專(zhuān)利名稱(chēng)：膠原酶誘導(dǎo)法建立大鼠出血性腦梗死動(dòng)物模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立大鼠出血性腦梗死動(dòng)物模型的方法，用于模擬、研 究和防治人類(lèi)的出血性腦梗死等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦血管病是一種高發(fā)病率、高病死率和高致殘率的疾病，嚴(yán)重影響人們 的身體健康和生活質(zhì)量。在我國(guó)國(guó)民的死亡原因統(tǒng)計(jì)中腦血管病居第二位，約
占14。85%，每年死于腦血管病病人約150萬(wàn)，存活者約2/3留下殘疾。腦血管 病中70%左右為缺血性腦卒中，而出血性腦梗死是急性缺血性腦卒中的常見(jiàn)并 發(fā)癥，出血性腦梗死的發(fā)生率國(guó)內(nèi)外報(bào)道約為3% 43%,其中大面積腦梗死后 出血發(fā)生率更高，約為30% 76. 1%。自從1951年Fisher和Adams首先提出出血 性腦梗死這一臨床病理術(shù)語(yǔ)至今，出血性腦梗死的確切病理生理機(jī)制尚不清 楚， 一些學(xué)說(shuō)仍有爭(zhēng)議，亦無(wú)確定有效的治療方法。因而，深入開(kāi)展出血性 腦梗死病理生理機(jī)制的研究，可為預(yù)測(cè)出血性腦梗死的疾病衍變和預(yù)后、以 及為開(kāi)辟新的藥物或基因治療途徑提供理論依據(jù)。
局灶性腦缺血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究早在1975年就開(kāi)始應(yīng)用，因大腦中動(dòng)脈 (Middle Cerebral Artery MCA)是腦梗死發(fā)生最常見(jiàn)的部位，故大鼠急性 大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO)模型在研究中 的應(yīng)用最為廣泛。目前常用的實(shí)驗(yàn)性局灶性腦缺血模型有開(kāi)顱法、線栓法、 光化學(xué)法，這些方法各有所長(zhǎng)，但都存在一定缺陷。
腦出血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究始于20世紀(jì)60年代，先后建立了自體血注入的狗、 猴、兔、貓、豬、鼠等動(dòng)物模型。目前常用的實(shí)驗(yàn)性腦出血模型有以下4種 自體血注入法、膠原酶誘導(dǎo)法、微球囊充脹法、自發(fā)性腦出血。①自體血注 入腦出血模型不僅可以通過(guò)控制注血量做分級(jí)實(shí)驗(yàn)性腦出血研究，而且因?yàn)?是非肝素化自體血，可觀察血液凝固過(guò)程中血管活性物質(zhì)釋放對(duì)腦循環(huán)及腦組織的影響，因而較接近臨床腦出血，適合研究腦實(shí)質(zhì)出血的自然過(guò)程，病 理形態(tài)學(xué)等特點(diǎn)，可更好地觀察凝固過(guò)程中各種因子對(duì)腦組織代謝和血流的 影響，從而為臨床治療提供依據(jù)。這種模型制作方法用于大動(dòng)物時(shí)，產(chǎn)生的 血腫大小和形態(tài)較為一致；②膠原酶誘導(dǎo)法與急性腦出血相比，血腫形成 時(shí)間長(zhǎng)，且出血為一彌漫性滲血與腦組織混合在一起，這是本模型的不足之 處；③微球囊充脹法是一種純機(jī)械性的腦出血模型，盡管這種模型制作方 法簡(jiǎn)單、易操作、重復(fù)性好且無(wú)注入自體血模型的諸多弊端，但由于其與臨 床脫節(jié)太多，除用于腦出血血腫清除方面的研究外，較少應(yīng)用；④自發(fā)性腦 出血；盡管與臨床腦出血的病理生理接近，但由于其遺傳性血管損害以及模 型的不穩(wěn)定性、所需時(shí)間的不確定性、病灶大小的易變性以及模型的不可比 性，使其應(yīng)用受到限制。如上所述局灶性腦梗死、腦出血模型的建立均已成熟，但成熟、穩(wěn)定的 出血性腦梗死動(dòng)物模型未見(jiàn)報(bào)道。用自體血血栓注入法建立局灶性腦梗死動(dòng) 物模型，然后在不同的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)下頜靜脈給予尿激酶溶栓，從而建立出血性 腦梗死動(dòng)物模型，較符合臨床上的出血性腦梗死發(fā)生的病理生理狀態(tài)，但由 于該模型的梗死部位及出血部位、出血量及時(shí)間的不確定性，使該模型的穩(wěn) 定性、可重復(fù)性較差，不能滿足臨床應(yīng)用的要求。鑒于以上建立出血性腦梗 死動(dòng)物模型的缺點(diǎn)和不足，探索一種新的出血性腦梗死動(dòng)物模型建立方法， 對(duì)于研究和防治人類(lèi)的出血性腦梗死疾病具有重要意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種膠原酶誘導(dǎo)法建立大鼠出血性腦梗死動(dòng)物模型 的方法，用該方法建立的大鼠模型成本低廉、易于復(fù)現(xiàn)、穩(wěn)定性強(qiáng)且與人類(lèi)情況類(lèi)似。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的膠原酶屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，主要降解膠 原、層粘連蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)，病理狀態(tài)下可參與血腦屏障損傷。大量文獻(xiàn) 報(bào)道基質(zhì)金屬蛋白酶參與了出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生，能作為出血性轉(zhuǎn)化的獨(dú)立預(yù) 測(cè)因素。利用上述特點(diǎn)，向MCAO責(zé)任側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注入膠原酶，利用血流再 灌注使膠原酶進(jìn)入大腦中動(dòng)脈，在梗死所至血管損傷的基礎(chǔ)上膠原酶進(jìn)一步破壞血管，血流再灌注造成大腦中動(dòng)脈支配區(qū)域(梗死區(qū)域內(nèi))的出血，從 而建立大鼠出血性腦梗死動(dòng)物模型。
