專利名稱：用于制備氨基甲?；撞济顾氐拇x控制發(fā)酵法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及開發(fā)一種用于制備6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐拇x控制發(fā)酵方法。
更特別地本發(fā)明公開了，通過調(diào)節(jié)葡萄糖、谷氨酸和氨型氮的含量來控制發(fā)酵過程，培養(yǎng)黑暗鏈霉素菌株來生產(chǎn)6‘-O-氨基甲酰基妥布霉素。
背景技術(shù)：
妥布霉素的化學(xué)名為O-3-氨基-3-脫氧-α-D-葡吡喃糖基-(1→6)O-[2，6-二氨基-2，3，6-三脫氧-α-D-核-己吡喃糖基-(1→4)]-2-脫氧-D-鏈霉胺[α/k/s“4-[2，6-二氨基-2，3，6-三脫氧-α-D-葡吡喃糖基]-6-[3-氨基-3-脫氧-α-D-葡吡喃糖基]-2-脫氧鏈霉胺”，尼拉霉素因子6；NF6；妥布拉霉素；托普霉素；抗普霉素；暗霉素。妥布霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 妥布霉素是一種廣譜活性抗生素，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌有效。對(duì)其敏感的細(xì)菌包括，金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎葡萄球菌、綠膿假單胞菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形菌、肺炎桿菌、摩氏摩根氏菌、流感嗜血桿菌、埃及嗜血桿菌、結(jié)膜炎莫拉氏菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌。已知妥布霉素對(duì)眼睛和耳朵感染具有很好的抗菌圖。
當(dāng)前，妥布霉素是通過培養(yǎng)黑暗鏈霉素菌來制備的。經(jīng)常用分批進(jìn)料技術(shù)來生產(chǎn)氨基甲?；撞济顾?。在分批發(fā)酵中，碳源與氮源的代謝不是被直接控制。由于培養(yǎng)期間養(yǎng)分的消耗，氨基甲?；撞济顾氐氖章蚀蟠蠼档?。同時(shí)，氨基甲?；撞济顾匕l(fā)酵過程對(duì)氧供應(yīng)也很敏感。此外，由于培養(yǎng)引入了污染危險(xiǎn)，由培養(yǎng)期間的蒸發(fā)所引起的體積損失也影響收率和體積補(bǔ)償。
因此，期望開發(fā)出一種技術(shù)，借此，通過一種微調(diào)控制技術(shù)來調(diào)節(jié)發(fā)酵期間的進(jìn)料曲線微校正，以便改進(jìn)具有基本上較高收率和純度的氨基甲?；撞济顾氐陌l(fā)酵生產(chǎn)。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的目的就是提供一種即經(jīng)濟(jì)又高效的制備氨基甲酰基妥布霉素的方法。本公開方法包括，培養(yǎng)生成6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐奈⑸铮⑸婕巴ㄟ^這種微生物來代謝控制6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐陌l(fā)酵過程，以便生產(chǎn)出高純度產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，在培養(yǎng)生成6‘-O-氨基甲酰基妥布霉素的微生物期間，選擇性地將養(yǎng)分調(diào)節(jié)至一恒定含量。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供，通過獨(dú)立地維持葡萄糖、谷氨酸和氨型氮的含量，來代謝控制6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐陌l(fā)酵過程。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐母呤章拾l(fā)酵方法，該方法在浸沒培養(yǎng)物中，和在大約37℃-大約41℃的溫度范圍內(nèi)，在一含有可同化碳源與氮源以及一種礦物鹽的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
