專利名稱：一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬流行性腹灣(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹灣病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus, PEDV)引起的以腹灣、嘔吐和脫水為特征的豬腸道傳染病(Bi et al.2012; Pan etal.2012; Song and Park 2012)。從 2010 年以來，豬流行性腹瀉病開始在全國流行，導(dǎo)致仔豬腹瀉，甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的損失(毛雅元2010)。目前，傳統(tǒng)的豬流行性腹瀉疫苗已經(jīng)不能完全控制疫情的傳播和發(fā)生。在此情況下，研制新型的豬流行性腹瀉疫苗非常必要。PEDV纖突(spike，S )糖蛋白攜帶主要的B淋巴細胞抗原表位，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護作用的主要結(jié)構(gòu)蛋白(Duarte and Laude 1994;Chang etal.2002)。實踐證明，腸道黏膜免疫所產(chǎn)生的分泌型抗體(slgA)是抵抗PEDV感染的有效抗體。其中，PEDV S糖蛋白中COE基因被證明是主要的抗原保護性基因(Kang et al.2005)。乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)是一種易通過黏膜吸收的常在菌，適量的乳酸菌對維持腸道菌群平衡具有積極意義。NIZO公司近年來開發(fā)了乳酸乳球菌載體表達系統(tǒng)，在該載體上表達的外源基因很容易通過黏膜吸收，另外，該載體為食品級，不含有任何抗生素基因或其他有害成分(de Ruyter et al.1997;Hernandez et al.2007;Chen etal.2011)。利用該表達系統(tǒng)研制的疫苗，不僅具有良好的免疫效果，而且具有易吸收、無副作用的特點。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)目前國內(nèi)外關(guān)于豬流行性腹瀉病毒防治研究的現(xiàn)狀和疫苗研制的最新進展，本發(fā)明提出一種采取目前NIZO公司提供的最新乳酸乳球菌表達載體PNZ8149 (含有乳糖基因)來裝載PEDV的免疫保護性抗原S(COE)基因，并轉(zhuǎn)化入缺失乳糖表達基因的乳酸乳球菌，構(gòu)建重組菌，該重組菌的篩選不需要抗生素，也不含有任何對宿主細胞有害的生物因素，屬于生物安全級的載體。然后將構(gòu)建的重組菌免疫原接種小鼠，測定其體重增長、抗體產(chǎn)生及細胞免疫應(yīng)答等情況，以衡量疫苗的免疫效果，本發(fā)明在豬流行性腹瀉病毒乳酸菌載體疫苗方面有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的技術(shù)方案如下=RT-PCR擴增獲得豬流行性腹瀉病毒(PEDV)主要保護性抗原COE基因序列，并將其克隆測序。根據(jù)測序結(jié)果和表達載體特點，設(shè)計表達引物，擴增PEDVC0E編碼序列，并將其連接至乳酸乳球菌表達載體PNZ8149，電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ3900細胞內(nèi)。重組菌以Ing/mL乳鏈菌肽(Nisin)誘導(dǎo),通過SDS-PAGE和Western blot分析，PEDV主要S蛋白獲得了表達。表達的重組菌經(jīng)不同免疫方式接種4周齡小鼠，一周后采血應(yīng)用ELISA方法檢測血清中的PEDV抗體及IFN- Y，評價PEDV乳酸菌疫苗刺激產(chǎn)生的體液免疫與細胞免疫。同時，在免疫前后測定小鼠體重，評價疫苗對小鼠生長發(fā)育的影響。結(jié)果顯示各免疫組對小鼠體重增加沒有負影響，且略有增加；免疫后，10倍稀釋口服組小鼠刺激產(chǎn)生的PEDV抗體最高，同時該組刺激產(chǎn)生的血清中IFN-Y也最高。該PEDV乳酸菌載體口服疫苗能夠刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫和一定的細胞免疫。本發(fā)明的技術(shù)方案及意義:PEDV感染具有明顯的腸道嗜性。腸道黏膜表面SlgA含量的高低直接決定疾病的發(fā)生和嚴(yán)重程度[2 7]。本發(fā)明成功地克隆了 PEDV主要保護性抗原基因C0EN，通過序列比較分析，這株P(guān)EDV主要S基因核苷酸序列同已發(fā)表的Brl/87株P(guān)EDV相應(yīng)序列同源性達到99.44%，說明該基因序列比較保守，可以作為PEDV基因工程疫苗的候選基因。Tae-Jin將PEDV Brl/87株中和抗原基因(K-COE)在煙草中表達，動物試驗證實有良好的抗原性(Kang et al.2005)。本發(fā)明針對PED免疫特點，在試驗設(shè)計上以阻斷腸道傳染性疾病病原感染的第一道防線為目的，利用安全無毒的乳酸菌表達系統(tǒng)在腸道黏膜上粘附、定植和表達及傳遞抗原物質(zhì)，因而抗原物質(zhì)對黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途徑。