專利名稱：包含異黃酮-苷元、雌馬酚和露納素(lunasin)的基于發(fā)酵大豆的混合物，其制備方法及其 ...的制作方法
包含異黃酮-苷元、雌馬酚和露納素(Iunasin)的基于發(fā)酵大豆的混合物，其制備方法及其在食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用 ----------------本發(fā)明涉及一種基于已發(fā)酵大豆的混合物、所述混合物的制備方法以及所述混合物在食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用，其中，所述混合物包含異黃酮-苷元(isoflavones-aglicones)、雌馬酹和露納素。具體而言，本發(fā)明涉及一種混合物，該混合物除包含雌馬酹和 露納素(Iunasin)之外,還包含異黃酮-苷元,如大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)和黃豆黃素(glycitein),所述混合物基于已用乳酸菌發(fā)酵的大豆,所述乳酸菌分離自食物基質(zhì)；本發(fā)明還涉及所述混合物用于保護(hù)皮膚及其附件和保護(hù)人腸細(xì)胞的應(yīng)用，其中，所述保護(hù)尤其涉及防止炎性狀態(tài)和保護(hù)屏障功能，及其用于治療脫發(fā)的應(yīng)用。異黃酮是天然存在于各種植物(特別是大豆)中的雙酚類化合物(Tsangalis等，2002.Enzymatic transformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk byβ -glucosidase producing bifdobacteria(“用產(chǎn)生β -葡萄糖苷酶的雙歧桿菌對(duì)大豆乳中異黃酮植物激素進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化”).Food Res.1nt.Sc1.67:3104-3113)。大豆源異黃酮和基于大豆的食物制品屬于四種類型的化合物:苷元、丙二酰基_、乙?；?和葡萄糖苷-共輒物(Tsangalis 等，2002.Enzymatic transformation of isoflavone phytoestrogens insoymilk by β -glucosidase producing bifidobacteria.(“用產(chǎn)生 β -葡萄糖苷酶的雙歧桿菌對(duì)大豆乳中異黃酮植物激素進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化”)FoodRes.1nt.Sc1.67:3104-3113)。多于90%大豆異黃酮總濃度的大豆異黃酮以β-葡萄糖苷衍生物的形式出現(xiàn)。由于β-葡萄糖苷衍生物具有強(qiáng)疏水性特征和高分子量，其不被人體吸收。因此，為使該化合物可被生物利用繼而被代謝，必須將其水解至苷元。在通過腸道期間，腸β_葡萄糖苷酶和細(xì)菌β_葡萄糖苷酶的活力會(huì)使水解成為苷元(例如大豆苷元、染料木素和黃豆黃素)的作用發(fā)生。游離形式的所述苷元具有類似于雌激素的結(jié)構(gòu)，并在人體內(nèi)模擬雌二醇的功能(Setchell和 Cassidi, 1999.Dietary isoflavones:biological effects and relevance to humanhealth.( “食物異黃酮:生物效應(yīng)以及和人體健康的關(guān)系”)J.Nutr.131:758-767)。通常，異黃酮苷元的使用與激素病理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)(Kruzer2000.Hormon effects of soyisof lavones: studies in premenopausal and postmenopausal women ( “大丑異黃麗的激素效應(yīng):在絕經(jīng)前后的婦女中的研究”).J.Nutr.130:660-661)，也與骨質(zhì)疏松癥、更年期、癌癥和心血管病理引起的死亡的較低發(fā)生率有關(guān)(Nagata等.1998.Decreased serumtotal cholesterol concentration is associated with high intake of soy productsin Japanase men and women ( “日本男女中血清總膽固醇濃度降低與大量攝取大豆制品相關(guān)”))J.Nutr.128:209-213)。雌馬酚是一種非留體類化合物雌激素，屬于異黃酮類。對(duì)人類而言，雌馬酚的主要來源是大豆衍生物，是最富含大豆苷元和苷元型大豆苷元的代表(其直接前體)(Axelson 等，1984.Soya a dietary source of the non-steroidal oestrogenequol in man and animals ( “大豆，人和動(dòng)物的非甾體雌激素雌馬酹的膳食來源”).J.Endocrinol.102:49-56)。與其它異黃酮-苷元不同，雌馬酚是唯一具有核心手性中心的異黃酮-苷元，該手性中心由于雜環(huán)中缺乏雙鍵所致(Setchel I等，2002.Theclinical importance of the metabolite equol a clue to the effectiveness ofsoy and its isoflavones ( “代謝物雌馬酷的臨床重要性，大豆及其異黃酮有效性的線索”.Am.Soc.Nutr.Sc1.125:3577-3583)。通常，雌馬酚容易通過結(jié)腸壁吸收，但怠于代謝(Setchell等，2002.The clinical importance of the metabolite equol a clue to theeffectiveness of soy and its isof lavones ( “代謝物雌馬酌.