優(yōu)選地，此方法包括在一可以穩(wěn)定地用于生產(chǎn)6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐陌l(fā)酵肉湯中，培養(yǎng)一種生成6‘-O-妥布霉素的微生物菌株，借此，在次代謝期間，通過連續(xù)進(jìn)料葡萄糖、谷氨酸鈉和銨鹽溶液，將菌株的碳和氮代謝控制在，葡萄糖含量大約為0.001％-大約0.5％，谷氨酸含量為大約0.005％-大約0.1％，氨型氮含量為大約0.03％-大約0.2％。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，養(yǎng)分的調(diào)節(jié)相互獨(dú)立進(jìn)行。
根據(jù)一實(shí)施方案，在發(fā)酵期間，將無機(jī)磷酸鹽以每天大約0.001％-大約0.002％的量進(jìn)料。
本發(fā)明提供了一種由黑暗鏈霉素菌制備6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐姆椒?，期間代謝控制6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐漠a(chǎn)生，包括a)制備一種含有生成6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐奈⑸锏陌l(fā)酵肉湯；b)將可同化碳源與可同化氮源控制在一恒定含量；c)回收6‘-O-氨基甲?；撞济顾?。
本發(fā)明規(guī)定，發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度范圍為大約37℃-大約41℃。
本發(fā)明規(guī)定，發(fā)酵培養(yǎng)基是一種浸沒培養(yǎng)物。
本發(fā)明規(guī)定，發(fā)酵肉湯中含有使用不同黑暗鏈霉素菌株的可同化碳源與氮源以及礦物鹽。
本發(fā)明規(guī)定，將可同化碳源與氮源控制在葡萄糖含量為大約0.001％-大約0.5％。本發(fā)明還規(guī)定，將可同化碳源與氮源控制在谷氨酸含量為大約0.005％-大約0.1％。本發(fā)明還規(guī)定，將可同化碳源與氮源控制在氨型氮含量為大約0.03％-大約0.2％。
本發(fā)明規(guī)定，通過相互獨(dú)立而連續(xù)地進(jìn)料葡萄糖、谷氨酸鈉和銨離子(NH4+)溶液，來控制可同化碳源與氮源。
本發(fā)明還提供了用磷酸來調(diào)節(jié)葡萄糖的pH值。優(yōu)選地，葡萄糖溶液的pH值范圍在大約4-大約5之間。本發(fā)明也提供了一種可以進(jìn)料至發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)磷酸鹽，此時(shí)，磷酸鹽的進(jìn)料量為每天大約0.001％-大約0.002％。
發(fā)明詳述在本文中，術(shù)語“ppm”指的是百萬分之一；“rpm”指的是轉(zhuǎn)/分鐘，“vvm”指的是體積/(體積·分鐘)。
在本文中，術(shù)語“NH3-N”指的是氨型氮。
除非特別說明，術(shù)語“％”指的是重量％。例如，0.001％葡萄糖指的是0.001g葡萄糖比100g發(fā)酵肉湯。
在本文中，術(shù)語“6‘-O-氨基甲酰基妥布霉素”指的是一種氨基甲?；问降耐撞济顾?。在合成妥布霉素期間，妥布霉素是以氨基甲?；男问接蒙锓椒ê铣傻?，具體是6‘-O-氨基甲?；撞济顾亍Ｋ脖环Q為氨基甲?；撞济顾亍?br> 在本文中，術(shù)語“分批進(jìn)料技術(shù)”指的是一種發(fā)酵方法，其中在發(fā)酵過程中，以分批的形式將一種或多種營(yíng)養(yǎng)組分加入。在發(fā)酵期間，當(dāng)養(yǎng)分以一個(gè)或兩個(gè)百分點(diǎn)的方式加入時(shí)(大約1％-大約2％)，即被稱為起停式發(fā)酵法。在發(fā)酵期間，當(dāng)養(yǎng)分以多種類而量少的方式加入(大約0.02％-大約0.05％)或以真(不間斷)連續(xù)進(jìn)料時(shí)，被稱為連續(xù)進(jìn)料發(fā)酵法。在本文中，術(shù)語“連續(xù)進(jìn)料”指的是少量進(jìn)料(大約0.02％-大約0.05％)或真連續(xù)進(jìn)料養(yǎng)分和氧。
在本文中，術(shù)語“可同化的”指的是一特定的微生物，它有一套可以吸收養(yǎng)分和消耗或利用或分解這些養(yǎng)分的酶體系，在生物合成微生物復(fù)雜組分時(shí)使用。
在本文中，術(shù)語“一種礦物鹽”指的是一種生物上重要的元素和微量元素的鹽，包括鈣、鎂、鐵、鋅、磷酸鹽、錳、鈉、鉀和鈷。