具體說(shuō)，本發(fā)明所說(shuō)的建立大鼠出血性腦梗死動(dòng)物模型的方法包括以下
步驟；
(1) 大鼠的準(zhǔn)備；
(2) 制備PE套管改良線栓；
取一段PE管，用一段長(zhǎng)度和外徑小于PE管的釣魚(yú)絲插入PE管一端，將該 端管口封閉并將釣魚(yú)絲固定，在接近PE管封閉端處打一個(gè)側(cè)孔，用另一段長(zhǎng) 度大于PE管的釣魚(yú)絲作為管芯從上述備好的PE管未封閉端插入直至PE管封閉 處，釣魚(yú)絲剩余部分留于PE管外，以PE管封閉端為起始點(diǎn)，于 10rnm， 15mm， 18mm，20mm處作標(biāo)記，酒精浸泡消毒、生理鹽水沖洗最后浸泡于肝 素中以備用；
(3) 采用線栓法建立SD大鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞模型參照Longa、 Kuga采 用頸外動(dòng)脈插入線栓法造模；
(4) 大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞成功后，將管芯拔出，向PE套管中注入膠原酶；
(5) 制備再灌注模型；
(6) 將經(jīng)以上步驟獲得的出血性腦梗死大鼠模型放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，分別 在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。
本發(fā)明采用三步法建立出血性腦梗死動(dòng)物模型，是腦梗死模型、膠原酶注 入和缺血再灌注模型的結(jié)合。腦梗死模型是沿用最廣泛的線栓法，梗死部位較 為恒定且接近臨床；膠原酶注入后結(jié)合再灌注方法，使梗死與出血的責(zé)任動(dòng)脈 一致，使模型更加接近于臨床。以PE套管代替線栓，是本方法的重點(diǎn)體現(xiàn)。向 管中注入不同藥物可能會(huì)得到與之相對(duì)應(yīng)的不同的模型，也為溶栓療法的研究 提供了一條新徑路。
本發(fā)明中，行為學(xué)評(píng)分采用傳統(tǒng)的Longa,Berderson,肢體對(duì)稱(chēng)試驗(yàn)，平衡木 試驗(yàn)評(píng)分方法，造模效果評(píng)定可信性高。
本發(fā)明取得的積極效果在于該模型的出血量及出血時(shí)間可人為控制，克 服了以往模型出血量及出血時(shí)間的不準(zhǔn)確性。所選大鼠均為成年雄性SD大鼠，大鼠血管變異率低，提高了造模成功率。手術(shù)創(chuàng)傷小，不影響大鼠肢體功能 且行為學(xué)評(píng)分準(zhǔn)確。所建立的大鼠模型具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，更接 近于臨床上出血性腦梗死的發(fā)生，使系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性研究出血性腦梗死的病 理生理機(jī)制，開(kāi)辟新的藥物治療途徑成為可能。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明。本實(shí)施例給出的建立出血性腦梗死大鼠模型的方法，包括以下步驟(1) 大鼠的準(zhǔn)備選擇清潔級(jí)雄性SD大鼠，在動(dòng)物繁育實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)備用。大鼠的體重選擇在300-320g的范圍，這個(gè)體重范圍的大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈起始處至 大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處的距離穩(wěn)定約為18.5土0.5 mm，并且易于立體定位。動(dòng)物 級(jí)別為清潔級(jí)，以防止其他污染對(duì)所建模型的干擾和影響，提高模型的存活 率。給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)詞料喂養(yǎng)和飲用純凈水，飼養(yǎng)環(huán)境為我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心多 層層流架。(2) 制備PE套管改良線栓① 所用材料PE管(外徑0.38mm、內(nèi)徑0.20腿)，尼龍釣魚(yú)絲(直徑 為O. 181mm)， 502膠水。② 制備方法取一段長(zhǎng)約40mm的PE管，以長(zhǎng)約l咖的尼龍釣魚(yú)絲完全 插入PE管一端，并用502膠水將尼龍釣魚(yú)絲與PE管粘牢固定，將該端封閉。在 盡可能接近PE管封閉端的地方將管打一個(gè)側(cè)孔，孔的大小要適中，保證膠原 酶能順利通過(guò)。另以一段長(zhǎng)約50mm的尼龍釣魚(yú)絲作為管芯插入上述PE管未封 閉端中，直至PE管封閉處，釣魚(yú)絲剩余部分留于PE管外，此即為制備好的PE 套管，即PE管+管芯(尼龍釣魚(yú)絲)。