因此，所產(chǎn)生的黏膜免疫保護效果將更為理想。本發(fā)明成功地克隆了 PEDV的主要保護性抗原基因，構(gòu)建了 PEDV主要S蛋白乳酸乳球菌表達載體系統(tǒng)，表達了 PEDV主要S蛋白約20kDa的目的蛋白，ffester-blot試驗表明，所表達的外源蛋白能夠與PEDV免疫血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組S蛋白與PEDV天然抗原一樣具有相同的反應(yīng)原性。目前關(guān)于防治豬流行性腹瀉的疫苗還僅限于傳統(tǒng)的滅活疫苗，雖然對豬流行性腹瀉的傳播有一定的防治作用，但對于人類和動物而言，滅活疫苗中所含有的氫氧化鋁佐劑等都會對宿主細胞造成一定的損害。本發(fā)明構(gòu)建了 PEDV乳酸菌疫苗，該疫苗采用乳酸乳球菌表達載體來裝載PEDV的免疫保護性抗原S(COE)基因，并轉(zhuǎn)化入缺失乳糖表達基因的乳酸乳球菌，構(gòu)建重組菌，該重組菌的`篩選不需要抗生素，也不含有任何對宿主細胞有害的因素，屬于生物安全級的疫苗(Zamri et al.2012)。而且，乳酸菌能適應(yīng)腸道環(huán)境，是腸道內(nèi)的一種常在菌。乳酸菌易于通過腸道吸收，有利于產(chǎn)生黏膜免疫，這正好符合PEDV通過腸道感染并刺激產(chǎn)生黏膜免疫的特點(de Arriba et al.2002;Bermudez-Humaran etal.2011)。理論上推測，通過口服這種疫苗產(chǎn)生的免疫效果要好于其他途徑，因此本發(fā)明設(shè)計了口服與注射兩種途徑。為了驗證作為口服疫苗，乳酸菌在腸道內(nèi)是否越多越好，是否會影響其他菌群的平衡，進而影響動物的生長發(fā)育等問題，為此，在本發(fā)明又設(shè)計了不同稀釋倍數(shù)的乳酸菌口服免疫小鼠，從生長發(fā)育及刺激產(chǎn)生的抗體等多個方面考察該乳酸菌疫苗的免疫效果。通過測定免疫前后各組小鼠的體重，并比較各組小鼠的體重增長變化，發(fā)現(xiàn)各組間體重增長差異不顯著，對照組與2倍稀釋口服組、10倍稀釋口服組小鼠的平均體重增長一致，只是10倍稀釋注射組和100倍稀釋注射組小鼠的平均體重增略高于其他組，但組間差異不顯著。整體結(jié)果顯示，口服乳酸菌疫苗不會影響小鼠的生長發(fā)育。免疫后，經(jīng)過ELISA檢測PEDV的特異性抗體，發(fā)現(xiàn)免疫組小鼠產(chǎn)生的PEDV抗體均顯著高于對照組(P < 0.05)，而且口服組小鼠的抗體水平均高于注射組，其中10倍稀釋口服組產(chǎn)生的抗體水平最高。該結(jié)果說明，該PEDV乳酸菌載體疫苗確實能夠刺激產(chǎn)生PEDV特異性抗體，而且通過口服即黏膜吸收比注射即皮下吸收更容易產(chǎn)生高水平的抗體。因此，通過進一步證實，乳酸菌載體疫苗確實更適宜于口服免疫，而且能夠刺激產(chǎn)生體液免疫。為全面評價PEDV乳酸菌載體疫苗的免疫效果，本發(fā)明又設(shè)計了檢測PEDV乳酸菌載體疫苗細胞免疫的試驗。IFN-Y是細胞免疫后由CD8+T細胞分泌的一種細胞因子，可以抵抗或殺死被感染的靶細胞。所以，血清中IFN-Y的水平可以在一定程度上代表細胞免疫的水平。通過ELISA方法檢測了各組小鼠血清中IFN-Y的水平，發(fā)現(xiàn)10倍稀釋口服組血清中IFN-Y水平最高，其次為5倍稀釋口服組，10倍稀釋注射組，100倍稀釋注射組，對照組和2倍稀釋口服組。其中，2倍稀釋口服組刺激產(chǎn)生的IFN-Y水平最低。一方面說明，該PEDV乳酸菌載體疫苗不僅能夠刺激機體產(chǎn)生體液免疫，而且還能刺激產(chǎn)生一定的細胞免疫；另一方面說明，該細胞免疫在各處理組之間差異并不明顯，也就是說，PEDV乳酸菌能夠刺激產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，但細胞免疫不是主要的免疫方式。2倍稀釋口服組刺激產(chǎn)生的IFN-Y要低于對照組，可能的原因是免疫劑量太大，造成了一定程度的免疫耐受，反而不利于細胞的乳酸菌載體疫苗分解釋放的蛋白或多肽的吞曬作用(Adel-Patient etal.2005;Takiishi et al.2012)。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的:本發(fā)明的一方面在于:一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌的方法，其包括步驟有:①利用引物序列SEQ ID N0.f 2，對豬流行性腹瀉病毒主要保護性抗原COE基因序列進行擴增，將擴增后的產(chǎn)物，連接至pMD 18-T載體中；②以步驟①獲得的重組載體為模板，利用引物序列SEQ ID N0.3 4進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)Nco I與Sac I酶切 、凝膠回收純化后與經(jīng)相同酶切、純化后的載體pNZ8149連接；③將步驟②獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ3900細胞內(nèi)獲得陽性重組菌。