的臨床重要性，大豆及其異黃酮有效性的線索”).Am.Soc.Nutr.Sc1.125:3577-3583)。與其大豆苷元前體相比，雌馬酚顯示出一組有趣的性質(zhì):高雌激素活性(Muthyala等，2004.Equol，a natural estrogenicmetabolita from soy isoflavones:convenient preparation and resolution of R-andS-equols and their differing binding and biological activity through estrogenreceptors alpha and beta( “雌馬酷，源自大豆異黃酮的天然雌激素代謝物:方便的制備和解析R-和S-雌馬酚，以及它們對(duì)α-和β_雌激素受體的不同結(jié)合活性和生物活性Bioorg.Med.Chem.12:1559-1567)、抗氧化劑活性(Mitchell 等，1998.Antioxidantefficacy of phytoestrogens in chemical and biological model systems (“在化學(xué)和生物模型系統(tǒng)中植物雌激素的抗氧化劑功效Arch.Biochem.Biophys.360:142-148)以及抗雄激素活性(Lund等，2004.Equol is a novel ant1-androgen that inhibits prostategrowth and hormone feedback ( “雌馬酷，一種抑制前列腺生長和激素反饋的新型抗雄激素物質(zhì)”).Bi0.Reprod.70:1188-1195)。 大豆異黃酮在人體內(nèi)的代謝有廣泛記載(Axelson等，1984.Soya a dietarysource of the non-steroidal oestrogen equol in man and animals ( “大顯，人和動(dòng)物的非留體雌激素雌馬酷的膳食來源”).J.Endocrinol.102:49-56 ；Bannwart等，1984.1dentification of o—desmethylangolensin，a metabolita of daidzein and ofmatairesinol，one likely plant precursor of the animal lignan enterolactonein human urine ( “鑒定鄰-脫甲基安哥拉紫檀素，一種大豆苷元和羅漢松脂素的代謝物，與人尿液中動(dòng)物木脂素腸內(nèi)酯類似的植物前體”).Firm.Chem.Lett.5:120-125)。在通過腸道期間，將糖苷型異黃酮代謝為苷元并將苷元代謝為雌馬酚的能力僅限于30 50%的西方國家人口(Frankefeld 等，2005.High concordance of daidzein-metabilizingphenotypes in individuals measuredl to 3 years apart ( “在 1-3 年期間檢測(cè)個(gè)體中大豆苷元代謝表型的高度一致性Brit.J.Nutr.94:873-876)?？筛鶕?jù)兩個(gè)主要策略來提高大豆衍生的異黃酮的生物利用度:在使用前富集苷元和雌馬酚，或者通過攝取適合于原位合成所述化合物的有活性的活細(xì)菌來調(diào)節(jié)腸內(nèi)微生物群(Tsangalis等，2004.Developmento fan isoflavone aglycone-enriched soymilk using soy germ, soyprotein isolate and bifidobacteria( “釆用大豆胚芽、大豆蛋白分離物和雙歧桿菌制備富含大豆異黃酮苷元的大豆乳的開發(fā)”).Food Res.1ntern.37:301-312) 0各種研究都考慮了在大豆乳的發(fā)酵過程中使用雙歧桿菌和乳酸菌來將糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元和 / 或雌馬酌■ (Chun 等，2007.Conversion of isoflavone glucoside to aglycones insoymilk by fermentation with lactic acid bacteria( “通過乳酸菌發(fā)酵在大豆乳中將異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)化為苷?！?.J.Food Sc1.72:39-44 ；Donkor 和 Shah2008.Productionof β -glucosidase and hydrolysis of isoflavone phytoestrogens by Lactobacillusacidophilus, Bifidobacterium lactis and Lactobacillus casei in soymilk( “米用嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、雙歧乳酸桿菌(Bifidobacterium lactis)和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)在大豆乳中生產(chǎn)β _葡萄糖苷酶和水解異黃酮植物雌激素”).J.Food Sc1.73:15-20 ;Pham 和 Shah2007.Biotransformation of isoflavoneglycosides by Bifidobacterium animalis in soymilk supplemented with skim milkpowder.