以PE套管封閉端為起始點(diǎn)，于套管 10mm， 15rran， 18mm，20mm處用記號(hào)筆作標(biāo)記，酒精浸泡消毒、生理鹽水沖洗最后 浸泡于肝素中以備用；(3) 用線栓法制備SD大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型參照Longa，Kuga線栓法 采用頸外動(dòng)脈插入套管造模，套管殘端埋于皮下；(4) 大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞成功，待大鼠清醒后給予癥狀學(xué)和行為學(xué)評(píng)分，確定腦梗死模型建立成功后于MCAO后不同時(shí)間，如3、 6、 12、 24小時(shí)二次麻醉 大鼠并暴露原手術(shù)視野，將管芯拔出，頸外動(dòng)脈以動(dòng)脈夾夾閉(以防膠原酶回 流)，將含有膠原酶的生理鹽水緩慢打入管中，根據(jù)膠原酶注入時(shí)間和量不同， 可模擬臨床上不同時(shí)間和不同出血量的出血性腦梗死。打完后將管夾閉數(shù)分 鐘；
(5) 制備再灌注模型取下動(dòng)脈夾，將管拔出，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈的再 灌注?？p合皮下組織與皮膚，常規(guī)消毒；
(6) 將經(jīng)以上步驟獲得的出血性腦梗死動(dòng)物模型放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。分 別在術(shù)后3 h、 6 h、 12 h、 24 h、 48 h不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行傳統(tǒng)的行為學(xué)評(píng) 分，包括以下評(píng)分①Longa評(píng)分法；②Berderson評(píng)分法；③肢體對(duì)稱(chēng)試 驗(yàn)評(píng)分法； 平衡木評(píng)分法。
本實(shí)施例選用健康雄性SD大鼠可建立類(lèi)似人類(lèi)的出血性腦梗死的動(dòng)物模 型，且出血量及出血時(shí)間可相對(duì)人為控制，以模擬臨床腦梗死后不同的出血 量及出血時(shí)間。
權(quán)利要求
1、一種膠原酶誘導(dǎo)法建立大鼠出血性腦梗死動(dòng)物模型的方法，其特征在于包括以下步驟(1)大鼠的準(zhǔn)備；(2)制備PE套管改良線栓；取一段PE管，用一段長(zhǎng)度和外徑小于PE管的釣魚(yú)絲插入PE管一端，將該端管口封閉并將釣魚(yú)絲固定，在接近PE管封閉端處打一個(gè)側(cè)孔，用另一段長(zhǎng)度大于PE管的釣魚(yú)絲作為管芯從上述備好的PE管未封閉端插入直至PE管封閉處，釣魚(yú)絲剩余部分留于PE管外，以PE管封閉端為起始點(diǎn)，于10mm，15mm，18mm，20mm處作標(biāo)記，酒精浸泡消毒、生理鹽水沖洗最后浸泡于肝素中以備用；(3)采用線栓法建立SD大鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞模型參照Longa、Kuga等采用頸外動(dòng)脈插入線栓法造模；(4)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞成功后，將管芯拔出，向PE套管中注入膠原酶；(5)制備再灌注模型；(6)將經(jīng)以上步驟獲得的出血性腦梗死大鼠模型放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，分別在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的膠原酶誘導(dǎo)法建立大鼠出血性腦梗死動(dòng)物模型的 方法，其特征在于大鼠選擇清潔級(jí)雄性SD大鼠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膠原酶誘導(dǎo)法建立大鼠出血性腦梗死動(dòng)物模型的方法，包括以下步驟(1)大鼠的準(zhǔn)備；(2)制備PE套管改良線栓；(3)采用線栓法建立SD大鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞模型參照Longa、Kuga等采用頸外動(dòng)脈插入線栓法造模；(4)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞成功后，將管芯拔出，向PE套管中注入膠原酶；(5)制備再灌注模型；(6)將經(jīng)以上步驟獲得的出血性腦梗死大鼠模型放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，分別在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。本發(fā)明所選大鼠為成年雄性SD大鼠，血管變異率低，提高了造模成功率。建立的動(dòng)物模型出血量及出血時(shí)間可人為控制，手術(shù)創(chuàng)傷小，不影響大鼠肢體功能且行為學(xué)評(píng)分準(zhǔn)確，具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
文檔編號(hào)A61B19/00GK101214169SQ20081005443
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日
發(fā)明者瑩 劉, 劉瑞春, 靜 尹, 張祥建, 李俐濤, 燚 楊, 楊晨輝, 范宏光 申請(qǐng)人:河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院