對于本發(fā)明的上述技術(shù)方案中，具體較優(yōu)的條件下:所述的步驟①中，基因序列擴增條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，54°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)。對于本發(fā)明的上述技術(shù)方案中，具體較優(yōu)的條件下:所述的步驟②是指，用引物SEQ IDN0.3/4擴增含有COE的編碼區(qū)片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)Nco I與Sac I酶切、凝膠回收純化后與經(jīng)相同酶切、純化后的載體PNZ8149連接。本發(fā)明的另一方面在于:利用上述技術(shù)方案所述的方法構(gòu)建的重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌。本發(fā)明的另一方面在于:利用上述技術(shù)方案所制備的重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌表達PEDV特異性抗體的方法，其包括步驟有:將所述方法獲得的陽性重組菌，接種于L-SGM17B培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)產(chǎn)物以1: 25比例接種于L-SGM17B培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至OD6tltl達到0.4^0.6 ;用Ing/mL的乳鏈桿菌肽誘導(dǎo)2 3h。本發(fā)明的另一方面在于:利用上述技術(shù)方案所述的方法表達的PEDV特異性抗體在制備重組豬流行性腹瀉病毒疫苗藥物中的應(yīng)用。對于上文所述的技術(shù)方案，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)公知常識進行等效的替換，在任何不偏離本發(fā)明技術(shù)方案的情況下所作出的修飾、增減或等效手段的替換，則都應(yīng)包括在本發(fā)明所述范圍之內(nèi)。


圖1RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中，M:DNA Marker (DL2000) ;1:RT_PCR產(chǎn)物，約 530bp圖2重組質(zhì)粒pMD 18-T-C0E的PCR和酶切鑒定，其中，M: DNA Marker (500 15000) ; I:pMD 18-T-C0E 的 PCR 產(chǎn)物；2:pMD 18-T-C0E 經(jīng) Hind III酶切。圖3PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中，M:DNA Marker (500 15000) ;1:PCR 產(chǎn)物。圖4重組質(zhì)粒pNZ8149-C0E經(jīng)Nco I和Sac I酶切和PCR鑒定。圖5表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。圖6表達產(chǎn)物的Western bl ot分析。圖7小鼠體重增長比較。圖8ELISA 檢測 PEDV 抗體。圖9小鼠血清中IFN- Y的含量測定。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中所述方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述原料均可從商業(yè)途徑獲得。1.質(zhì)粒和菌株大腸桿菌JM109由本實驗室保存，pMD 18-T載體購自大連寶生物公司；乳酸乳球菌表面表達載體PNZ8149及乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ3900購買自荷蘭NIZO研究所。2試劑:乳鏈菌肽(Nisin)購自Sigma公司，ELISA檢測試劑盒由哈爾濱獸醫(yī)研究所馮力研究員本發(fā)明提供，小鼠IFN- Y購自凱基生物公司(江蘇，南京)，其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。3實驗動物:20日齡的Balb/c小鼠(SPF級，大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)4引物:參考PEDV/AF353511基因序列，利用引物設(shè)計軟件Oligo 6.0設(shè)計一對引物 SEQID N0.1/2，設(shè)計一對表達引物 SEQ ID N0.3/4, SEQ ID N0.3/4 分別含有Nco I 與 SacI酶切位點。引物由TaKaRa公司合成。上游引物SEQ ID N0.1:5' -GCCAACTCAAGTGTTCTCAG-3'，下游引物SEQ ID N0.2:5' -GAGTCATAAAAGAAACGTCCG-3'。上游引物SEQ ID N0.3:5' -TCACCATGGTTGCTTTTGACCTTGACGATG-3;，下游引物SEQ ID N0.4:5' -AGTGAGCTCTTAAGAAACGTCCGTGACACC-3'實施例1.