( “釆用動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)在添加了脫脂奶粉的大豆乳中生物轉(zhuǎn)化異黃麗葡萄糖音 ”)J.Food Sc1.72:316-324 ；Tsangalis 等，2002 ; Tsangal is等，2004;Wei 等，2007.Using Lactobacillus and Bfidobacterium to product theisoflavone algycones in fermented soymilk( “米用乳桿菌和雙歧桿菌在發(fā)酵的大豆乳中產(chǎn)生異黃酮苷元”).1nt.J.Food Microbiol.117:120-124)。但是這些研究中明顯存在一定局限性:(i)已考慮的細(xì)菌生物型/種類的數(shù)量很有限；(ii)用于發(fā)酵步驟的細(xì)菌僅來源于人的糞便材料；(iii)用于發(fā)酵的底物數(shù)量很有限，其中無一考慮涉及使用生物大豆粉(soya biological flour) ； (iv)制備僅基于異黃酮/苷元或雌馬酷，并且就雌馬酌.的生產(chǎn)而言，其最大濃度是0.521mg/100ml (Tsangalis等，2002.Enzymatictransformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk byβ -glucosidaseproducing bifidobacteria ( “用產(chǎn)生β _葡萄糖苷酶的雙歧桿菌在大豆乳中酶促轉(zhuǎn)化異黃酮植物雌激素”).Food Res.1nt.Sc1.67:3104-3113) ； (v)沒有研究測(cè)試制品的生物有效性，特別是在皮膚保護(hù)方面；以及(vi)沒有研究配制出包括異黃酮-苷元、雌馬酚和露納素的制劑。露納素是一種生物活性肽(43個(gè)氨基酸殘基，分子量約為5400Da)，其在大豆中被首次鑒定(Galve 等，2001.Chemopreventive property of a soybean peptide(Iunasin) that binds to deacetylated histones and inhibits acetylation ( “結(jié)合去乙酰組蛋白并且抑制乙酰化的大豆肽(露納素，lunasin)的化學(xué)防護(hù)特性”).CancerRes.61:7473 - 7478)，并接著在大麥中(Jeong 等，2002.Barley lunasin suppressesras—induced colony formation and inhibits core histone acetylation in mammaliancells ( “大麥露納素在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制ras-誘導(dǎo)的克隆形成并且抑制核心組蛋白的乙酉先化” ).J.Agric.Food Chem.50:5903-5908)、小麥中(Jeong 等，2007.The cancerpreventive peptide lunasin from wheat inhibits core histone acetylation( ‘‘源自小麥的抗癌肽露納素抑制核心組蛋白的乙酰化Cancer Lett.255:4248)和覓屬植物中(Silva-ScSnchez 等，2008.Bioactive peptides in amaranth (Amaranthushypochondriacus) seed( “覓屬植物千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)種子中的生物活性肽^.Agric.Food Chem.56:1233-1240)也被找到。大豆中，露納素的濃度根據(jù)栽培品種、培養(yǎng)土壤氣候環(huán)境和收獲后的谷物所受的技術(shù)加工而變化。在Loda栽培品種中發(fā)現(xiàn)了非常高濃度的露納素(約llmg/g)，而在其它大豆品種中(例如，Imari品種)，露納素的含量不超過 5 6mg/g(Wang 等.2008.Analysis of soybean protein derivedpeptides and the effect of cultivar, environmental conditions, and processingof lunasin concentration in soybean and soy products ( “大豆蛋白衍生妝的分析以及栽培品種、環(huán)境條件和露納素加工對(duì)于大豆和大豆制品中露納素濃度的影響”).J.AOACIntern.91:936-944)。露納素在多肽鏈的C端含有9個(gè)天冬氨酸殘基。這種組成有利于提高對(duì)低乙?；娜旧|(zhì)區(qū)域(肽可結(jié)合于該區(qū)域)親和性，從而抑制乙酰化-脫乙酰動(dòng)力學(xué)，因而在癌發(fā)生中起到腫瘤抑制物的作用。也有報(bào)道露納素可對(duì)癌發(fā)生現(xiàn)象發(fā)揮保護(hù)活性，歸因于其對(duì)由ras基因誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制和對(duì)H3組蛋白乙?；饔玫囊种?Jeong等，2003.Characterization of lunasin isolated from soybean ( “從大豆中分離的露納素的表征”).J Agric Food Chem.51:7901-7906)。從文獻(xiàn)數(shù)據(jù)來看,很明顯,至今沒有研究考慮過在乳酸菌發(fā)酵過程中從大豆衍生物中富集露納素?；谌缟纤鶊?bào)道的考慮，某些因素似乎起到了具有顯著革新意義的作用:(i)使用基于大豆的底物，可能是生物來源；( )使用分離自食物基質(zhì)而非糞便來源的乳酸菌；