在本文中，術(shù)語“主發(fā)酵器”指的是一用以在發(fā)酵過程中，用來生長(zhǎng)黑暗鏈霉素菌和用來制備6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐娜萜鳌?br> 因此，本發(fā)明提供一種，通過獨(dú)立地控制發(fā)酵過程來制備6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐姆椒?；優(yōu)選地，通過連續(xù)調(diào)節(jié)葡萄糖、谷氨酸和氨型氮的含量；最優(yōu)選地，相互單獨(dú)地進(jìn)行調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明，妥布霉素以一種氨基甲?；男问?，通過生物合成的方法制備出來，也就是6‘-O-氨基甲?；撞济顾亍Ｔ谛纬?‘-O-氨基甲?；撞济顾氐倪^程中，碳與氮的代謝形式、比例以及速率都是很重要的。在分批發(fā)酵法中，這種代謝不被直接控制。本發(fā)明提供了用以優(yōu)化發(fā)酵肉湯中葡萄糖和谷氨酸的含量以及優(yōu)化碳與氮代謝比率的方法，以便形成氨基甲?；撞济顾亍；谶@些信息，本發(fā)明還提供了一種用于生產(chǎn)6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐男滦桶l(fā)酵技術(shù)(即，控制分批進(jìn)料技術(shù))。雖然用于其他發(fā)酵產(chǎn)品的分批進(jìn)料技術(shù)通常為人們所熟知并應(yīng)用；然而，本發(fā)明所提供的一種，通過控制可同化碳與氮的代謝，用控制分批進(jìn)料來生產(chǎn)6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐募夹g(shù)，對(duì)6‘-O-氨基甲?；撞济顾貋碚f卻是獨(dú)一無二的。
在本發(fā)明的發(fā)酵方法中，可以使用不同的可同化碳源與氮源。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括，用葡萄糖或谷氨酸(或其鹽)作為可同化碳源。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括，用氨型氮作為可同化氮源。
根據(jù)本發(fā)明，可同化氮源選自可代謝的有機(jī)化合物和無機(jī)化合物。這樣的化合物包括尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、硝酸銨等，以及它們的混合物。優(yōu)選地，氨型氮是硫酸銨[(NH4)2SO4]。
根據(jù)本發(fā)明，在生物合成氨基甲?；撞济顾氐倪^程中，調(diào)節(jié)葡萄糖、谷氨酸和“氨型氮”的含量是很重要的。本發(fā)明提供了一種制備6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐陌l(fā)酵方法，其中將“至少葡萄糖、谷氨酸或氨型氮中的一種含量”控制或調(diào)節(jié)在一恒定的含量，從而得到一種高收率和高純度的6‘-O-氨基甲?；撞济顾?。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明發(fā)酵方法的一種優(yōu)選的生成6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐奈⑸锞晔呛诎垫溍顾鼐?。優(yōu)選地，黑暗鏈霉素菌是保藏號(hào)為NCAIM B(P)000169的黑暗鏈霉素菌株。優(yōu)選地，黑暗鏈霉素菌是保藏號(hào)為NCAIM B(P)000204的黑暗鏈霉素菌株。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將葡萄糖含量調(diào)節(jié)在大約0.001％-大約0.5％。優(yōu)選地，將葡萄糖含量調(diào)節(jié)在大約0.001％-大約0.4％。最優(yōu)選地，將葡萄糖含量調(diào)節(jié)在大約0.001％-大約0.05％。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將谷氨酸含量調(diào)節(jié)在大約0.005％-大約0.1％。更優(yōu)選地，將谷氨酸含量調(diào)節(jié)在大約0.001％-大約0.1％。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將以鹽形式(例如，谷氨酸鈉)存在的谷氨酸的含量調(diào)節(jié)在大約0.005％-大約0.1％。更優(yōu)選地，將谷氨酸鹽的含量調(diào)節(jié)在大約0.001％-大約0.1％。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將氨型氮含量調(diào)節(jié)在大約0.03％-大約0.2％。更優(yōu)選地，將氨型氮含量調(diào)節(jié)在大約0.02％-大約0.2％。