1.PEDV S基因主要保護性抗原基因COE的擴增感染PEDV病豬腸組織樣品:于吉林德惠農(nóng)家養(yǎng)豬場，以無菌方法采取病死豬腸組織獲得。將感染PEDV病豬腸組織剪碎，加2mL滅菌生理鹽水，在玻璃勻漿器中研磨，3000rpm離心5min,取上清100 μ L加入1.5mL Eppendorf管，再加入ImL Trizol提取總RNA, 200 μ L氯仿，劇烈搖勻20s，靜置2min, 4°C 12000rpm離心IOmin,取上清，加入500 μ L異丙醇，混勻，室溫靜置5min,4°C 12000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀用ImL 75%的乙醇洗漆兩次，7500rpm離心5min,棄上清,沉淀在干燥器干燥至乙醇全部揮發(fā)完，加入20 μ L無RNA酶的水溶解，即為總RNA。提取的總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV，RNase H-,寶生物工程(大連)有限公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以引物SEQ ID N0.1/2擴增包括PEDV主要保護性抗原基因在內(nèi)的531個核苷酸，反應(yīng)體系為50uL，擴增條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin, 54°C退火lmin, 72°C延伸lmin，共30個循環(huán)。取5uLPCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)獲得約530bp核苷酸片斷，大小與預(yù)期結(jié)果相符，見圖1M:DNAMarker (DL2000) ;1: RT-PCR 產(chǎn)物，約 530bp。2.PEDV S基因主要保護性抗原基因COE的克隆及鑒定用DNA 回收試劑盒 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (寶生物公司)回收目的片段，將純化后的PCR產(chǎn)物與Takara pMD 18_T vector連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，Hind III酶切和PCR篩選陽性質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒送TaKaRa公司測序。序列經(jīng)Gentyx9.0(SoftwareDevelopment c0.，Ltd)進行編輯，DNAMAN Version5.2.2 (Lynnon Biosoft)進行同源序列分析。最終獲得pMD 18-T-C0E重組質(zhì)粒。結(jié)果:對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，得到大小約530bp的目的片斷。用Hind III酶切，可得到大約 3200bp 的條帶，見圖 2，M:DNA Marker (500 15000) ; I:pMD 18-T-C0E 的 PCR產(chǎn)物；2:pMD 18-T-C0E經(jīng)Hind III酶切。將重組質(zhì)粒命名為pMD 18-T-C0E。序列測定結(jié)果如SEQ ID N0.5，利用DNAMAN對測定的核苷酸序列進行比較分析，結(jié)果核苷酸序列同PEDVBrl/87株相應(yīng)序列同源性達到99.44%。3.PEDV COE基因乳酸乳球菌表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化以獲得的pMD 18-T-C0E重組質(zhì)粒為模板，用引物SEQ ID N0.3/4擴增含有COE的編碼區(qū)片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Nco I與Sac I酶切、凝膠回收純化后與經(jīng)相同酶切、純化后的載體pNZ8149連接。將連接產(chǎn)物與電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞NZ3900混勻后，轉(zhuǎn)入2mm的預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯(Bio-Rad 公司)中，以 Transformation Apparatus 617BR1 03149 電擊。電擊參數(shù)為:電壓2kV，時間為4.5ms,電擊后加入ImL預(yù)冷的L-SGM17B恢復(fù)培養(yǎng)基(M17液體培養(yǎng)基加入0.5M蔗糖、2.5%甘氨酸、0.5%乳糖、20mmol/L氯化鎂和2mmol/L氯化鈣)，將菌液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，冰上靜置5min，30°C培養(yǎng)2h，取適量菌液涂布于Elliker培養(yǎng)基(20g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸出物、4g/L氯化鈉、1.5g/L醋酸鈉、0.5g/L抗壞血酸、15g/L瓊脂、