(iii)優(yōu)化適合于促成含更大量的功能性分子，如異黃酮-苷元、雌馬酚和露納素，的制劑配制的生物技術(shù)方法；(iv)通過體外和離體的分析，證實(shí)所得制劑的功效，諸如對(duì)皮膚和人腸細(xì)胞的保護(hù)效果，尤其涉及抑制炎性狀態(tài)及保持屏障功能。目前，本發(fā)明作者開發(fā)出了一種新方法，該方法適合于提供基于已發(fā)酵大豆的混合物，該混合物富集了異黃酮、苷元、雌馬酚和露納素。本發(fā)明所述的混合物通過使用特定乳酸菌混合物發(fā)酵大豆而獲得，所述乳酸菌僅來源于食物基質(zhì)，而非糞便來源。由于本發(fā)明所述的混合物富含異黃酮-苷元、雌馬酚和露納素，特別是露納素，其在皮膚和人腸細(xì)胞的保護(hù)方面具有特殊功效，其中，所述保護(hù)尤其涉及防止炎性狀態(tài)及保持屏障功能。目前，本發(fā)明作者考慮了以下事項(xiàng):(i)根據(jù)β-葡萄糖苷酶對(duì)對(duì)硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的活性，對(duì)103種僅分離自食物基質(zhì)的乳酸菌進(jìn)行篩選，選出4種乳酸菌作為混合起始物用于發(fā)酵基于大豆粉的底物，其中，所述4種乳酸菌的名稱如下:植物乳桿菌(L.plantarum)DPPMA24W(2010年7月8日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，DSM號(hào)23756)和DPPMASL33 (2010年7月8日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，DSM 號(hào) 23755)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum) DPPMAl 14 (2010 年 7 月 8 日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，DSM號(hào)23757)和鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus) DPPMAAZ1 (2010年7月8日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，DSM號(hào)23758) ；(ii)使用基于大豆的14種不同底物，選出最理想的是基于生物大豆粉，使用混合起始物發(fā)酵的制品；(iii)通過對(duì)生物大豆粉底物發(fā)酵方法的優(yōu)化得到的制劑配方包含1.45mg/100ml (57.0 μ Μ)大豆苷元、3.9mg/100ml (140.3 μ Μ)染料木素、(λ 58mg/100ml (20.4 μ Μ)黃豆黃素、0.9mg/100ml (37.3 μ M)雌馬酚，和8.4mg/100ml露納素；(iv)基于上述功能性化合物的制品顯示對(duì)皮膚表皮的保護(hù)效果、對(duì)炎性狀態(tài)的積極抑制效果和腸細(xì)胞屏障功能。如本發(fā)明所述的乳酸菌屬于乳(酸)桿菌(Lactobacillus)種，并且分離自意大利中部與南部用于面包制作的天然酵母和來自普利亞區(qū)地區(qū)的佩科里諾干酪(Pecorino)型的陳年“凝乳拉伸型干酪(pasta filata)”乳酪。分離自所述食物基質(zhì)的乳酸菌所通常顯示的代謝和環(huán)境適應(yīng)特性與在人類和動(dòng)物胃腸道寄居的微生物差異不大。選擇并使用了植物乳桿菌(L.plantarum) DPPMA24W(2010年7月8日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，DSM 號(hào) 23756)、植物乳桿菌(L.plantarum)DPPMASL33 (2010 年 7 月 8 日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，DSM號(hào)23755)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum) DPPMAl 14 (2010年7月8日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，DSM號(hào)23757)，和鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)DPPMAAZ1 (2010年7月8日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，DSM號(hào)23758)。已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化并最佳化的生物技術(shù)方法涉及:通過所述四種乳酸菌在基于不同大豆粉的底物(優(yōu)選生物來源)上，于30 37° C發(fā)酵48 96小時(shí)。在發(fā)酵過程結(jié)束時(shí)，可通過離心從培養(yǎng)肉湯移除細(xì)胞或不移除細(xì)胞，并利用干燥或冷凍干燥使上清脫水。用于發(fā)酵基于生物大豆的制品的生物技術(shù)方法描述如下。在30° C使所選4種乳酸菌的培養(yǎng)物增殖24小時(shí)，洗滌，以9.0log ufc/ml的細(xì)
胞密度用水懸浮，并接種(1 4%)大豆乳(各種大豆粉，優(yōu)選生物大豆)
權(quán)利要求