優(yōu)選地，代謝控制發(fā)酵6‘-O-氨基甲酰基妥布霉素是通過相互獨(dú)立地連續(xù)進(jìn)料葡萄糖、谷氨酸鈉和氨型氮溶液來進(jìn)行的。
妥布霉素是一種氨基苷類抗生素。在生物合成6‘-O-氨基甲酰基妥布霉素期間，葡萄糖的代謝有兩種途徑糖酵解循環(huán)途徑和磷酸己糖途徑，其中的代謝產(chǎn)物可能抑制6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐纳锖铣伞４x控制發(fā)酵法是通過維持葡萄糖在發(fā)酵肉湯中的含量來調(diào)節(jié)的。優(yōu)選地，將葡萄糖維持在一低含量水平(例如，大約0.001％-大約0.5％)，以確保不存在葡萄糖代謝產(chǎn)物(或葡萄糖代謝中間體)引起的抑制作用。
類似地，代謝控制發(fā)酵法是通過維持谷氨酸在發(fā)酵肉湯中的含量來調(diào)節(jié)的。優(yōu)選地，將谷氨酸(或其鹽)維持在一低含量水平(例如，大約0.005％-大約0.1％)，以確保不存在谷氨酸鹽代謝產(chǎn)物引起的抑制作用。
類似地，代謝控制發(fā)酵法是通過維持氨型氮在發(fā)酵肉湯中的含量來調(diào)節(jié)的。優(yōu)選地，將氨型氮維持在一低含量水平(例如，大約0.03％-大約0.2％)。將氨型氮調(diào)節(jié)在一低含量水平是為了確保氨基轉(zhuǎn)移過程中底物的充足供應(yīng)，同時(shí)又不會(huì)引起與代謝產(chǎn)物有關(guān)的問題。
本發(fā)明提供的代謝控制發(fā)酵法是通過維持葡萄糖、谷氨酸和氨型氮中的至少一種的含量來實(shí)現(xiàn)的。
在另一本發(fā)明的實(shí)施方案中，進(jìn)料至發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)磷酸鹽，只需其總量足以使發(fā)酵過程能夠有效地進(jìn)行。優(yōu)選地，無機(jī)磷酸鹽的加入量為每天大約0.001％-大約0.002％。
本發(fā)明提供的6‘-O-氨基甲?；撞济顾卮x控制發(fā)酵法，一般情況下，6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐氖章士梢圆坏陀诖蠹s30％。
用下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但是卻決不可以理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1種子培養(yǎng)基 主發(fā)酵培養(yǎng)基g/l g/l一水合右旋糖 30 50大豆粉20 35酪蛋白酸 2.5 6.75胰酵素0.050.17氯化銨3 5硝酸銨1 -硫酸鎂5 -硝酸鈷0.010.01碳酸鈣3 5豆油 15 16
棕櫚油 15 16硫酸鋅 -1在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)黑暗鏈霉素菌在一60L的容器中制備種子培養(yǎng)基(不含葡萄糖)。并在大約121℃下，將種子培養(yǎng)基殺菌大約60min。
分離制備葡萄糖溶液。用鹽酸將此葡萄糖溶液的pH值調(diào)節(jié)至大約4.0-大約5.0。在大約121℃下，將葡萄糖溶液殺菌大約30min。然后，將已殺菌的葡萄糖溶液加入到已殺菌的種子培養(yǎng)基中。
將黑暗鏈霉素菌株NCAIM B(P)000169接種到大約500ml的已殺菌種子培養(yǎng)基中(含葡萄糖)。將黑暗鏈霉素菌株的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)菌以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的方式生長(zhǎng)。培養(yǎng)參數(shù)為，溫度大約37℃；壓力大約0.4巴；混合速率大約2.6m/sec；通氣速率大約0.4ppm。
在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)黑暗鏈霉素菌在一300L的容器中制備主發(fā)酵培養(yǎng)基(不含葡萄糖)。在大約121℃下，將主發(fā)酵培養(yǎng)基殺菌大約60min。
分離制備葡萄糖溶液。用鹽酸將此葡萄糖溶液的pH值調(diào)節(jié)至大約4.0-大約5.0。在大約121℃下，將葡萄糖溶液殺菌大約30min。然后，將已殺菌的葡萄糖溶液加入到已殺菌的主發(fā)酵培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)24h之后，將種子階段的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到主發(fā)酵器中。種子階段至主發(fā)酵的轉(zhuǎn)移率為10％。主發(fā)酵器的培養(yǎng)參數(shù)如下。0-70h內(nèi)的溫度為大約37℃，70h-發(fā)酵過程結(jié)束為大約39℃；通氣速率大約0.1ppm；攪拌速率為大約250rpm；內(nèi)壓為大約0.2巴。