0.5%乳糖和0.004%溴甲酚紫)，30°C培養(yǎng)24h。挑取黃色單個菌落，接種于L-SGMl7B培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過夜后，按Anderson等(Anderson and McKay 1983)方法從乳酸乳球菌中提取質(zhì)粒PNZ8149-C0E。對重組質(zhì)粒進行酶切、PCR鑒定及序列測定分析。結(jié)果:以pMD 18-T-C0E質(zhì)粒為模板，用引物SEQ ID N0.3/4擴增得到約500bp的目的片段 COE (見圖 3，M:DNA Marker (500 15000) ;1:PCR 產(chǎn)物)。

對重組質(zhì)粒pNZ8149-C0E進行PCR鑒定，得到大小約500bp的目的片斷，進行NcoI與SacI酶切鑒定得到與預(yù)期結(jié)果相一致的約500bp插入片段(見圖4)。分析表明，PEDVCOE基因片段已插入到表達載體質(zhì)粒pNZ8149的酶切位點Nco I與Sac I之間，獲得的陽性重組菌命名為PNZ8149-C0E-NZ3900菌株。測序序列信息如SEQ ID N0.6。實施例2 PEDV COE基因在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達
將陽性重組菌及空質(zhì)粒對照菌pNZ8149/NZ3900，接種于L-SGM17B培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過夜后，取過夜培養(yǎng)物以1: 25比例接種于5mL培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至OD6c 達到
0.4^0.6。用Ing/mL的乳鏈桿菌肽(Nisin)誘導(dǎo)2 3h。終止培養(yǎng)后分別取出ImL樣品，以12000r/min離心3min,用200 μ L PBS洗漆菌體沉淀，加入100 μ L 10mg/mL的溶菌酶，37°C水浴30min,沸水浴5min滅活溶菌酶，12000r/min離心3min,棄上清,加入凝膠加樣緩沖液(含DTT)，充分混勻，煮沸101^11，120001'/1^11離心31^11，取上清101^上樣，以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量為參考，12%SDS-PAGE進行電泳分析 結(jié)果見圖5表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，對重組的pNZ8149_C0ENZ3900菌株和PNZ8149/NZ3900空質(zhì)粒菌進行誘導(dǎo)，表達產(chǎn)物分子量約20kDa，與預(yù)期的結(jié)果相符。實施例3表達產(chǎn)物鑒定1.表達產(chǎn)物的Western-blot鑒定SDS-PAGE結(jié)束后，用DYCE-40D轉(zhuǎn)印裝置，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，0.5 ImA/cm2轉(zhuǎn)印lh。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，豬源抗PEDV高免血清IgG作為第一抗體，HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG作為第二抗體，聯(lián)苯胺為底物進行蛋白印跡分析。通過Western-blot檢測表明(見圖6表達產(chǎn)物的Western blot分析)，雜交條帶與表達條帶的大小一致，約20kDa，表明重組蛋白可與PEDV血清反應(yīng)，與預(yù)期的結(jié)果相符。2.免疫接種將誘導(dǎo)后的PEDV重組乳酸菌在顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)為I X IO9個/mL，然后用滅菌的PBS做不同倍數(shù)稀釋。試驗小鼠分為6組，每組5只，分別為空白對照組，2倍稀釋口服組，5倍稀釋口服組，10倍稀釋口服組，10倍稀釋注射組和100倍稀釋注射組?？诜M每次空腹飲水免疫小鼠30mL，每只平均約6mL ；間隔I周加強免疫，共免疫3次；注射組每只小鼠每次皮下注射0.2mL,間隔一周進行加強免疫，共免疫3次。3.體重檢測各組小鼠免疫前即第五周稱量I次，免疫后第八周再稱量I次。比較各組小鼠體重增長情況。免疫前后，共進行了 2次體重測定，見圖7小鼠體重增長比較，結(jié)果顯示各組之間體重增長的差異不顯著，其中10倍稀釋注射組和100倍稀釋注射組平均體重略高于對照組和其他試驗組，但統(tǒng)計學(xué)顯示組間差異不顯著。其余對照組、2倍稀釋口服組和10倍稀釋口服組體重增長均等同于對照組。圖7、中，橫坐標(biāo)顯示為:對照組不做任何處理；2倍稀釋口服組是對菌液進行兩倍稀釋；5倍稀釋口服組是對菌液5倍稀釋；10倍稀釋口服組是對菌液10倍稀釋；10倍稀釋注射是對菌液10倍稀釋；100倍稀釋注射是對菌液100倍稀釋。4.PEDV特異性抗體檢測最后一次免疫后2周后對各組小鼠采血，分離血清，每組小鼠血清等比例混和，作為檢測樣品，然后用PEDV ELISA檢測試劑盒進行檢測，比較各組小鼠產(chǎn)生PEDV特異性抗體情況，以衡量疫苗刺激產(chǎn)生的體液免疫情況。測定時，每個樣品測定時進行3個重復(fù)。經(jīng)過連續(xù)3次免疫，然后第8周末采集各組小鼠血清進行酶聯(lián)免疫吸附實驗，在波長492nm下測定最后取得了較為理想的結(jié)果，見圖8ELISA檢測PEDV抗體，通過對結(jié)果分析，口服組的PEDV抗體明顯的高于注射組，其中10倍稀釋口服組小鼠刺激產(chǎn)生的抗體最高，其次為2倍稀釋口服組，整體來說，口服組小鼠的抗體水平均均顯著高于注射組(P< 0.05)。