛋白制品暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸性條件中，產(chǎn)生一組抗原肽；(b)將該組抗原肽回收；及(c)將該組抗原肽與熱休克蛋白或α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
59.權(quán)利要求1的方法，其中該組抗原蛋白通過共價鍵與熱休克蛋白形成復(fù)合物。
60.權(quán)利要求1的方法，其中該組抗原蛋白通過非共價鍵與熱休克蛋白形成復(fù)合物。
61.權(quán)利要求2或3的方法，其中該組抗原肽通過共價鍵與熱休克蛋白形成復(fù)合物。
62.權(quán)利要求2或3的方法，其中該組抗原肽通過非共價鍵與熱休克蛋白形成復(fù)合物。
63.權(quán)利要求6的方法，其中該組抗原蛋白通過共價鍵與α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
64.權(quán)利要求6的方法，其中該組抗原蛋白通過非共價鍵與α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
65.權(quán)利要求7或8的方法，其中該組抗原肽通過共價鍵與α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
66.權(quán)利要求7或8的方法，其中該組抗原肽通過非共價鍵與α2-巨球蛋白形成復(fù)合物。
67.權(quán)利要求3或8的方法，其中在形成復(fù)合物之前還包括將該組抗原肽回收。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療感染性疾病及癌癥的方法及組合物。本發(fā)明的方法包括將抗原細胞或病毒顆粒的一組抗原蛋白或抗原肽與一種或幾種不同的熱休克蛋白在體外形成復(fù)合物。該組抗原蛋白或抗原肽或用于產(chǎn)生抗原肽的蛋白制品至少包括抗原細胞或病毒顆粒中不同蛋白的至少50％或是至少50種不同的蛋白?？乖牡闹苽浞椒òㄓ靡环N或幾種蛋白酶消化抗原細胞、其細胞組分或病毒顆粒的蛋白制品，或?qū)⒌鞍字破繁┞队贏TP、鹽酸胍和/或酸性條件中。
文檔編號A61P31/12GK1635896SQ02820825
公開日2005年7月6日 申請日期2002年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月20日
發(fā)明者P·K·斯里瓦斯塔瓦 申請人:康涅狄格大學(xué)健康中心