制備8g/l的谷氨酸鈉培養(yǎng)基溶液。同時(shí)，再制備10g/l的硫酸鎂培養(yǎng)基溶液。將谷氨酸鈉溶液和硫酸鎂溶液在大約121℃下，殺菌大約60min。然后再將20L的這兩種溶液，在培養(yǎng)24h后，加入到主發(fā)酵培養(yǎng)基中。培養(yǎng)共耗時(shí)144h。
培養(yǎng)基中初始的葡萄糖在發(fā)酵80h后耗盡。培養(yǎng)基中初始的谷氨酸鹽在發(fā)酵60h后被徹底消耗。培養(yǎng)基中初始的120mg/100ml NH3-N的含量(用甲醛滴定法測(cè)定)在發(fā)酵50h后低于60mg/100ml，并且在發(fā)酵結(jié)束時(shí)徹底耗盡。
用高效液相色譜儀測(cè)試所得的收率，阿泊拉霉素為1,856μg/g；氨基甲?；敲顾貫?78μg/g；6‘-O-氨基甲?；撞济顾貫?,968μg/g。
實(shí)施例2種子培養(yǎng)基 主發(fā)酵培養(yǎng)基g/l g/l一水合右旋糖3050大豆粉 2050硫酸鎂 5 -硫酸銨 3 5碳酸鈣 3 5豆油3032硫酸鋅 - 1磷酸二氫鉀 - 0.45在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)黑暗鏈霉素菌在一60L的容器中制備種子培養(yǎng)基。在大約121℃下，將種子培養(yǎng)基殺菌大約60min。
分離制備葡萄糖溶液。用鹽酸將此葡萄糖溶液的pH值調(diào)節(jié)至大約4.0-大約5.0。在大約121℃下，將葡萄糖溶液殺菌大約30min。然后，將已殺菌的葡萄糖溶液加入到已殺菌的種子培養(yǎng)基中。
將黑暗鏈霉素菌株NCAIM B(P)000169接種到大約500ml的已殺菌種子培養(yǎng)基中。將黑暗鏈霉素菌株的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)菌以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的方式生長(zhǎng)。培養(yǎng)參數(shù)與實(shí)施例1中的培養(yǎng)參數(shù)相似。
在主發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)黑暗鏈霉素菌在300L的容器中制備主發(fā)酵培養(yǎng)基。在大約121℃下，將此主發(fā)酵培養(yǎng)基殺菌大約60min。
分離制備葡萄糖溶液。用鹽酸將此葡萄糖溶液的pH值調(diào)節(jié)至大約4.0-大約5.0。在大約121℃下，將葡萄糖溶液殺菌大約30min。然后，將已殺菌的葡萄糖溶液加入到已殺菌的主發(fā)酵培養(yǎng)基中。
將種子階段的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到主發(fā)酵器中的條件與實(shí)施例1中描述的條件相似。培養(yǎng)時(shí)間大約為20h。培養(yǎng)24h后進(jìn)料，培養(yǎng)參數(shù)與實(shí)施例1中描述的培養(yǎng)參數(shù)相似。
培養(yǎng)基中葡萄糖、谷氨酸鹽和氨型氮的耗盡(也即，消耗)也與實(shí)施例1中描述的情況相似。
用高效液相色譜儀測(cè)試6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐氖章蕿?,150μg/g。
實(shí)施例3用與實(shí)施例2中描述的相似方法制備種子培養(yǎng)基。將黑暗鏈霉素菌株NCAIM B(P)000204接種到大約500ml的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)參數(shù)與實(shí)施例1中描述的參數(shù)相似。
用與實(shí)施例2中描述的相似方法制備主發(fā)酵培養(yǎng)基。種子階段發(fā)酵液轉(zhuǎn)移的條件與實(shí)施例1中描述的條件相似。培養(yǎng)時(shí)間大約為18h。在培養(yǎng)24h后的進(jìn)料培養(yǎng)參數(shù)與實(shí)施例1中描述的參數(shù)相似。
培養(yǎng)基中葡萄糖、谷氨酸鹽和氨型氮的消耗也與實(shí)施例1中描述的情況相似。
用高效液相色譜儀測(cè)試6‘-O-氨基甲酰基妥布霉素的收率為2,210μg/g。