5.血清中IFN-Y的檢測同采血分離血清,每組小鼠血清等比例混和后,按照Mouse IFN-Y ELISA kit操作說明檢測每組小鼠血清中IFN-Y含量，以衡量乳酸菌疫苗細胞免疫的效果。每個樣品測定時進行3個重復(fù)。統(tǒng)計學(xué)分析采用單側(cè)的T檢驗，當(dāng)P〈0.05時認為差異顯著。小鼠IFN-Y測定及數(shù)據(jù)分析:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各組小鼠血清中IFN-Y的含量，見圖9小鼠血清中IFN- Y的含量測定，結(jié)果顯示5倍稀釋口服組和10倍稀釋口服組小鼠血清中IFN- Y整體水平不僅高于對照組，同時也高于注射組，與ELISA檢測PEDV特異性抗體中的結(jié)果基本一致，而2倍稀 釋口服組的抗體含量較少，并低于對照組。
序列表
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<120>一種 組豬流行性腹涔病毐乳酸乳球菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
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<210>
<211>20
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權(quán)利要求
1.一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括步驟有: ①利用引 物序列SEQID N0.廣2，對豬流行性腹瀉病毒主要保護性抗原COE基因序列進行擴增，將擴增后的產(chǎn)物，連接至PMD 18-T載體中； ②以步驟①獲得的重組載體為模板，利用引物序列SEQID N0.3 4進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)Nco I與Sac I酶切、凝膠回收純化后與經(jīng)相同酶切、純化后的載體pNZ8149連接； ③將步驟②獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ3900細胞內(nèi)獲得陽性重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的步驟①中，基因序列擴增條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，54°C退火lmin, 72°C延伸lmin,共30個循環(huán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的步驟②是指，用引物SEQ ID N0.3/4擴增含有COE的編碼區(qū)片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)NcoI與Sac I酶切、凝膠回收純化后與經(jīng)相同酶切、純化后的載體PNZ8149連接。
4.如權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建的重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌。
5.一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌表達PEDV特異性抗體的方法，其特征在于，包括步驟有:將權(quán)利要求1方法獲得的陽性重組菌，接種于L-SGM17B培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)產(chǎn)物以1: 25比例接種于L-SGM17B培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至0D600達到0.4 0.6 ;用Lng/mL的乳鏈桿菌肽誘導(dǎo)2 3h。
6.如權(quán)利要求5所述的方法表達的PEDV特異性抗體在制備重組豬流行性腹瀉病毒疫苗藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用，其制備步驟包括RT-PCR擴增獲得豬流行性腹瀉病毒(PEDV)主要保護性抗原COE基因序列，并將其克隆測序。根據(jù)測序結(jié)果和表達載體特點，設(shè)計表達引物，擴增PEDV COE編碼序列，并將其連接至乳酸乳球菌表達載體pNZ8149，電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ3900細胞內(nèi)從而獲得重組菌。將重組菌以1ng/mL乳鏈菌肽(Nisin)誘導(dǎo)，通過SDS-PAGE和Western blot分析，PEDV主要S蛋白獲得了表達。表達的重組PEDV乳酸菌載體口服疫苗能夠刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫和一定的細胞免疫，在制備豬流行性腹瀉病毒疫苗等藥物中具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K39/42GK103074291SQ20121055720
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者高鳳山 申請人:大連大學(xué)