1.用于制備基于已發(fā)酵大豆的混合物的方法，所述基于已發(fā)酵大豆的混合物包含異黃酮-苷元、雌馬酚和露納素，所述方法使用下述四種乳酸菌的混合物發(fā)酵大豆:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)DSM23755、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DSM23756、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)DSM23757 和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)DSM23758。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟或由以下步驟組成: a)培養(yǎng)增殖所述四種乳酸菌:植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DSM23755、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)DSM23756、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)DSM23757 和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)DSM23758 ； b)將所述乳酸菌的水性懸液接種于基于大豆的底物； c)于30 37°C，優(yōu)選30° C，孵育48 96小時(shí)，優(yōu)選96小時(shí)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌的水性懸液以I 4%總底物體積的量接種于所述底物，且在所述水性懸液中，各菌株的細(xì)胞密度約為log9.0ufc/ml 0
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，基于大豆的底物選自大豆粉和大豆乳，優(yōu)選生物大豆粉。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括步驟d)離心肉湯培養(yǎng)物以除去乳酸菌細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述肉湯培養(yǎng)物的離心在4°C以10，000 Xg 進(jìn)行 15min。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括步驟e)通過干燥或冷凍干燥使步驟d)中所得的上清或步驟c)中所得的培養(yǎng)物脫水。
8.基于已發(fā)酵大豆的混合物，所述混合物包含異黃酮-苷元、雌馬酚和露納素，所述混合物可通過如權(quán)利要求1 4和7中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
9.藥物或化妝品組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求8所述的混合物以及一種或多種藥學(xué)上或化妝品中可接受的賦形劑和/或佐劑，或者由這些物質(zhì)組成。
10.如權(quán)利要求8所述的混合物，以所述混合物本身或聯(lián)合一種或多種賦形劑和/或佐劑用作食品補(bǔ)足劑。
11.如權(quán)利要求8所述的混合物或如權(quán)利要求9所述的組合物，其用于治療皮膚或腸壁的紊亂或疾病。
12.如權(quán)利要求8所述的混合物或如權(quán)利要求9所述的組合物，其用于化妝品應(yīng)用。
13.用于如權(quán)利要求12所述應(yīng)用的混合物，其用于治療毛發(fā)脫落。
14.如權(quán)利要求8所述的混合物或如權(quán)利要求9所述的組合物，其用于治療脫毛癥或休止期脫發(fā)。
15.以下四種乳酸菌的混合物:植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DSM23755、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)DSM23756、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)DSM23757 和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)DSM23758。
16.乳酸菌植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DSM23755。
17.乳酸菌植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DSM23756。
18.乳酸菌發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)DSM23757。
19.乳酸 菌鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)DSM23758。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種混合物，該混合物除包含雌馬酚和露納素(lunasin)之外，還包含異黃酮-苷元，例如大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)和黃豆黃素(glycitein)，所述混合物基于用乳酸菌發(fā)酵的大豆，所述乳酸菌分離自食物基質(zhì)；還涉及所述混合物用于保護(hù)人腸細(xì)胞和皮膚及其類似物的應(yīng)用，其中，所述保護(hù)尤其涉及防止炎性狀態(tài)和保護(hù)屏障功能，及其治療毛發(fā)脫落的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/352GK103140588SQ201180034458
公開日2013年6月5日 申請(qǐng)日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日
發(fā)明者G·吉利亞尼, A·本納杜斯, M·戈貝蒂, R·迪家格諾, S·巴羅尼, C·G·瑞澤羅 申請(qǐng)人:吉利亞尼股份公司