實(shí)施例4用與實(shí)施例2中描述的相似方法制備種子培養(yǎng)基。將黑暗鏈霉素菌株NCAIM B(P)000169接種到大約500ml的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)參數(shù)與實(shí)施例2中描述的參數(shù)相似。
用與實(shí)施例2中描述的相似方法制備主發(fā)酵培養(yǎng)基，但是用磷酸來調(diào)節(jié)葡萄糖溶液的pH值。種子階段發(fā)酵液轉(zhuǎn)移的條件與實(shí)施例1中描述的條件相似，但是培養(yǎng)時(shí)間為大約18h。培養(yǎng)24h后進(jìn)料，培養(yǎng)參數(shù)與實(shí)施例1中描述的培養(yǎng)參數(shù)相似。
此外，制備50％的谷氨酸鈉溶液，并在121℃下殺菌60min，在制備50％的葡萄糖溶液后，用磷酸將其pH值調(diào)節(jié)到大約4.0-大約5.0，然后再于121℃下殺菌30min。葡萄糖溶液中磷酸鹽的含量在大約0.05％-大約0.2％。在生產(chǎn)期間，將葡萄糖的含量和谷氨酸鈉的含量分別控制在大約0.001％-大約0.05％和大約0.001％-大約0.1％，并將這些溶液在開始發(fā)酵24h之后至發(fā)酵結(jié)束時(shí)間段內(nèi)進(jìn)料。除了上述濃度外，也加入氨溶液，以便將氨型氮的含量控制在大約30mg/100ml-大約200mg/100ml之間(也即，大約0.03％-大約0.2％)。
用高效液相色譜儀測(cè)試6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐氖章蕿?,150μg/g。
實(shí)施例5用與實(shí)施例2中描述的相似方法制備種子培養(yǎng)基。將黑暗鏈霉素菌株NCAIM B(P)000204接種到大約500ml的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)參數(shù)與實(shí)施例2中描述的參數(shù)相似。
種子階段的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移的條件與實(shí)施例1中描述的條件相似，培養(yǎng)時(shí)間為大約16h。
用與實(shí)施例4中描述的相似方法制備主發(fā)酵培養(yǎng)基。類似于實(shí)施例4，制備50％的谷氨酸鈉溶液，并在121℃下殺菌60min。制備50％的葡萄糖溶液，并用磷酸將其pH值調(diào)節(jié)到大約4.0-大約5.0，然后再于121℃下殺菌30min。
代謝控制進(jìn)料發(fā)酵條件與實(shí)施例4中描述的條件相似。在生產(chǎn)期間，將葡萄糖的含量和谷氨酸鈉的含量分別控制在大約0.001％-大約0.5％和大約0.001％-大約0.1％，并將這些溶液在開始發(fā)酵24h之后至發(fā)酵結(jié)束時(shí)間段內(nèi)進(jìn)料。除了上述濃度外，也加入氨溶液，以便將發(fā)酵培養(yǎng)基中氨型氮的含量控制在大約20mg/100ml-大約200mg/100ml之間(也即，大約0.02％-大約0.2％)。
用高效液相色譜儀測(cè)試6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐氖章蕿?,030μg/g。
分批進(jìn)料技術(shù)的應(yīng)用，使得發(fā)酵肉湯中6‘-O-氨基甲?；撞济顾鼗钚暂^高。
進(jìn)料的結(jié)果是，不僅由蒸發(fā)引起的體積損失得到了補(bǔ)償，而且同時(shí)也使得分批的工作體積得到了增加，這樣，就可以更有效地利用發(fā)酵器體積，并且獲得較高量的活性組分。
在發(fā)酵期間，由于存在進(jìn)料曲線微校正的可能性，所以就得到了一種復(fù)雜和高度控制的技術(shù)。本發(fā)明提供了一種發(fā)酵方法，借此，由于葡萄糖、谷氨酸鹽和氨型氮的含量得到了調(diào)節(jié)，就可以確保進(jìn)料曲線微校正。
氨基甲?；撞济顾匕l(fā)酵對(duì)于氧供應(yīng)非常敏感。對(duì)于分批進(jìn)料技術(shù)而言，這一參數(shù)可以通過將內(nèi)壓和通氣速率調(diào)節(jié)至最佳需要值而很容易地得以控制。例如，當(dāng)所用的通氣速率高于0.1vvm或反壓高于0.2巴時(shí)，6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐牡味ǘ乳_始降低，同時(shí)，卡那霉素B(污染物)的含量將會(huì)增加(例如，比率6‘-O-氨基甲?；撞济顾?卡那霉素B變壞)。即使當(dāng)通氣速率為0.2vvm-0.4vvm時(shí)，滴定度可能下降25％-50％，同時(shí)，卡那霉素B的含量可能會(huì)增加一倍。根據(jù)本發(fā)明，通過使用代謝控制發(fā)酵工藝的分批進(jìn)料技術(shù)，就能夠輕易地控制雜質(zhì)的形成。因此，除了調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的內(nèi)壓和通氣速率外，通過連續(xù)地進(jìn)料可同化碳源與氮源以及無機(jī)磷酸鹽，就可以得到較好的6‘-O-氨基甲酰基妥布霉素最佳需要值。
因此，相對(duì)于類分批進(jìn)料技術(shù)(見BG50996)而言，使用連續(xù)進(jìn)料技術(shù)可以更容易地實(shí)現(xiàn)上述優(yōu)點(diǎn)。
通過使用分批進(jìn)料技術(shù)，可以制備較簡(jiǎn)單的起始培養(yǎng)基，而且，通過消除源自動(dòng)物的組分(例如，酪蛋白水解酶等)和防止具有潛在危險(xiǎn)的牛海綿狀腦病(BSE)污染，提供了升級(jí)這一技術(shù)的可能性。
本發(fā)明的范圍并未限于本文中所描述的幾個(gè)具體實(shí)施例。確實(shí)，除了本文中描述的實(shí)施例外，根據(jù)上述描述，各種對(duì)本發(fā)明的修改對(duì)那些本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改均在權(quán)利要求書之內(nèi)。本文中引用了大量文獻(xiàn)，并將這些公開在此全面地引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種由生成6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐奈⑸锷a(chǎn)6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐姆椒?，包括下列步驟a)制備一種含有生成6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐奈⑸锏陌l(fā)酵肉湯；b)將可同化碳源與可同化氮源調(diào)節(jié)在一恒定量；c)回收6‘-O-氨基甲?；撞济顾亍?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的生成6‘-O-氨基甲?；撞济顾氐奈⑸锸呛诎垫溍顾鼐?。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的可同化碳源是葡萄糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，將葡萄糖調(diào)節(jié)在大約0.001％-大約0.5％范圍內(nèi)的一恒定量。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，將葡萄糖調(diào)節(jié)在大約0.001％-大約0.4％范圍內(nèi)的一恒定量。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，將葡萄糖調(diào)節(jié)在大約0.001％-大約0.05％范圍內(nèi)的一恒定量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的可同化碳源是谷氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的可同化碳源是谷氨酸鈉。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中將可同化碳源調(diào)節(jié)在大約0.005％-大約0.1％范圍內(nèi)的一恒定量。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中將可同化碳源調(diào)節(jié)在大約0.001％-大約0.1％范圍內(nèi)的一恒定量。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的可同化氮源是氨型氮。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的氨型氮選自尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、硝酸銨和它們的混合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的氨型氮是硫酸銨。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中將氨型氮調(diào)節(jié)在大約0.03％-大約0.2％范圍內(nèi)的一恒定量。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中將氨型氮調(diào)節(jié)在大約0.02％-大約0.2％范圍內(nèi)的一恒定量。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，通過連續(xù)地進(jìn)料葡萄糖、谷氨酸鈉和硫酸銨，來控制發(fā)酵肉湯中恒定量的可同化碳源與可同化氮源。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中，葡萄糖、谷氨酸鈉和硫酸銨的連續(xù)進(jìn)料是相互獨(dú)立進(jìn)行的。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括連續(xù)地進(jìn)料一種礦物鹽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中的礦物鹽選自鈣、鎂、鐵、鋅、磷酸鹽、錳、鈉、鉀和鈷。
20.根據(jù)權(quán)利要求4、5或6之一的方法，其中，將葡萄糖溶液的pH值調(diào)節(jié)至大約4.0-大約5.0之間。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中，用一種無機(jī)磷酸鹽來調(diào)節(jié)葡萄糖溶液的pH值。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的無機(jī)磷酸鹽為磷酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中，在發(fā)酵期間將無機(jī)磷酸鹽以每天大約0.001％-大約0.002％的速率進(jìn)料。
24.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中黑暗鏈霉素菌株是NCAIMB(P)000169。
25.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中黑暗鏈霉素菌株是NCAIMB(P)000204。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)酵是一種浸沒培養(yǎng)。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)酵保持在大約37℃-41℃的溫度范圍內(nèi)。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法所制備的6‘-O-氨基甲酰基妥布霉素。
29.一種用于治療人類感染疾病的制劑，含有根據(jù)權(quán)利要求1的方法所制備的6‘-O-氨基甲?；撞济顾?。
30.一種用于治療人類眼睛和耳朵感染疾病的制劑，含有根據(jù)權(quán)利要求1的方法所制備的6‘-O-氨基甲?；撞济顾亍?br> 31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的制劑，其中，根據(jù)權(quán)利要求1的方法所制備的6‘-O-氨基甲?；撞济顾啬軌驓缛缦录?xì)菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎葡萄球菌、綠膿假單胞菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形菌、肺炎桿菌、摩氏摩根氏菌、流感嗜血桿菌、埃及嗜血桿菌、結(jié)膜炎莫拉氏菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌。
全文摘要
一種制備氨基甲?；撞济顾氐拇x控制發(fā)酵法，包括，在大約37℃－41℃內(nèi)，在含有可同化碳源與氮源和礦物鹽的培養(yǎng)基中，應(yīng)用在浸沒營(yíng)養(yǎng)中的不同黑暗鏈霉素菌株，并且通過在最佳范圍內(nèi)進(jìn)料，來控制可同化碳源與氮源。通過本發(fā)明，可以獲得高純度與高收率的氨基甲酰基妥布霉素。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1527715SQ02803558
公開日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2002年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月9日
發(fā)明者I·巴孔迪－科瓦克斯, I·C·諾沃特尼, J·埃爾戴, G·巴洛, P·塞雷斯, I 巴孔迪-科瓦克斯, 姿, 諾沃特尼 申請(qǐng)人:拜奧蓋爾藥廠有限公司